CN101592645B - 一种可视化快速检测三聚氰胺的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学测试分析技术领域，具体涉及一种可视化检测牛奶中三聚氰胺的方法及其试剂盒。所述的方法包括试剂盒制备，样品处理和显色及比色等步骤。所述的试剂盒是根据金纳米粒子与三聚氰胺结合形成复合物而发生团聚，导致金纳米粒子粒径变大，颜色发生变化，从而反应待测样品中三聚氰胺的含量这一原理设计。本发明的试剂盒特异性强，样品处理简便，检测速度快，灵敏高，检出限低，能可视化和便于推广等突出优点。
Description
技术领域
本发明涉及化学测试分析技术领域，具体的说，涉及一种可视化检测三聚氰胺的方法及其试剂盒。
技术背景
三聚氰胺(英文名Melamine)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，简称三胺，又叫蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。学名为2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪，分子式C3N6H6或C3N3(NH2)3，分子量126.12。三聚氰胺含氮量为66％，是牛奶含氮量的4倍。
三聚氰胺是一种用途广泛的有机化工中间产物，最主要的用途是与醛缩合，作为生产三聚氰胺/甲醛树脂的原料，该树脂硬度比脲醛树脂高，不易燃，耐水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀、有良好的绝缘性能、光泽度和机械强度，广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。在部分亚洲国家，也被用来制造化肥。
然而，三聚氰胺是一种国家严禁用于宠物(和人)食品及动物饲料的化学物质，人或动物食用后诱发肾衰竭并导致死亡。2007年3月美国因宠物饲料导致猫狗死亡而大量召回被三聚氰胺污染的宠物饲料，研究人员发现，这些召回的宠物饲料在其小麦谷蛋白添加物中含有较高浓度的三聚氰胺。美国食品药品管理局(FDA)调查显示，在召回的宠物食品、死亡动物的尿液以及肾脏细胞中均发现有三聚氰胺的存在。2008年9月，甘肃、江苏等多个省市集中出现婴儿结石事件，随后调查发现患儿多有食用三鹿牌婴幼儿配方奶粉的历史，经相关部门调查，发现该公司生产的三鹿牌婴幼儿配方奶粉存在严重质量问题，随后三鹿集团发出召回，声称奶粉受到三聚氰胺的污染，并决定立即召回2008年8月6日以前生产的三鹿牌婴幼儿奶粉。随着调查检验的广泛执行，国内生产的其他品牌奶粉和部分有奶粉成分的食品中也陆续发现含有三聚氰胺。由三聚氰胺所引发的一系列事件中，特别是三鹿奶制品事件导致中国奶制品行业性的诚信危机，也给人们的日常生活造成巨大的负面影响。与此同时关于三聚氰胺的检测分析方法引起有关部门和科研工作者高度重视。国家科技部于2008年9月28日向社会公开征集液态奶中三聚氰胺快速检测技术和产品。2008年10月7日国家标准委员会发布GB/T22388-2008原料乳和乳制品中三聚氰胺检测方法，规定了液相色谱、气相色谱质谱法、液相色谱质谱法三种标准测定方法，但以上三种方法均需要大型精密仪器，复杂的样品前处理和专业操作人员。根据我国对乳制品进行批批检测的规定要求，上述方法不能满足乳制品行业检测需求，开发快速、简便的测定方法非常重要。
通过对国家知识产权局网站进行检索，目前有三聚氰胺分析检测方面的专利达18项。在这些申请的专利中，有17项专利是采用酶联免疫法(ELISA)检测三聚氰胺，如专利申请号为：CN200810046308.4，CN200810236373.3，CN200810236374.8等。只有一项专利(CN200810224380.1)采用的是化学逐步沉积法。该专利是根据待测液出现浑浊与否进行判断样品中三聚氰胺的含量。但实施该专利，样品的前处理比较复杂，并且只有在待测样品中三聚氰胺的含量超过2mg/kg(国家标准规定婴幼儿配方奶中三聚氰胺含量小于或等于1mg/kg)才出现浑浊现象，而且浑浊的程度与三聚氰胺的含量不能进行有效的定量。
