CN108362678A

CN108362678A - 一种利用中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列检测三聚氰胺的方法

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Publication number: CN108362678A
Application number: CN201810060587.3A
Authority: CN
Inventors: 段兰茜; 石辰熙; 聂彬彬; 申国庆; 李亚茹; 陈孟磊; 石建平
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Anhui Normal University
Priority date: 2018-01-22
Filing date: 2018-01-22
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2038-01-22
Also published as: CN108362678B

Abstract

本发明提供了一种利用中空Ag‑Au复合结构微纳阵列检测三聚氰胺的方法。以Au/ITO为基底的中空Ag‑Au复合结构微纳阵列作为SERS基底；将SERS基底分别在不同浓度的三聚氰胺中浸泡2～3h，在共聚焦拉曼光谱仪上分别采集步其光谱信号；以三聚氰胺的浓度对数为横坐标，683cm^‑1处的光谱信号对数为纵坐标作图，得到线性曲线和线性方程；根据线性方程即可利用拉曼光谱仪测得任意光谱信号下所对应的三聚氰胺的浓度。本发明公开的方法可实现对三聚氰胺的痕量检测，检测的灵敏度较高，检测范围可低至10^‑9M。

Description

一种利用中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列检测三聚氰胺的方法

技术领域

本发明涉及一种利用中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列检测三聚氰胺的方法。

背景技术

近年来，三聚氰胺超标的食品事件时有报道，三聚氰胺被掺杂进食品中，可以提升食品检测中的蛋白质含量指标，但是三聚氰胺进入人体之后，会发生取代反应，生成三聚氰酸进而和三聚氰胺形成大的网络结构，造成结石，长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结实，并可进一步诱发膀胱癌。

表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering，SERS)由于能提供SERS活性基底上检测物的分子水平信息已广泛应用于化学和生物等领域的超灵敏检测。现有技术中，作为SERS活性基底的材料，对三聚氰胺检测时的响应信号强度较低，且可检测的下限浓度较高，很难实现对痕量三聚氰胺的检测。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列检测三聚氰胺的方法。以Au/ITO为基底的中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列作为SERS基底，可实现对三聚氰胺的痕量检测，检测的灵敏度较高，检测下限可低至10^-9M。

本发明采取的技术方案为：

一种利用中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列检测三聚氰胺的方法，包括以下步骤：

(1)制备以Au/ITO为基底的中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列作为SERS基底；

(2)将SERS基底分别在不同浓度的三聚氰胺中浸泡2～3h，以保证三聚氰胺在SERS基底上的充分吸附，然后以去离子水清洗以除去多余的三聚氰胺分子，并在空气中自然晾干；

(3)在共聚焦拉曼光谱仪上分别采集步骤(2)所得样品的光谱信号；

(4)以三聚氰胺的浓度对数为横坐标，683cm^-1处的光谱信号对数为纵坐标作图，得到线性曲线和线性方程；

(5)根据线性方程即可利用拉曼光谱仪测得任意光谱信号下所对应的三聚氰胺的浓度。

所述线性方程为LogI₆₈₃＝0.31643×LogC+5.79305，I₆₈₃为683cm^-1处的拉曼光谱信号强度，C为三聚氰胺的浓度，单位为M；线性相关系数为R²＝0.98794。

所述步骤(2)中，三聚氰胺的浓度分别为10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M。

所述步骤(3)中，采集条件为：785nm波长，功率2mW，50x显微镜将激光束聚焦在样品上形成直径2μm的光斑。采用785nm的波长可有效抑制基底产生的荧光，提高检测效果。

所述步骤(1)具体包括以下步骤：

S1：制备以Au/ITO为基底的有序PS单层胶体球模板得到PS/Au/ITO基底；

S2：通过电沉积法在步骤S1得到的PS/Au/ITO基底上制备Ag膜；

S3：将步骤S2得到的样品浸泡在二氯甲烷溶液中除去PS/Au/ITO基底上的PS，获得碗孔状结构的Ag微纳阵列；

S4：以碗孔状结构Ag微纳阵列为二次模板，与氯金酸的乙醇溶液反应，制备得到中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列。

