CN103411950A - 基于表面增强拉曼活性芯片对牛奶中三聚氰胺进行检测的方法 - Google Patents
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Abstract
基于表面增强拉曼活性芯片对牛奶中三聚氰胺进行检测的方法,属于食品中添加剂检测技术领域。包括对含有三聚氰胺牛奶样品的前处理;用于检测待检测样品的具有表面增强拉曼活性基底的制备;待检测样品对具有表面增强拉曼活性基底的处理方法;通过拉曼光谱仪采集待检测样品中三聚氰胺的表面增强拉曼信号等步骤。根据三聚氰胺特殊的表面增强拉曼光谱信号完成在牛奶样品中对其的检测。本发明通过三聚氰胺的特有表面增强拉曼信号,直接将其区分于牛奶体系中的其它分子,进而判断其在牛奶中的有无和多少。该方法的检测限度符合牛奶中三聚氰胺的国家标准,可以为牛奶中三聚氰胺的检测提供一种快速灵敏的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于食品中添加剂检测技术领域,具体涉及一种基于表面增强拉曼活性芯片对牛奶中三聚氰胺分子进行检测的方法。
背景技术
三聚氰胺分子(1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺)是一种用于制造三聚氰胺树脂的原材料。近年来,不法分子将三聚氰胺分子非法添加到牛奶等蛋白质类食品中,其主要目的是为了提高产品的虚假蛋白质含量。原因是三聚氰胺分子氮元素含量高达66%,而常规检测食品中蛋白质含量的方法正是根据产品中氮元素含量来确定蛋白质的含量,如凯氏定氮法,无法将蛋白质和三聚氰胺分子区分开来。所以不法分子通过非法添加三聚氰胺的方法,达到虚假提高产品蛋白质含量的目的。三聚氰胺分子进入人体会造成很大的危害,尤其是对泌尿系统的危害最为严重。2008年某品牌的奶粉中非法掺入三聚氰胺,使得在很多食用过该品牌奶粉的儿童体内发现患有肾结石。2007年在美国,由于宠物食品中的非法掺入三聚氰胺,使得大批食用过这种宠物食品的宠物患病或者死亡。由此可见,建立一种简单、快速并且适宜于非专业人员操作的三聚氰胺检测方法是十分重要的。
对于目前检测三聚氰胺的方法可以分成两类:一类是可以达到很高的检测灵敏度,但是这一类方法必须进行复杂耗时的前处理工作,从混合体系中将三聚氰胺分子提取出来;另一类是可以应用在混合体系中完成对三聚氰胺的直接检测,但是由于混合体系中众多杂质的干扰,无法使检测限度达到国家要求的检测标准。
用于检测样品中三聚氰胺的方法主要是高压液相色谱法、液质联用和气质联用等方法。此类方法不仅操作复杂,还对操作仪器的人员素质以及仪器本身的性能要求较高。并且检测费时,运行费用较高。由于所使用仪器的限制,无法完成现场快速的检测,以及在食品生产过程中的实时监测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于表面增强拉曼活性芯片快速直接检测牛奶中三聚氰胺的方法。该种方法要具备两个特点:一是不经过分离步骤,也就是不需要任何步骤将牛奶中的三聚氰胺分子提纯出来,直接在牛奶中检测三聚氰胺分子存在与否;二是要通过其表面增强拉曼信号的强度大小来判断在牛奶中三聚氰胺分子含量的多少,并且该方法的检测限度符合牛奶中三聚氰胺检测的国家标准。
本发明设计了一种具有表面增强拉曼活性的芯片,由于三聚氰胺分子吸附到该芯片表面后具有特殊的表面增强拉曼信号,并且三聚氰胺分子在该芯片上的吸附能力远大于牛奶混合体系中其他物质的吸附能力,从而可以完成对牛奶中三聚氰胺的快速直接的检测。