发明内容
针对现有检测技术的不足，本发明的目的是提供一种可视化快速检测三聚氰胺的方法，该方法用于检测奶制品中的三聚氰胺，具有特异、高效、快速、灵敏及检出限低(最低检出限为0.2mg/kg)和能可视化等特点；且本方法操作简便易行、检测成本低，有利于实际推广和应用。
本发明通过以下技术方案实现：
一种可视化快速检测牛奶中三聚氰胺的试剂盒，包括下列试剂：
A、巯基化的胸腺嘧啶或鸟嘌呤或尿嘧啶或三聚氰酸其中一种作为修饰试剂，其浓度为1x10-5mol/L；
B、粒径为16nm金纳米粒子1x10-9mol/L，
C、6-巯基正己醇1x10-5mol/L，
D、pH＝7的磷酸缓冲溶液0.01mol/L
E、氯化钠0.01mol/L，
F、具塞玻璃管
G、三聚氰胺标准比色卡。
其中
所述的试剂盒按如下步骤制备：
取1ml浓度为1x10-9mol/L的金纳米粒子(直径为16nm)和100-200ul浓度为1x10-5mol/L的修饰试剂A放人10ml的玻璃容器中，混合均匀后静置16-20小时。接着加入5-10ul浓度为1x10-5mol/L的6-巯基正己醇，搅拌均匀后静置10-12小时。再加入50ul浓度为0.01mol/L的NaCl磷酸缓冲溶液(pH＝7)，静置40h后得到三聚氰胺可视化检测的试剂盒。
所述的标准比色卡如下步骤制备：
配制摩尔浓度分别为a)0mol/L；b)1×10-6mol/L；c)1.2×10-6mol/L；d)1.4×10-6mol/L；e)1.6×10-6mol/L；f)1.8×10-6mol/L和g)2×10-6mol/L.7个点的三聚氰胺标准溶液，用所述的三聚氰胺可视化检测的试剂盒分别与以上述7个点的三聚氰胺标准溶液进行显色，根据三聚氰胺标准溶液的显色结果制作三聚氰胺标准色块，将三聚氰胺标准色块按照三聚氰胺标准溶液浓度的高低顺序进行排列，粘贴制成三聚氰胺可视化检测的标准比色卡(见图3)。
一种可视化快速检测牛奶中三聚氰胺的方法，其步骤如下：
(1)制备试剂盒，该试剂盒含有下列试剂：
A、巯基化的胸腺嘧啶或鸟嘌呤或尿嘧啶或三聚氰酸其中一种作为修饰试剂，其浓度为1x10-5mol/L；
B、粒径为16nm金纳米粒子1x10-9mol/L，
C、6-巯基正己醇1x10-5mol/L，
D、pH＝7的磷酸缓冲溶液0.01mol/L
E、氯化钠0.01mol/L，
F、具塞玻璃管
G、三聚氰胺标准比色卡。
其中
所述的试剂盒按如下步骤制备：
取1ml浓度为1x10-9mol/L的直径为16nm的金纳米粒子和100-200ul浓度为1x10-5mol/L的修饰试剂A放人10ml的玻璃容器中，混合均匀后静置16-20小时。接着加入5-10ul浓度为1x10-5mol/L的6-巯基正己醇，搅拌均匀后静置10-12小时。再加入50ul浓度为0.01mol/L的NaClpH＝7的磷酸缓冲溶液，静置40h后得到三聚氰胺可视化检测的试剂盒；
所述的三聚氰胺标准比色卡按如下步骤制备：
配制摩尔浓度分别为a)0mol/L；b)1×10-6mol/L；c)1.2×10-6mol/L；d)1.4×10-6mol/L；e)1.6×10-6mol/L；f)1.8×10-6mol/L和g)2×10-6mol/L.7个点的三聚氰胺标准溶液，用所述的三聚氰胺可视化检测的试剂盒分别与以上述7个点的三聚氰胺标准溶液进行显色，根据三聚氰胺标准溶液的显色结果制作三聚氰胺标准色块，将三聚氰胺标准色块按照三聚氰胺标准溶液浓度的高低顺序进行排列，粘贴制成三聚氰胺可视化检测的三聚氰胺标准比色卡(见图3)；
(2)样品前处理：
液态奶处理：量取10ml液态奶加入5ml乙腈搅拌反应2min后，离心5min，取出离心后的上清液放入试剂瓶中备用；
固态奶处理：称取1mg固态奶加入10ml的蒸馏水溶解，再加入5ml乙腈搅拌反应2min后，离心5min，取出离心后的上清液放入试剂瓶中备用；
(3)三聚氰胺含量可视化检测
