CN102109469A - 快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒及检测方法,试剂盒包括:A、纳米金溶液:粒径为5~10nm;B、100~300g/L的三氯乙酸水溶液;C、3M NaOH水溶液;D、离心管:2mL和5mL;E、过滤器:0.22μm;F、塑料吸管;G、三聚氰胺标准比色卡;本发明的试剂盒结构简单、成本低廉,灵敏度高;本发明的检测方法对样品基质效应抗干扰能力强,简化后的前处理不仅提高了效率,缩短了检测周期,而且不需要离心机及专业的技术人员,易于实施;不凭借光谱仪等任何仪器,直接通过肉眼比色即可判断是否含有三聚氰胺及其含量范围,检测成本低,携带方便;检测时间短。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于未修饰纳米金可视化检测三聚氰胺的方法,特别涉及快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒及检测方法。
背景技术
自从2008年由三聚氰胺引发的一系列事件后,暴露了奶制品检测技术的致命缺陷,导致了我国奶制品行业的诚信危机,使我国的奶制品安全检测问题面临着巨大的挑战。
三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化工原料,常用于制造三聚氰胺甲醛树脂,是建筑业中常用的防火材料,广泛应用于塑料、装饰、涂料和造纸等行业。国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》第三卷表明:长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响,导致产生结石。
由此可见,三聚氰胺是一种禁止用于食品及动物饲料的化学物质,被国家卫生部列入可能违法添加的非食用物质的“黑名单”。但仍有不良商家非法添加到牛奶以及其它蛋白制品中,就因其含氮量较高(66%),加入食品中可产生表观蛋白质含量虚高的假象。因此,设计一种快速、简便的检测方法能现场实时检测奶制品中三聚氰胺,遏制人为添加,显得尤为重要。
目前国内外用于原料奶及奶制品中三聚氰胺检测的常用方法有美国FDA方法(GC-MS和HPLC)以及国标法(GB/T22388-2008)中的高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱/质谱法(HPLC-MS/MS),气相色谱-质谱联用法(GC-MS),这些方法虽然能够实现三聚氰胺的精确检测,但其需要精密仪器、复杂操作、检测费用高;此外还包括表面增强拉曼光谱法(SERS)、酶联免疫吸附法(ELISA)等虽然相对快速简便但其检测时间长,费用较高。而且,以上方法都需要专业技术人员进行操作并且前处理复杂。有的检测方法在大部分食品生产企业和普通消费者中难以普及。因此提高奶制品检测技术的可行性、灵敏度和特异性成为研究的重点。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足,提供一种高效、可靠、低成本的快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒。
本发明的第二个目的是提供一种用快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒检测三聚氰胺的方法。
快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒,所述试剂盒包括:
A、纳米金溶液:粒径为5~10nm;
B、100~300g/L的三氯乙酸水溶液;
C、3M NaOH水溶液;
D、离心管:2mL和5mL;
E、过滤器:0.22μm;