所述步骤S1具体包括以下步骤：

S1-1：利用离子溅射镀膜仪在ITO玻璃上镀一层Au膜；

S1-2：通过气液界面自组装方法在玻璃片上获得一种厘米级大面积的周期性有序PS单层胶体球模板；

S1-3：利用悬浮法将制备好的PS单层胶体球整体转移到Au/ITO衬底上，自然晾干后，于110℃烘箱中加热5～8min，使PSs球牢固粘附在Au/ITO基底上；

S1-4：剪裁成1cm宽，2～6cm长的PS/Au/ITO基底，优选为1cm×3cm的PS/Au/ITO基底。

所述离子溅射镀膜仪的溅射电流为15～25mA，时间为60-120s，所述Au膜的厚度为5～20nm；优选为离子溅射镀膜仪的溅射电流为20mA，时间为90s，所述Au膜的厚度为10nm。金膜具有优异的导电性，利于后续步骤电沉积制备银膜，但是金膜的厚度需控制在5～20nm的范围内，不然会影响SERS增强。

所述步骤S1-2具体包括以下步骤：将直径为1000nm的聚苯乙烯小球悬浊液(2.5wt％)与乙醇1：1混合超声分散成PS球分散液备用。将玻璃片清洗后放入去离子水中5～10s后取出，水平放置后用移液枪取适量PS球分散液从玻璃片一角滴入，自然分散后得到PS单层胶体球模板。所述玻璃片的宽2cm，长10cm，厚0.2cm。

此步骤中需采用直径为1000nm的PS，这样可使得阵列结构的表面等离激元共振峰(SPR共振峰)位于SERS所用激光器的波长785nm附近，可以有效增强拉曼峰的强度；如果PS换做其他直径时，SPR共振峰会移动，远离激光波长785nm后就会严重影响拉曼峰强度，针对三聚氰胺的检测效果变差。

所述步骤S1-3具体包括以下步骤：将得到的PS单层胶体球模板放入去离子水中，PS单层胶体球将悬浮于水面，然后将制备好的Au/ITO衬底缓慢放入水中，再缓慢向上捞取，从而使得PS单层胶体球转移到Au/ITO衬底上。

所述步骤S2具体包括以下步骤：以PS/Au/ITO基底为阴极，石墨片为阳极，以AgNO₃、PVP、柠檬酸三钠组成的混合水溶液为电解液，恒定阴极电流下室温沉积8～12h。

所述电解液中，AgNO₃、PVP、柠檬酸三钠的质量浓度(g/L)之比为：(0.5～1.5)：(2.5～7.5)：(0.5～1.5)，优选为1：5：1；恒定阴极电流为2～8μA·cm^-2，优选为5μA·cm^-2。电解液中物质的浓度配比会影响Ag膜的成膜速度和膜的质量，如果浓度超出本发明公开的范围会导致Ag膜成膜的质量较差，从而影响碗状阵列的质量，无法得到中空的碗孔状阵列结构，进而影响对三聚氰胺检测的灵敏性。

所述步骤S2中，所述Ag膜的厚度为400～800nm，优选为500nm。Ag膜的厚度过薄或者过厚均不利于碗装阵列的形成。

所述步骤S3中，样品在二氯甲烷溶液中的浸泡时长为2～5分钟，浸泡后以去离子水清洗3～5次，并自然晾干。

所述步骤S4中，氯金酸的浓度为0.05～0.2mM，优选为0.1mM。浓度的大小会直接影响碗状阵列的碗孔形状，浓度小则Au纳米颗粒小，不能形成中空结构；浓度大则容易形成块体结构，无法形成碗孔阵列。

所述步骤S4中，通过控制反应时间就可以控制中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列的Ag/Au比例。

当反应时间为8h时，中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列的Ag/Au比例为1/1。

所述步骤S4后还包括以去离子水清洗样品数次，空气中晾干，最后，利用氨水除去置换反应中产生的AgCl沉淀，再次清洗晾干后获得中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列。

所述步骤(1)中，中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列为碗孔状阵列结构，呈六方密排结构排布均匀，周期1微米，碗孔直径为650～950nm，形成碗孔阵列的材料是Ag-Au混合合金，而不是Au-Ag的壳层结构。