量取400ul上述液态奶加入到所述的试剂盒中，显色反应1min后，用所述的三聚氰胺标准比色卡进行比对，得到待测样品三聚氰胺的含量或范围。
本发明的技术原理是
三聚氰胺可视化检测的原理见图1所示，金纳米粒子B与巯基化的试剂A结合构成能与三聚氰胺特异性识别的金纳米离子(或称探针)。此金纳米探针通过氢键与三聚氰胺分子结合形成复合物。三聚氰胺的浓度不同，形成复合物的浓度也不一样。复合物浓度的高与低直接影响到金纳米粒子的团聚程度。根据在可见光条件下，溶液中金纳米粒子的团聚程度不同，表现不同的颜色这一现象(如图2)，达到可视化分析检测三聚氰胺的目的。
本发明的有益效果
本发明提供的利用三聚氰胺试剂盒可视化快速检测待测样品中三聚氰胺含量这一方法，不仅具有简单、方便、快速、可视化等特性，而且具有很低的检出限(国家标准：成人奶中三聚氰胺含量小于或等于2.5mg/kg；婴幼儿配方奶中三聚氰胺含量小于或等于1mg/kg；本发明提供的方法检出限为0.2mg/kg)。与其它检查三聚氰胺的方法相比较，本发明的方法无需贵重的精密仪器，也不需经过培训的专业技术人员，有利于推广和普及。
附图说明
图1：三聚氰胺分析检测原理图
图2：金纳米粒子不同团聚程度的颜色变化图
图3：本发明制备的三聚氰胺标准比色卡(从左到右三聚氰胺浓度分别为：0mol/L；1×10-6mol/L；1.2×10-6mol/L；1.4×10-6mol/L；1.6×10-6mol/L；1.8×10-6mol/L；2×10-6mol/L)
图4：金纳米粒子表面修饰试剂的修饰比对显色反应的影响图
图5：三聚氰胺不同加入量对显色反应的影响图
图6：实际样品可视化检测图
图7：试剂盒中金纳米粒子团聚前后的透视电镜图
具体实施方式
实施例1
(1)制备三聚氰胺试剂盒所需试剂：巯基化的胸腺嘧啶；金纳米粒子(尺寸：16nm)；6-巯基正己醇；磷酸缓冲溶液(pH＝7)；氯化钠(NaCl)。取1ml浓度为1x 10-9mol/L的金纳米粒子(粒径为16nm)和100ul浓度为1x10-5mol/L的巯基化的胸腺嘧啶T放人10ml的玻璃容器中，混合均匀后静置16小时。接着加入5ul浓度为1x10-5mol/L的6-巯基正己醇，搅拌均匀后静置10小时。再加入50ul浓度为0.01mol/L的NaCl磷酸缓冲溶液(PBS：pH＝7)，静置40h后得到三聚氰胺可视化检测的试剂盒。
(2)与本发明配套使用的三聚氰胺可视化检测的标准比色卡的制备步骤如下：配制摩尔浓度分别为a)0mol/L；b)1×10-6mol/L；c)1.2×10-6mol/L；d)1.4×10-6mol/L；e)1.6×10-6mol/L；f)1.8×10-6mol/L和g)2×10-6mol/L.7个点的三聚氰胺标准溶液，用所述的三聚氰胺可视化检测的试剂盒分别与以上述7个点的三聚氰胺标准溶液进行显色(每个点取200ul)，根据三聚氰胺标准溶液的显色结果制作标准色块，将标准色块按照三聚氰胺标准溶液浓度的高低顺序进行排列，粘贴制成三聚氰胺可视化检测的标准比色卡(如图3)。
(3)金纳米粒子表面修饰试剂的修饰比对显色反应的影响
取浓度为1x10-5mol/L的三聚氰胺200ul放入一5ml的比色管中，分别加500ul不同修饰比的金纳米粒子进行显色反应，修饰比分别设定为10％，20％，40％，60％，80％，考察金纳米粒子表面修饰试剂的修饰比(体积百分含量)对显色反应的影响(如图4)。从图4可以看出，当修饰试剂的修饰比小于或等于20％时(如图4中a和b曲线)，显色反应在10min内达到平衡；而修饰比大于20％时(如图4中c，d和e曲线)显色反应在25min以后才能达到平衡。所以选择小于或等于20％修饰比(如10％或20％)作为修饰试剂在纳米粒子表面的修饰比。
(4)三聚氰胺不同加入量对显色反应的影响
取浓度为1×10-6mol/L的三聚氰胺标准溶液0ul，1ul，2ul，3ul，4ul，5ul，6ul分别放入七5ml的比色管中，同时向每个比色管中加入500ul修饰比为20％的金纳米粒子的溶液，显色反应10min，考察三聚氰胺不同加入量对显色反应的影响。由图5可知，随着三聚氰胺量的不断增加，图中波长在520nm处的吸收峰逐渐减弱，而波长为700nm的吸收峰逐渐增强。从而说明金纳米粒子的聚集程度随着三聚氰胺量的不断增加而增大，溶液的颜色也由红色→深红色→紫色→蓝色的变化过程(如图2)。