F、塑料吸管;
G、三聚氰胺标准比色卡;
所述纳米金溶液是用下述方法制成:量取100mL质量分数为0.01%的氯金酸水溶液于容器中,加入1~4mL质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液,于室温下磁力搅拌均匀后,加入2~4mL硼氢化钠-柠檬酸三钠混合水溶液,所述混合水溶液中硼氢化钠的质量分数为0.075%,所述柠檬酸三钠的质量分数为1%,于室温下,在转速为200~300转/分钟的条件下搅拌20-40min,得到桔红色的纳米金溶液,加入1mL质量分数为0.02%NaN3水溶液,再用0.22μm过滤器过滤后4℃避光保存;
三聚氰胺标准比色卡是用下述方法制成:
(1)配制浓度分别为240mg/L、120mg/L、60mg/L、30mg/L、15mg/L、7.5mg/L、3mg/L、1mg/L和0mg/L的三聚氰胺-牛奶溶液:
(2)取步骤(1)的各个浓度的三聚氰胺-牛奶溶液2.0mL分别放入5mL离心管中,每个离心管中加入0.1~0.4mL 100-300g/L的三氯乙酸水溶液,用手剧烈振荡混匀,静置2~3min,先用滤纸过滤到另外的离心管中,用3M NaOH水溶液调节pH值至7~8,再用0.22μm过滤器过滤,得提取液;
(3)将步骤(2)获得的提取液各取0.15mL分别加入到0.3mL纳米金溶液中,混合均匀,室温显色反应1min后用数码相机记录显色结果,采集图片后,用具有颜色梯度的图片组成标准色块,将标准色块按照三聚氰胺浓度高低进行排列并在其下方标注相应的三聚氰胺浓度,制作成卡片。
快速检测三聚氰胺的方法,包括如下步骤:
(1)准备权利要求1所述试剂盒;
(2)对被测液态奶样品或被测奶粉样品进行前处理
所述液态奶样品前处理为:取2.0mL液态奶至5mL离心管中,加入0.1~0.4mL 100~300g/L的三氯乙酸水溶液,用手剧烈振荡混匀,静置2~3min,先用滤纸过滤到另一离心管中,用3M NaOH水溶液调节pH值至7~8,再用0.22μm过滤器过滤,得提取液;
所述奶粉样品前处理为:称取0.4g奶粉至5mL离心管管中,先加入2.0mL水,溶解后加入0.2~0.6mL 100-300g/L的三氯乙酸水溶液,用手剧烈振荡混匀,静置2~3min先用滤纸过滤到另一离心管中,用3M NaOH水溶液调节pH值至7~8,再用0.22μm过滤器过滤,得提取液;
(3)样品检测:
取经样品前处理后的牛奶提取液或奶粉提取液0.15mL加入到0.3mL纳米金溶液中,在室温下反应1min,根据样品呈现的不同颜色,与三聚氰胺标准比色卡比对后确定是否含有三聚氰胺或三聚氰胺的含量。
本发明的有益效果在于:
本发明的试剂盒制备方法简单、成本低廉,制备的纳米金稳定性好,灵敏度高,无需任何标记可即可用于三聚氰胺检测;对样品基质效应抗干扰能力强,简化后的前处理不仅提高了效率,缩短了检测周期,而且不需要离心机及专业的技术人员,易于实施;三聚氰胺标准比色卡可以不凭借光谱仪等任何仪器,直接通过肉眼比色即可判断是否含有三聚氰胺及其含量范围,因此检测成本低,携带方便;本发明所提供的三聚氰胺快速检测试剂盒中的主要试剂均以工作液形式提供,独立包装,方便使用,易于保存非常适合于现场应用。本发明反应迅速,在室温条件下从样品预处理到检出结果只需12分钟,实现对原料奶中三聚氰胺进行定性和半定量检测和快速筛查的目的。利用本发明的试剂盒进行检测,具备简便、快速、灵敏、准确、低成本等优点,符合现代检测技术的要求。对于维护奶制品安全,保护人民的身体健康和消费者的合法权益,促进奶制品行业的健康快速发展均具有重要意义。
附图说明
图1为本发明试剂盒中纳米金粒子的透射电镜图。
图2为纳米金溶液加入不同浓度三聚氰胺后的颜色变化图。