所述周期为相邻两碗孔中心的直线距离。

与现有技术相比，本发明具备以下优点：

1.SERS基底的制备方法简单，操作简单可行；

2.中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列的结构稳定，阵列排列均匀；

3.可实现对三聚氰胺的高灵敏度检测，检测下限浓度可低至10^-9M。

附图说明

图1为Ag、Au比例为1:1的中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列对不同浓度三聚氰胺的SERS谱图；

图2为三聚氰胺的浓度对数与I₆₈₃处的拉曼光谱信号强度对数的线性关系图；

图3(a)为Ag-Au BPHAN阵列的SEM图，(b)SEM局部放大图，(c)能谱图；(d)TEM图；(e)局部结构；(f)线扫描能谱图；

图4为Ag-Au BPHAN阵列不同制备阶段的样品的XRD图谱：(a)去除PS球后的银碗孔状微纳阵列；(b)氯金酸腐蚀后获得的Ag-Au/AgCl复合结构微纳阵列；(c)去除AgCl后得到的Ag-Au BPHAN阵列；

图5为Ag-Au BPHAN阵列中Ag-Au比例随氯金酸腐蚀时间的变化图；

图6为(a)不同腐蚀时间的Ag-Au BPHAN阵列对10^-5M三聚氰胺的SERS谱图；(b)SERS信号强度随腐蚀时间变化的散点图；

图7为Au(a)、Ag(b)和Ag_0.5Au_0.5(c)三种材料碗状结构的电场强度近场分布；

图8(a)Au、Ag和Ag_0.5Au_0.5三种样品中的最强近场电场强度增强因子│E/E₀│⁴；(b)三种样品中的三聚氰胺分子分别在拉曼频移683cm^-1处峰值峰高的拉曼强度；A、B和C条状分别代表样品Au，样品Ag以及样品Ag_0.5Au_0.5；

图9为Ag-Au BPHAN的制备流程图：(a)利用气液界面自组装法在清洗后的玻璃上制备厘米级面积周期性有序PS(直径1000nm)单层胶体球模板；(b)通过转移和加热制备模板PS/Au/ITO衬底；(c)利用电化学沉积法在PS/Au/ITO衬底沉积一层Ag膜；(d)去除PS球后获得银碗孔状微纳阵列；(e)银碗阵列经氯金酸腐蚀后获得的Ag-Au/AgCl复合结构微纳阵列；(f)去除AgCl后得到的Ag-Au BPHAN阵列；

图10为比较例1得到的Ag-Au BPHAN阵列的SEM图；

图11为比较例2得到的Ag-Au BPHAN阵列的SEM图。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明进行详细说明。

实施例1

一种利用中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列检测三聚氰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备以Au/ITO为基底的Ag、Au比例为1:1的中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列作为SERS基底；

(2)将SERS基底分别在浓度为10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M的三聚氰胺中浸泡2h，然后以去离子水清洗后自然晾干；

(3)在共聚焦拉曼光谱仪上分别采集步骤(2)所得样品的光谱信号，如图1所示；采集条件为：785nm波长，功率2mW，50x显微镜将激光束聚焦在样品上形成直径2μm的光斑；

(4)以三聚氰胺的浓度对数为横坐标，683cm^-1处的光谱信号对数为纵坐标作图，得到线性曲线如图2所示和线性方程，LogI₆₈₃＝0.31643×LogC+5.79305，I₆₈₃为683cm^-1处的光谱信号强度，C为三聚氰胺的浓度，单位为M；线性相关系数为R²＝0.98794；

所述步骤(1)具体包括以下步骤：

S1-1：利用离子溅射镀膜仪在ITO玻璃上镀一层10nm厚的Au膜；溅射电流20mA，时间90s；

S1-2：通过气液界面自组装方法在玻璃片上获得一种厘米级大面积的周期性有序PS单层胶体球模板，所述PS的直径为1000nm；

S1-3：利用悬浮法将制备好的PS单层胶体球整体转移到Au/ITO衬底上，自然晾干后，于110℃烘箱中加热5分钟，使PSs球牢固粘附在Au/ITO基底上；

S1-4：剪裁成1cm×3cm的PS/Au/ITO基底。

S2：通过电沉积法在步骤S1得到的PS/Au/ITO基底上复合Ag膜；以PS/Au/ITO基底为阴极，石墨片为阳极，电解液为1g/L AgNO₃、5g/L PVP、1g/L Na₃C₆H₅O₇的混合水溶液，在5μA·cm^-2恒定阴极电流下室温沉积10h；