(5)液态奶中三聚氰胺的可视化检测
量取10ml液体奶加入5ml乙腈搅拌反应2min后，离心5min，取出离心后的上清液放人一试剂瓶中备用。量取400ul上述液体奶加入到三聚氰胺可视化检测的试剂盒中，显示反应1min后，如图6c所示，与本发明提供的三聚氰胺标准比色卡进行比对，得到待测样品三聚氰胺的浓度约为1.4×10-6mol/L。
实施例2
(1)三聚氰胺试剂盒制备方法同实施例1，所需试剂：巯基化的鸟嘌呤；金纳米粒子(尺寸：16nm)；6-巯基正己醇；磷酸缓冲溶液(pH＝7)；氯化钠(NaCl)。取1ml浓度为1x10-9mol/L的金纳米粒子(粒径为16nm)和120ul浓度为1x10-5mol/L的巯基化的腺嘌呤A放人10ml的玻璃容器中，混合均匀后静置18小时。接着加入7ul浓度为1x10-5mol/L的6-巯基正己醇，搅拌均匀后静置11小时。再加入50ul浓度为0.01mol/L的NaCl磷酸缓冲溶液(pH＝7)，静置40h后得到三聚氰胺可视化检测的试剂盒。
(2)与本发明配套使用的三聚氰胺可视化检测的三聚氰胺标准比色卡的制备步骤如下：配制摩尔浓度分别为a)0mol/L；b)1×10-6mol/L；c)1.2×10-6mol/L；d)1.4×10-6mol/L；e)1.6×10-6mol/L；f)1.8×10-6mol/L和g)2×10-6mol/L.7个点的三聚氰胺标准溶液，用所述的三聚氰胺可视化检测的试剂盒分别与以上述7个点的三聚氰胺标准溶液进行显色(每个点取200ul)，根据三聚氰胺标准溶液的显色结果制作标准色块，将标准色块按照三聚氰胺标准溶液浓度的高低顺序进行排列，粘贴制成三聚氰胺可视化检测的标准比色卡。
(3)实际样品中三聚氰胺的可视化检测
称取1mg婴幼配方奶粉，加入10ml的蒸馏水搅拌溶解，加入5ml乙腈搅拌反应2min后，离心5min，取出离心后的上清液放人一试剂瓶中备用。取上述配方奶溶液400ul加入到三聚氰胺可视化检测的试剂盒中，显示反应1min后，如图6a所示，与本发明提供的三聚氰胺标准比色卡进行比对，得到待测样品三聚氰胺的浓度介于0-1×10-6mol/L之间。
实施例3
(1)三聚氰胺试剂盒制备方法同实施例1，所需试剂：巯基化的尿嘧啶；金纳米粒子(尺寸：16nm)；6-巯基正己醇；磷酸缓冲溶液(pH＝7)；氯化钠(NaCl)。取1ml浓度为1x10-9mol/L的金纳米粒子(粒径为16nm)和150ul浓度为1x10-5mol/L的巯基化的尿嘧啶U放人10ml的玻璃容器中，混合均匀后静置19小时。接着加入8ul浓度为1x10-5mol/L的6-巯基正己醇，搅拌均匀后静置12小时。再加入50ul浓度为0.01mol/L的NaCl磷酸缓冲溶液(pH＝7)，静置40h后得到三聚氰胺可视化检测的试剂盒。
(2)与本发明配套使用的三聚氰胺可视化检测的三聚氰胺标准比色卡的制备步骤如下：配制摩尔浓度分别为a)0mol/L；b)1×10-6mol/L；c)1.2×10-6mol/L；d)1.4×10-6mol/L；e)1.6×10-6mol/L；f)1.8×10-6mol/L和g)2×10-6mol/L.7个点的三聚氰胺标准溶液，用所述的三聚氰胺可视化检测的试剂盒分别与以上述7个点的三聚氰胺标准溶液进行显色(每个点取200ul)，根据三聚氰胺标准溶液的显色结果制作标准色块，将标准色块按照三聚氰胺标准溶液浓度的高低顺序进行排列，粘贴制成三聚氰胺可视化检测的标准比色卡。
(3)实际样品中三聚氰胺的可视化检测