图3为三聚氰胺标准比色卡,色阶所对应的三聚氰胺浓度从左到右依次为0mg/L、1mg/L、3mg/L、15mg/L、30mg/L、60mg/L、120mg/L,均为换算后的实际样品浓度。
具体实施方式
本发明的检测原理在于:
由于三聚氰胺含有多个与纳米金粒子结合的位点,能够作为一种分子交联剂,通过氢键识别作用快速诱导未修饰的纳米金粒子聚集,引起纳米金光学性质改变,表现为随着三聚氰胺浓度增大纳米金溶液颜色由酒红色向蓝紫色变化,从而显示受检样品中三聚氰胺浓度,根据这一原理发明了简单、敏感的可视化检测牛奶中三聚氰胺的方法并研发了相应的试剂盒。
本发明技术方案:本发明采用硼氢化钠法制备纳米金溶液,经透射电镜鉴定其中纳米金粒子粒径为5~10nm,条件优化后建立了一种快速目视比色检测三聚氰胺的方法并研发出试剂盒。在实样检测时,对受检样品进行简单前处理后加入纳米金溶液中,显色反应1min后即可与制备的三聚氰胺标准比色卡目视比对,得出检测结果。
以下的实施例便于更好的使本领域的技术人员理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
实施例1
快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒,是用下述方法制成:
一、纳米金溶液的制备和鉴定
(1)制备纳米金溶液使用的所有玻璃器皿都用新鲜配制的硌酸洗液浸泡24h后,再用蒸馏水彻底冲洗干净,烘干备用;
(2)量取100mL质量分数0.01%氯金酸水溶液于清洗干净的容器中,加入2mL质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液,于室温下磁力搅拌均匀后,快速加入3mL硼氢化钠-柠檬酸三钠混合水溶液,所述混合水溶液中硼氢化钠的质量分数为0.075%,所述柠檬酸三钠的质量分数为1%,于室温下在转速为300转/分钟的条件下搅拌30min后得到桔红色的纳米金溶液;
(3)在步骤(2)制备的纳米金溶液中加入1mL质量分数为0.02%NaN3水溶液,再用0.22μm滤器过滤后4℃避光保存;
(4)将制备得到的纳米金溶液用透射电镜测定,平均粒径约为5nm。(见图1)二、三聚氰胺标准比色卡的制作
(1)配制浓度分别为240mg/L、120mg/L、60mg/L、30mg/L、15mg/L、7.5mg/L、3mg/L、1mg/L和0mg/L的三聚氰胺-牛奶溶液:
(2)取步骤(1)的各个浓度的三聚氰胺-牛奶溶液2.0mL分别放入5mL离心管中,每个离心管中加入0.2mL 200g/L的三氯乙酸水溶液,用手剧烈振荡混匀,静置3min,先用滤纸过滤到另外的离心管中,用3M NaOH水溶液调节pH值至8,再用0.22μm过滤器过滤,得提取液;
(3)将步骤(2)获得的提取液各取0.15mL分别加入到0.3mL纳米金溶液中,混合均匀,室温显色反应1分钟后用数码相机记录显色结果,(见图2)采集图片后,选用具有颜色梯度的图片组成标准色块,将标准色块按照三聚氰胺浓度高低进行排列并在其下方标注相应的三聚氰胺浓度制作成卡片。(见图3)。
三、组装快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒
试剂盒包括:
A、纳米金溶液:平均粒径约为5nm;
B、100~300g/L的三氯乙酸水溶液;
C、3M NaOH水溶液;
D、离心管:2mL和5mL;
E、过滤器:0.22μm;
F、塑料吸管;
G、三聚氰胺标准比色卡。
实施例2
快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒,是用下述方法制成:
一、纳米金溶液的制备和鉴定
(1)制备纳米金溶液使用的所有玻璃器皿都用新鲜配制的硌酸洗液浸泡24h后,再用蒸馏水彻底冲洗干净,烘干备用;