S3：将步骤S2得到的样品浸泡在二氯甲烷溶液中2～5分钟，除去PS/Au/ITO基底上的PS，去离子水清洗数次，空气中自然晾干，获得碗孔状结构的Ag微纳阵列；

S4：以碗孔状结构Ag微纳阵列为二次模板，与氯金酸的乙醇溶液反应，制备得到中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列；将上述碗孔状结构的银微纳阵列样品裁剪成面积1cm×1cm小块，取1片放入以乙醇为溶剂的浓度为0.1mM的氯金酸溶液中反应8h，然后以去离子水清洗数次，空气中晾干，最后，利用氨水除去置换反应中产生的AgCl沉淀，再次清洗晾干后获得Ag-Au比例为1:1的中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列(Ag-Au BPHAN阵列)。

对得到的Ag-Au BPHAN阵列进行了SEM测试，如图3所示。图3(a)为形貌图可以清晰看出该样品为碗孔状阵列结构，排布均匀，周期1微米，碗孔直径约为970nm。图3(b)是样品的SEM局部放大图，可以看到碗壁是由纳米颗粒组成的。从图3(c)的能谱图可以看出，样品中Ag/Au比例接近1:1。

为验证纳米颗粒是中空的，对碗壁处纳米颗粒进行了透射电镜扫描，如图3(d)(e)(f)所示。图3(d)为TEM图，(e)为局部扫描图，(f)为对应(e)中横线处的线扫描图。从图3(e)显示的Ag/Au比例与图3(c)中基本相同，进一步说明结构中Ag、Au分布较为均匀。从图3(f)中可以看出，纳米颗粒的确为中空结构，并且这种中空结构的壳是由Ag-Au合金构成，而不是一层Au一层Ag这样的壳层结构。由此可见，本发明成功的制备出了由中空Ag-Au合金颗粒组成的均匀碗孔状微纳结构阵列。

利用CuKa辐射(＝0.15419nm)的飞利浦X pert X射线衍射仪来分析样品中物质成分。利用场发射扫描电子显微镜(FESEM、Srion200)和高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)来表征制备得到的微纳阵列的形貌和结构特征。

图4给出了三个不同制备阶段样品的XRD图谱。图4(a)是电沉积银膜后去除PS球的样品XRD图谱，图中峰位38.18°、44.38°、64.57°、77.56°、81.71°恰好分别对应Ag的(1 11)、(2 0 0)、(2 2 0)、(3 1 1)、(2 2 2)晶面(JCPDS File No:04-0783)，表明获得了银微纳结构。

图4(b)是银碗置于氯金酸中腐蚀8h后样品的XRD图谱，其中峰位38.27°、44.49°、64.73°、77.76°、81.93°则分别对应Ag-Au的(1 1 1)、(2 0 0)、(2 2 0)、(31 1)、(2 2 2)晶面(JCPDS file:65-2871)，峰位27.83°、32.24°、46.23°、54.83°、57.48°、67.47°、74.47°、76.74°、85.71°分别对应AgCl的(1 1 1)、(2 0 0)、(2 2 0)、(3 1 1)、(2 2 2)、(4 0 0)、(33 1)、(4 2 0)、(4 2 2)晶面(JCPDS File No:131-1238)。说明腐蚀过程中除了Ag-Au间的电置换反应还有AgCl生成。

图4(c)是去除AgCl后样品的XRD图谱。对比图4(b)，明显可以看出图中AgCl对应的衍射峰全部消失，仅Ag-Au合金对应衍射峰。这说明此过程中的AgCl已完全除去，制备出Ag-Au复合结构。

实施例2

其他同实施例1，只是将步骤S4替换为取7片放入以乙醇为溶剂的浓度为0.1mM的氯金酸溶液中，每隔两小时取出一片样品，去离子水清洗数次，空气中晾干。最后，利用氨水除去置换反应中产生的AgCl沉淀，再次清洗晾干后获得一系列Ag-Au比例不同的中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列(Ag-Au BPHAN阵列)。