称取1mg婴幼配方奶粉，加入10ml的蒸馏水搅拌溶解，加入5ml乙腈搅拌反应2min后，离心5min，取出离心后的上清液放人一试剂瓶中备用。取上述配方奶溶液400ul和浓度为1x10-6mol/L三聚氰胺标准溶液2ul，搅拌均匀后同时加入到三聚氰胺可视化检测的试剂盒中，显示反应1min后，如图6d所示，与本发明提供的三聚氰胺标准比色卡进行比对，得到待测样品三聚氰胺的浓度大于或等于2×10-6mol/L，检测值与加入值相符合。同时对试剂盒中金纳米粒子团聚前后进行透视电镜表征(JEM-100型透射电子显微图像，日本电子公司)，如图7所示，从图中可以清楚的看出，加入实际样品前试剂盒中金纳米粒子几乎是单分散，修饰后的单个金纳米粒子的平均粒径大约为18nm。加入实际样品后，试剂盒中金纳米粒子发生严重的团结现象，试剂盒表现出肾蓝色。
实施例4
(1)三聚氰胺试剂盒制备方法同实施例1，所需试剂：巯基化的三聚氰酸；金纳米粒子(尺寸：16nm)；6-巯基正己醇；磷酸缓冲溶液(pH＝7)；氯化钠(NaCl)。取1ml浓度为1x10-9mol/L的金纳米粒子(粒径为16nm)和200ul浓度为1x10-5mol/L的巯基化的三聚氰酸C放人10ml的玻璃容器中，混合均匀后静置20小时。接着加入10ul浓度为1x10-5mol/L的6-巯基正己醇，搅拌均匀后静置12小时。再加入50ul浓度为0.01mol/L的NaCl磷酸缓冲溶液(pH＝7)，静置40h后得到三聚氰胺可视化检测的试剂盒。
(2)与本发明配套使用的三聚氰胺可视化检测的三聚氰胺标准比色卡的制备步骤如下：配制摩尔浓度分别为a)0mol/L；b)1×10-6mol/L；c)1.2×10-6mol/L；d)1.4×10-6mol/L；e)1.6×10-6mol/L；f)1.8×10-6mol/L和g)2×10-6mol/L.7个点的三聚氰胺标准溶液，用所述的三聚氰胺可视化检测的试剂盒分别与以上述7个点的三聚氰胺标准溶液进行显色(每个点取200ul)，根据三聚氰胺标准溶液的显色结果制作标准色块，将标准色块按照三聚氰胺标准溶液浓度的高低顺序进行排列，粘贴制成三聚氰胺可视化检测的标准比色卡。
(3)实际样品中三聚氰胺的可视化检测
量取10ml液体奶加入5ml乙腈搅拌反应2min后，离心5min，取出离心后的上清液放人一试剂瓶中备用。取上述液态奶溶液400ul和浓度为1x10-6mol/L三聚氰胺标准溶液1ul，搅拌均匀后同时加入到三聚氰胺可视化检测的试剂盒中，显示反应1min后，如图6b所示，与本发明提供的三聚氰胺标准比色卡进行比对，得到待测样品三聚氰胺的浓度介于1.0×10-6和1.2×10-6mol/L之间，检测值与加入值相符合。
Claims (1)
1.一种可视化快速检测牛奶中三聚氰胺的试剂盒，其组成如下：
A、用巯基化的胸腺嘧啶或鸟嘌呤或尿嘧啶或三聚氰酸其中一种作为修饰试剂，其浓度为1x10-5mol/L；
B、粒径为16nm金纳米粒子1x10-9mol/L；
C、6-巯基正己醇1x10-5mol/L；
D、pH＝7的磷酸缓冲溶液0.01mol/L；
E、氯化钠0.01mol/L；
F、具塞玻璃管；
G、三聚氰胺标准比色卡；
其中
所述的试剂盒按如下步骤制备：
取1ml浓度为1x10-9mol/L的直径为16nm的金纳米粒子和100-200ul浓度为1x10-5mol/L的修饰试剂A放入10ml的玻璃容器中，混合均匀后静置16-20小时，接着加入5-10ul浓度为1x10-5mol/L的6-巯基正己醇，搅拌均匀后静置10-12小时，再加入50ul浓度为0.01mol/LpH＝7的NaCl磷酸缓冲溶液，静置40h后得到三聚氰胺可视化检测的试剂盒；
所述的标准比色卡如下步骤制备：
配制摩尔浓度分别为a)0 mol/L；b)1×10-6mol/L；c)1.2×10-6mol/L；d)1.4×10-6mol/L；e)1.6×10-6mol/L；f)1.8×10-6mol/L和g)2×10-6mol/L；7个点的三聚氰胺标准溶液，用所述的三聚氰胺可视化检测的试剂盒分别与以上述7个点的三聚氰胺标准溶液进行显色，根据三聚氰胺标准溶液的显色结果制作三聚氰胺标准色块，将三聚氰胺标准色块按照三聚氰胺标准溶液浓度的高低顺序进行排列，粘贴制成三聚氰胺可视化检测的标准比色卡。
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