(2)量取100mL质量分数0.01%氯金酸水溶液于清洗干净的容器中,加入1mL质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液,于室温下磁力搅拌均匀后,快速加入2mL硼氢化钠-柠檬酸三钠混合水溶液,所述混合水溶液中硼氢化钠的质量分数为0.075%,所述柠檬酸三钠的质量分数为1%,于室温下在转速为200转/分钟的条件下搅拌20min后得到桔红色的纳米金溶液;
(3)在步骤(2)制备的纳米金溶液中加入1mL质量分数为0.02%NaN3水溶液,再用0.22μm滤器过滤后4℃避光保存;
(4)将制备得到的纳米金溶液用透射电镜测定,平均粒径约为6nm。
二、三聚氰胺标准比色卡的制作
(1)配制浓度分别为240mg/L、120mg/L、60mg/L、30mg/L、15mg/L、7.5mg/L、3mg/L、1mg/L和0mg/L的三聚氰胺-牛奶溶液:
(2)取步骤(1)的各个浓度的三聚氰胺-牛奶溶液2.0mL分别放入5mL离心管中,每个离心管中加入0.1mL 300g/L的三氯乙酸水溶液,用手剧烈振荡混匀,静置2min,先用滤纸过滤到另外的离心管中,用3M NaOH水溶液调节pH值至7,再用0.22μm过滤器过滤,得提取液;
(3)将步骤(2)获得的提取液各取0.15mL分别加入到0.3mL纳米金溶液中,混合均匀,室温显色反应1min后用数码相机记录显色结果,采集图片后,选用具有颜色梯度的图片组成标准色块,将标准色块按照三聚氰胺浓度高低进行排列并在其下方标注相应的三聚氰胺浓度,制作成卡片。
三、组装快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒
试剂盒包括:
A、纳米金溶液:平均粒径约为5nm;
B、100~300g/L的三氯乙酸水溶液;
C、3M NaOH水溶液;
D、离心管:2mL和5mL;
E、过滤器:0.22μm;
F、塑料吸管;
G、三聚氰胺标准比色卡。
实施例3
快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒,是用下述方法制成:
一、纳米金溶液的制备和鉴定
(1)制备纳米金溶液使用的所有玻璃器皿都用新鲜配制的硌酸洗液浸泡24h后,再用蒸馏水彻底冲洗干净,烘干备用;
(2)量取100mL质量分数0.01%氯金酸水溶液于清洗干净的容器中,加入4mL质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液,于室温下磁力搅拌均匀后,快速加入4mL硼氢化钠-柠檬酸三钠混合水溶液,所述混合水溶液中硼氢化钠的质量分数为0.075%,所述柠檬酸三钠的质量分数为1%,于室温下在转速为300转/分钟的条件下搅拌40min后得到桔红色的纳米金溶液;
(3)在步骤(2)制备的纳米金溶液中加入1mL质量分数为0.02%NaN3水溶液,再用0.22μm滤器过滤后4℃避光保存;
(4)将制备得到的纳米金溶液用透射电镜测定,平均粒径约为8nm。
二、三聚氰胺标准比色卡的制作
(1)配制浓度分别为240mg/L、120mg/L、60mg/L、30mg/L、15mg/L、7.5mg/L、3mg/L、1mg/L和0mg/L的三聚氰胺-牛奶溶液:
(2)取步骤(1)的各个浓度的三聚氰胺-牛奶溶液2.0mL分别放入5mL离心管中,每个离心管中加入0.4mL 100g/L的三氯乙酸水溶液,用手剧烈振荡混匀,静置3min,先用滤纸过滤到另外的离心管中,用3M NaOH水溶液调节pH值至8,再用0.22μm过滤器过滤,得提取液;
(3)将步骤(2)获得的提取液各取0.15mL分别加入到0.3mL纳米金溶液中,混合均匀,室温显色反应1min后用数码相机记录显色结果,采集图片后,选用具有颜色梯度的图片组成标准色块,将标准色块按照三聚氰胺浓度高低进行排列并在其下方标注相应的三聚氰胺浓度,制作成卡片。