本发明基于表面增强拉曼活性芯片快速直接检测牛奶中三聚氰胺的方法包括如下步骤:(a)制备一种具有表面增强拉曼活性的中空的金属纳米粒子溶胶;(b)制备表面增强拉曼活性芯片;(c)对待检测的牛奶样品进行离心处理,取上清液为待测液;(d)将待测液中的三聚氰胺分子结合到表面增强拉曼活性芯片上;(e)对上述芯片进行表面增强拉曼检测,得到牛奶样品的表面增强拉曼光谱;(f)将该表面增强拉曼光谱与“三聚氰胺浓度-拉曼光谱特征峰强度”的标准曲线进行比对,即可实现对牛奶样品中三聚氰胺的定性和定量检测。
上述方法中所述的具有表面增强拉曼活性的中空的金属纳米粒子主要包括纳米尺度的金、银等贵金属。当这一类金属材料为纳米尺度时,由于其表面局域等离子体振荡可以与拉曼测试的入射激光和经过待测分子散射后的散射光进行耦合,进而极大的增强拉曼光谱的强度。纳米粒子的大小为15nm~150nm,纳米粒子的表面包裹剂可以含有羟基和羧基等显负电性的有机基团。这类贵金属纳米粒子通常是通过化学还原法制备的。如以硼氢化钠为还原剂,以柠檬酸钠为包裹剂的还原方法。
所述步骤(b),首先是将具有微米级别平整度的玻璃片、单质硅片、二氧化硅片等基底进行表面羟基化,使基底表面带负电荷。然后用聚正电解质,如聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷这类带有氨基的正电性聚电解质对羟基化的基底表面进行修饰,使修饰后的基底表面带正电荷。最后将这种带正电荷的基底加入到步骤(a)制备的金属纳米粒子溶胶内浸泡2~5小时,取出后用去离子水洗净,氮气吹干,制备得到具有表面增强拉曼活性的芯片。
所述步骤(c),将牛奶样品进行离心处理,离心速度为6000~10000转每分钟,离心时间为10~20分钟,离心次数为2~3次,取上清液为待测液。
所述步骤(d),将步骤(b)制备的具有表面增强拉曼活性的芯片浸泡在步骤(c)得到的待测液中。浸泡时间为5~15分钟,将芯片取出后用去离子水冲净,氮气吹干。经过浸泡,待测液中的三聚氰胺分子通过配位作用吸附到芯片上的贵金属表面,吸附到芯片上的三聚氰胺分子不会被去离子水冲掉。
所述步骤(e),对结合有三聚氰胺分子的芯片进行拉曼测试,使用的拉曼光谱仪可以是共聚焦拉曼光谱仪,检测采用的激发光源的波长根据所选金属纳米粒子的材料而定。材料为金时使用波长为633纳米的激光,材料为银时使用波长为514纳米的激光。
表面增强拉曼光谱中712cm-1处的特征峰对应三聚氰胺分子中三嗪的面内变形振动模式。这一振动模式是三聚氰胺分子特有的振动模式,牛奶中的蛋白质、以及杂质都不具备此种基团。所以依据表面增强拉曼光谱特征峰712cm-1的强度可以判断牛奶体系中三聚氰胺的有无和含量多少。
为了确定未知样品中三聚氰胺的有无以及含量的多少,首先需要拟合三聚氰胺浓度与特征峰712cm-1强度的浓度-强度标准曲线(同样,需要进行上述步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的操作,只不过步骤(c)中待检测的牛奶样品中三聚氰胺分子的浓度是已知的),然后根据待测样品的表面增强拉曼光谱其特征峰712cm-1的峰强大小,来判断该待测样品中三聚氰胺的有无和含量多少。
本发明根据三聚氰胺分子的直接表面增强拉曼信号完成了在牛奶中对其的检测。在混合体系中,由于该方法是采集三聚氰胺的直接信号,不会受到牛奶中其他物质的干扰。并且该发明克服了以往繁琐的样品前处理步骤,省时,简单。另外,本发明是利用表面增强拉曼光谱技术对待测物进行检测的,该技术是一种超灵敏检测技术,使得本发明可以在混合体系中三聚氰胺含量很低的情况下将其检测出来。本发明在完成实际样品检测过程中所需的时间可以控制在1小时之内,操作简单。对牛奶中的三聚氰胺分子的检测能力可以达到1ppm,符合国家标准。可以为食品的监督检查和食品生产的实时监测提供一种新的方法。