随着反应时间的不同所获得的中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列中的Ag-Au比例如表1和图5所示。

表1中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列中Ag-Au比例和拉曼强度随反应时间的变化

反应时间(h)	0	2	4	6	8	10	12	24
									x(Ag^xAu^1-x)	1.00	0.82	0.63	0.57	0.51	0.28	0.1	0.05
I₆₈₃(a.u.)	3514	4306	5075	10190	16665	6866	5685	2944

从图5和表1可以看出，样品中的Ag/Au比例是可以调节的，通过控制不同的氯金酸腐蚀时间就可以得到不同Ag/Au比例的阵列样品，腐蚀没有开始的时候，Ag的比例为100％。随着腐蚀时间增加，Ag原子被氧化Au原子被还原，从而Ag的比例逐渐减少Au比例不断增加。在腐蚀过程中，氯金酸的体积是足量的，因此整个过程中氯金酸的浓度几乎不会变化。在0-4h腐蚀时间，置换出的Au原子会逐渐覆盖在Ag结构表面，此时Ag结构与氯金酸充分接触，Ag-Au置换反应速率快。在4-8h时，由于Ag结构基本被Au原子层覆盖，氯金酸不能充分接触，Ag-Au置换反应速率减慢。同时，在置换过程中，每还原出一个Au原子需要消耗3个Ag原子，由于表面Au层的存在，内部Ag的消耗会逐渐形成中空Ag-Au复合结构。在此过程中，Ag原子被氧化成Ag离子从Au层孔隙溢出，致使Au层孔隙逐渐变大。在8-12h时，中空Ag-Au复合结构表面Au层孔隙的扩大，Ag原子与氯金酸充分接触，Ag-Au置换速率加快，Ag原子被快速氧化，结构内部空隙逐渐变大，余下Ag-Au合金空壳。在腐蚀时间8h时，对应的是AgAu比例为1:1；在12h后，结构中Ag已经很少且有Au层的保护而不会与氯金酸接触，置换反应很难继续进行，因此Ag-Au比例基本维持不变。

以相同的条件测试腐蚀时间不同的BPHAN阵列(即不同Ag-Au比例)对同一三聚氰胺样品的SERS光谱信号，如图6(a)所示。从图中可以看出：在683cm^-1处有一个显著的SERS峰，这个峰对应的是三聚氰胺中三嗪环的面内振动模式，而三嗪环为三聚氰胺所特有，在其他其他蛋白质或氨基酸中还没有观测到，该峰即为三聚氰胺分子的拉曼特征峰。同时也注意到，SERS特征峰的强度与腐蚀时间有关，开始时随腐蚀时间增加拉曼信号逐渐增强，在腐蚀时间8h时达到最大，之后开始下降。这主要是由于BPHAN阵列中的金银比例变化引起的。腐蚀开始时，阵列结构全是Ag材料，腐蚀结束时几乎全部被置换成Au材料，在腐蚀时间8h时，对应的是AgAu比例为1:1的情况。具体腐蚀时间、Ag-Au比例和对应的拉曼峰强度数据列于表1中。由数据可以看出，Ag-Au比1:1时该基底具有最大的拉曼活性，信号强度比单纯的Ag或者Au基底大5倍左右。

实施例3

为了清楚的理解中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列的SERS增强的物理机制，本发明分析了3种碗孔状结构阵列的局域电场特性。参数设置：碗口最大直径为976nm，周期为1000nm，呈六方密排结构，参数来源于图3中SEM图的观察结果；三种碗状结构采用三种不同材料，分别为金、银、以及Ag_0.5Au_0.5合金，其中Ag-Au合金材料的介电常数利用等效介电常数来获得。电场偏振方向沿x轴的光源垂直表面入射，光源波长为拉曼光谱的泵浦光785nm。

图7分别是Au、Ag、以及Ag_0.5Au_0.5做成的碗状结构的电场强度近场分布图。其中复合材料中设置有直径40nm的空径，用于模拟Ag-Au中空结构。从图中可以看出，三种材料的碗状结构电场形貌分布几乎一致，在碗中间区域有两个峰值，这是由于入射光和反射光干涉而成。同时也注意到在碗壁上的一些区域电场有极大值，是由于基底与材料之间的表面等离激元共振引起的。这些局域电场的增强正是该结构实现SERS增强的机制，因为SERS增强的效果与局域电场的强度平方成正比。从图中可以看出三种结构分别对应的场强极大值为11,13和28.5.