三、组装快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒
试剂盒包括:
A、纳米金溶液:平均粒径约为10nm;
B、100~300g/L的三氯乙酸水溶液;
C、3M NaOH水溶液;
D、离心管:2mL和5mL;
E、过滤器:0.22μm;
F、塑料吸管;
G、三聚氰胺标准比色卡。
实施例4
快速检测三聚氰胺的方法,包括如下步骤:
(1)准备实施例1的快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒;
(2)对被测液态奶进行样品前处理:
取2.0mL被测液态奶(含三聚氰胺浓度为10mg/L)至5mL离心管中,加入0.2mL 200g/L的三氯乙酸水溶液,用手剧烈振荡混匀,静置3min,先用滤纸过滤到另一离心管中,用3M NaOH水溶液调节pH值至8,再用0.22μm过滤器过滤,得提取液;
(3)样品检测:
取经样品前处理后的牛奶提取液0.15mL加入到0.3mL胶体金溶液中,在室温下反应1min,根据样品呈现的不同颜色,与三聚氰胺标准比色卡比对后确定三聚氰胺的含量为3~15mg/L。
实施例5
快速检测三聚氰胺的方法,包括如下步骤:
(1)准备实施例2的快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒;
(2)对被测液态奶进行样品前处理,
取2.0mL被测液态奶(某企业生产的)至5mL离心管中,加入0.1mL 300g/L的三氯乙酸水溶液,用手剧烈振荡混匀,静置2min,先用滤纸过滤到另一离心管中,用3M NaOH水溶液调节pH值至7,再用0.22μm过滤器过滤,得提取液;
(3)样品检测:
取经样品前处理后的牛奶提取液0.15mL加入到0.3mL胶体金溶液中,在室温下反应1min,根据样品呈现的不同颜色,与三聚氰胺标准比色卡比对结果为阴性。
实施例6
快速检测三聚氰胺的方法,包括如下步骤:
(1)准备实施例3的快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒;
(2)对被测液态奶进行样品前处理:
取2.0mL被测液态奶(含三聚氰胺浓度为50mg/L)至5mL离心管中,加入0.4mL 100g/L的三氯乙酸水溶液,用手剧烈振荡混匀,静置2min,先用滤纸过滤到另一离心管中,用3M NaOH水溶液调节pH值至8,再用0.22μm过滤器过滤,得提取液;
(3)样品检测:
取经样品前处理后的牛奶提取液0.15mL加入到0.3mL胶体金溶液中,在室温下反应1min,根据样品呈现的不同颜色,与三聚氰胺标准比色卡比对后确定三聚氰胺的含量为30~60mg/L。
实施例7
快速检测三聚氰胺的方法,包括如下步骤:
(1)同实施例4
(2)对被测奶粉进行样品前处理;
称取0.4g被测奶粉(含三聚氰胺浓度为10mg/kg)至5mL离心管中,先加入2.0mL水,溶解后加入0.4mL 200g/L的三氯乙酸水溶液,用手剧烈振荡混匀,静置3min先用滤纸过滤到另一离心管中,用3M NaOH水溶液调节pH值至8,再用0.22μm过滤器过滤,得提取液;
(3)样品检测:
取经样品前处理后的奶粉提取液0.15mL加入到0.3mL胶体金溶液中,在室温下反应1min,根据样品呈现的不同颜色,与三聚氰胺标准比色卡比对后确定三聚氰胺的含量为3~15mg/L。
实施例8
快速检测三聚氰胺的方法,包括如下步骤:
(1)同实施例5
对被测奶粉进行样品前处理;
(2)称取0.4g被测奶粉(含三聚氰胺浓度为50mg/kg)至5mL离心管中,先加入2.0mL水,溶解后加入0.2mL 300g/L的三氯乙酸水溶液,用手剧烈振荡混匀,静置3min先用滤纸过滤到另一离心管中,用3M NaOH水溶液调节pH值至8,再用0.22μm过滤器过滤,得提取液;