附图说明
图1:实施例1所述的中空的球状金纳米粒子的透射电子显微镜照片(A)和实施例1所述的表面增强拉曼活性芯片的扫描电子显微镜照片(B)。
图2:实施例1所述的混有不同浓度三聚氰胺的牛奶样品在表面增强拉曼活性芯片上的表面增强拉曼光谱图(A)和纯品三聚氰胺分子在表面增强拉曼活性芯片上的表面增强拉曼光谱图(B)(给这个图的目的是为了说明在牛奶样品中检测到的那个峰跟纯品的三聚氰胺的峰一致,也就是在证明那个峰是三聚氰胺的峰)。
图3:实施例1所述的根据混有不同浓度三聚氰胺的牛奶样品在表面增强拉曼活性芯片上的表面增强拉曼光谱的峰强和三聚氰胺的浓度,绘制出的标准曲线。
图4:实施例1所述的利用表面增强拉曼活性芯片测试牛奶中三聚氰胺得到的表面增强拉曼光谱图。
具体实施方式
实施例1:
表面增强拉曼活性芯片的制备方法,以及不同浓度三聚氰胺的牛奶样品的表面增强拉曼光谱的峰强和三聚氰胺的浓度的标准曲线的绘制和对牛奶中三聚氰胺含量的快速直接的检测
1)制备具有表面增强拉曼活性的中空金纳米粒子溶胶,步骤如下:在100毫升的水中加入0.5毫升、0.1摩尔每升的柠檬酸钠水溶液和0.1毫升、0.4摩尔每升的二氯化钴水溶液,在体系中通氮气的条件下搅拌1小时。然后迅速向上述体系中加入0.15毫升新制的1摩尔每升的硼氢化钠水溶液,会观察到溶液颜色由无色变成棕色。此溶液在氮气保护的条件下再搅拌45分钟。然后向搅拌后的溶液中加入0.5毫升、0.1摩尔每升的氯金酸水溶液,该氯金酸水溶液是分10次加入的,每次加入0.05毫升。当氯金酸水溶液完全加入后将溶液在敞开体系中搅拌半小时,即制备成中空的球状金纳米粒子溶胶。中空金纳米粒子的尺寸为45±12纳米,壳层厚度为15±5纳米,如图1(A)透射电子显微镜照片所示。
2)具有表面增强拉曼活性的芯片的制备是将步骤1)制备的中空金纳米粒子溶胶中的纳米粒子经过自组装过程组装到经过表面羟基化和聚正电解质修饰过的玻璃片上。具体过程如下:1)将买来的尺寸为76×15×1毫米玻璃片浸泡在80摄氏度的70毫升浓硫酸和30毫升双氧水的混合溶液中30分钟,然后取出用去离子水冲洗干净,该步骤使得玻璃片表面带有负电性的羟基;2)将经过上步骤处理过的玻璃片浸泡在浓度为0.5%的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)水溶液中30分钟,后取出用去离子水冲洗干净,该步骤通过静电作用使得玻璃片表面组装上聚(二烯丙基二甲基氯化铵)这种正电性的聚正电解质;3)将经过聚(二烯丙基二甲基氯化铵)处理过的玻璃片浸泡在步骤1)制备的中空金纳米粒子溶胶中6小时,然后将玻璃片取出,用去离子水冲洗干净,这样便完成了表面增强拉曼活性芯片的制备,其微观形貌参照图1(B)的扫描电子显微镜照片。该自组装过程,通过静电作用使得中空金纳米球可以较均匀的吸附到玻璃片表面。由于该中空的金纳米球壳层中存在针孔形状的洞,参照图1(A),针孔处存在的很大的表面电磁场,这使得该芯片具有较高的表面增强拉曼活性。
3)在无污染的牛奶中加入不同质量的三聚氰胺分子,最终得到三聚氰胺含量为100ppm、50ppm、10ppm、1ppm的牛奶样品。分别将上述混有不同量三聚氰胺的牛奶进行离心,离心速度为8000转每分钟,离心时间为15分钟。离心后,取上清液作为待测液。将制备的具有表面增强拉曼活性的芯片分别浸泡在上述待测液中10分钟。