对比场强的极大值可以发现，复合中空结构是Ag的2.19倍，是Au的2.59倍。SERS信号增强分别应该是4.79和6.71倍。而实验结果图6中显示三种结构对应的信号强度分别为(Au)2944a.u.、(Ag)3515a.u.和(Ag-Au)16665a.u.。为了更直观的展示，分别做出了三种碗状结构的最强近场电场强度增强因子(最强近场电场强度的4次方，│E/E₀│⁴)的柱状图见图8(a)；和三种样品中的三聚氰胺分子的拉曼光谱在拉曼频移683cm^-1处峰值峰高的拉曼强度的柱状图见图8(b)。

通过对比可以发现，每个样品的拉曼强度与本发明的仿真结构的结果相类似，电场强度增强因子的柱状图明显与拉曼频移为683cm^-1处峰值峰高的拉曼强度的柱状图，其走势一致。综上所述，仿真结果与实验结果是吻合的。由此可见，适当Ag-Au比例的Ag-AuBPHAN阵列的确具有很好SERS性能，灵敏度和峰值响应强度都比现有结构好很多。

比较例1

其他同实施例1，只是将步骤S2中的电解液替换为1g/L AgNO₃与1g/L柠檬酸三钠组成的混合水溶液，在5μA·cm^-2恒定阴极电流下室温沉积8h，得到的产物的SEM图如图10所示，从图中可以看出，得到的产物并不是中空的碗孔状结构。

比较例2

其他同实施例1，只是将步骤S2中的电解液替换为1g/L AgNO₃、10g/L PVP与1g/L柠檬酸三钠组成的混合水溶液，在5μA·cm^-2恒定阴极电流下室温沉积8h，得到的产物的SEM图如图11所示，从图中可以看出，得到的产物并不是中空的碗孔状结构。

上述参照实施例对一种利用中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列检测三聚氰胺的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种利用中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列检测三聚氰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备以Au/ITO为基底的中空Ag-Au复合结构微纳阵列作为SERS基底；

(2)将SERS基底分别在不同浓度的三聚氰胺中浸泡2～3h，然后以去离子水清洗后自然晾干；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述线性方程为LogI₆₈₃＝0.31643×LogC+5.79305，I₆₈₃为683cm^-1处的拉曼光谱信号强度，C为三聚氰胺的浓度，单位为M；线性相关系数为R²＝0.98794。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，三聚氰胺的浓度分别为10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，采集条件为：785nm波长，功率2mW，50x显微镜将激光束聚焦在样品上形成直径2μm的光斑。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括以下步骤：

S2：通过电沉积法在步骤S1得到的PS/Au/ITO基底上复合Ag膜；

S4：以碗孔状结构Ag微纳阵列为二次模板，与氯金酸的乙醇溶液反应，制备得到中空Ag-Au复合结构微纳阵列。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤S2具体包括以下步骤：以PS/Au/ITO基底为阴极，石墨片为阳极，以AgNO₃、PVP、柠檬酸三钠组成的混合水溶液为电解液，恒定阴极电流下室温沉积8～12h。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述电解液中，AgNO₃、PVP、柠檬酸三钠的质量浓度(g/L)之比为：(0.5～1.5)：(2.5～7.5)：(0.5～1.5)；恒定阴极电流为2～8μA·cm^-2，所述Ag膜的厚度为400～800nm。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中，氯金酸的浓度为0.05～0.2mM。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中，通过控制反应时间就可以控制中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列的Ag/Au比例，当反应时间为8h时，中空Ag-Au复合结构微纳阵列的Ag/Au比例为1/1。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述中空Ag-Au合金复合结构微纳阵列为碗孔状阵列结构，呈六方密排结构排布均匀，周期1微米，碗孔直径为650～950nm；形成碗孔阵列的材料是Ag-Au混合合金。