(3)样品检测:
取经样品前处理后的奶粉提取液0.15mL加入到0.3mL胶体金溶液中,在室温下反应1min,根据样品呈现的不同颜色,与三聚氰胺标准比色卡比对后确定三聚氰胺的含量为30~60mg/L。
实施例9
快速检测三聚氰胺的方法,包括如下步骤:
(1)同实施例6
(2)对被测奶粉进行样品前处理;
称取0.4g被测奶粉(某品牌奶粉)至5mL离心管中,先加入2.0mL水,溶解后加入0.6mL 100g/L的三氯乙酸水溶液,用手剧烈振荡混匀,静置2min先用滤纸过滤到另一离心管中,用3M NaOH水溶液调节pH值至7,再用0.22μm过滤器过滤,得提取液;
(3)样品检测:
取经样品前处理后的奶粉提取液0.15mL加入到0.3mL胶体金溶液中,在室温下反应1min,根据样品呈现的不同颜色,与三聚氰胺标准比色卡比对结果为阴性。
Claims (2)
1.快速目视比色检测三聚氰胺的试剂盒,其特征是所述试剂盒包括:
A、纳米金溶液:粒径为5~10nm;
B、100~300g/L的三氯乙酸水溶液;
C、3M NaOH水溶液;
D、离心管:2mL和5mL;
E、过滤器:0.22μm;
F、塑料吸管;
G、三聚氰胺标准比色卡;
所述纳米金溶液是用下述方法制成:量取100mL质量分数为0.01%的氯金酸水溶液于容器中,加入1~4mL质量分数为1%的柠檬酸三钠水溶液,于室温下磁力搅拌均匀后,加入2~4mL硼氢化钠-柠檬酸三钠混合水溶液,所述混合水溶液中硼氢化钠的质量分数为0.075%,所述柠檬酸三钠的质量分数为1%,于室温下,在转速为200~300转/分钟的条件下搅拌20-40min,得到桔红色的纳米金溶液,加入1mL质量分数为0.02%NaN3水溶液,再用0.22μm过滤器过滤后4℃避光保存;
三聚氰胺标准比色卡是用下述方法制成:
(1)配制浓度分别为240mg/L、120mg/L、60mg/L、30mg/L、15mg/L、7.5mg/L、3mg/L、1mg/L和0mg/L的三聚氰胺-牛奶溶液:
(2)取步骤(1)的各个浓度的三聚氰胺-牛奶溶液2.0mL分别放入5mL离心管中,每个离心管中加入0.1~0.4mL 100-300g/L的三氯乙酸水溶液,用手剧烈振荡混匀,静置2~3min,先用滤纸过滤到另外的离心管中,用3M NaOH水溶液调节pH值至7~8,再用0.22μm过滤器过滤,得提取液;
(3)将步骤(2)获得的提取液各取0.15mL分别加入到0.3mL纳米金溶液中,混合均匀,室温显色反应1min后用数码相机记录显色结果,采集图片后,用具有颜色梯度的图片组成标准色块,将标准色块按照三聚氰胺浓度高低进行排列并在其下方标注相应的三聚氰胺浓度,制作成卡片。
2.快速检测三聚氰胺的方法,其特征是包括如下步骤:
(1)准备权利要求1所述试剂盒;
(2)对被测液态奶样品或被测奶粉样品进行前处理
所述液态奶样品前处理为:取2.0mL液态奶至5mL离心管中,加入0.1~0.4mL 100~300g/L的三氯乙酸水溶液,用手剧烈振荡混匀,静置2~3min,先用滤纸过滤到另一离心管中,用3M NaOH水溶液调节pH值至7~8,再用0.22μm过滤器过滤,得提取液;
所述奶粉样品前处理为:称取0.4g奶粉至5mL离心管管中,先加入2.0mL水,溶解后加入0.2~0.6mL 100-300g/L的三氯乙酸水溶液,用手剧烈振荡混匀,静置2~3min先用滤纸过滤到另一离心管中,用3M NaOH水溶液调节pH值至7~8,再用0.22μm过滤器过滤,得提取液;
(3)样品检测:
取经样品前处理后的提取液0.15mL加入到0.3mL纳米金溶液中,在室温下反应1min,根据样品呈现的不同颜色,与三聚氰胺标准比色卡比对后确定是否含有三聚氰胺或三聚氰胺的含量。
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