4)用去离子水对步骤3)处理过的具有表面增强活性的芯片冲洗干净,然后用氮气吹干,进行表面拉曼增强光谱检测。所用的拉曼光谱仪是共聚焦拉曼光谱仪,仪器型号为Jobin Yvon/HORIBA LabRam ARAMIS拉曼光谱仪,检测采用的激光波长为633纳米,得到表面增强拉曼光谱,如图2(A)。从该图中可以看出三聚氰胺分子的表面增强拉曼光谱中有一个对应三嗪的面内变形振动模式的拉曼峰——712cm-1。这一振动模式是三聚氰胺分子特有的振动模式,并且该振动模式对应的拉曼峰的强度随着体系中三聚氰胺浓度的降低而降低。在该实施例中,当牛奶中三聚氰胺的含量达到1ppm是仍然可以得到拉曼信号。
表1:三聚氰胺浓度与拉曼峰强度对应数据表
5)根据步骤4)得到的不同浓度三聚氰胺测试的712cm-1峰的强度和三聚氰胺的浓度,拟合出一条线性的标准曲线,如图3。标准曲线的方程为y=288.277+45.953x。其中y代表712cm-1峰的强度,x代表牛奶中三聚氰胺的浓度。拟合出的线性标准曲线的相关系数为0.9898。
6)在无污染的牛奶中加入一定质量的三聚氰胺分子,使得最终三聚氰胺含量为67ppm。对这一牛奶样品进行基于表面增强拉曼活性芯片对牛奶中三聚氰胺分子进行检测,得到712cm-1的强度为3265.5(参图4)(提供一下这个谱图吧)。根据步骤5)建立的标准曲线计算出牛奶样品中三聚氰胺分子的含量为64.79ppm。这一计算结果与实际三聚氰胺的含量相差3.30%。
Claims (6)
1.一种基于表面增强拉曼活性芯片快速直接检测牛奶中三聚氰胺的方法,其步骤如下:
(a)制备具有表面增强拉曼活性的中空的金属纳米粒子溶胶;
(b)制备表面增强拉曼活性芯片;
(c)对待检测的牛奶样品进行离心处理,取上清液为待测液;
(d)将待测液中的三聚氰胺分子结合到表面增强拉曼活性芯片上;
(e)对上述芯片进行表面增强拉曼检测,得到牛奶样品的表面增强拉曼光谱;
(f)将该表面增强拉曼光谱与“三聚氰胺浓度-拉曼光谱特征峰强度”的标准曲线进行比对,从而实现对牛奶样品中三聚氰胺的定性和定量检测。
2.如权利要求1中所述的一种基于表面增强拉曼活性芯片快速直接检测牛奶中三聚氰胺的方法,其特征在于:步骤(a)中的金属纳米粒子为金或银纳米粒子。
3.如权利要求1中所述的一种基于表面增强拉曼活性芯片快速直接检测牛奶中三聚氰胺的方法,其特征在于:步骤(b)首先是将具有微米级别平整度的玻璃片、单质硅片或二氧化硅片基底进行表面羟基化,使基底表面带负电荷;然后用聚正电解质对羟基化的基底表面进行修饰,使修饰后的基底表面带正电荷;最后将带正电荷的基底加入到步骤(a)制备的金属纳米粒子溶胶内浸泡2~5小时,取出后用去离子水洗净,氮气吹干,即制备得到具有表面增强拉曼活性的芯片。
4.如权利要求1中所述的一种基于表面增强拉曼活性芯片快速直接检测牛奶中三聚氰胺的方法,其特征在于:步骤(c)中的离心速度为6000~10000转每分钟,离心时间为10~20分钟,离心次数为2~3次。
5.如权利要求1中所述的一种基于表面增强拉曼活性芯片快速直接检测牛奶中三聚氰胺的方法,其特征在于:步骤(d)是将表面增强拉曼活性芯片浸泡在待测液中5~15分钟,将芯片取出后用去离子水冲净,氮气吹干,从而使待测液中的三聚氰胺分子结合到表面增强拉曼活性芯片上。
6.如权利要求1中所述的一种基于表面增强拉曼活性芯片快速直接检测牛奶中三聚氰胺的方法,其特征在于:步骤(f)中标准曲线是进行步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的操作,步骤(c)中待检测牛奶样品中三聚氰胺的浓度是已知的,从而拟合得到“三聚氰胺浓度与拉曼光谱特征峰712cm-1强度”的浓度-强度线性关系曲线。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20131127 |