CN111024942B - 一种免疫层析试纸条的高灵敏检测方法 - Google Patents

一种免疫层析试纸条的高灵敏检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种免疫层析试纸条的高灵敏检测方法，将金属纳米粒子与抗体混合连接后，与待测细菌混合进行特异性捕捉，随后滴加到免疫层析试纸条上与其检测线处的抗体再次捕捉，实现待测细菌的稳定沉积，利用等离子体发射光谱检测系统检测免疫层析试纸条检测线处金属纳米粒子的浓度，进而得到待测细菌的浓度。本发明所提供的方法通过结合等离子体发射光谱技术，有效避免了视觉比色的误差并实现定量化检测，检测限提高了约4个数量级；且无需辅助试剂添加和复杂前处理流程，检测速度快，灵敏度高；本发明将传统的免疫试纸条与等离子体光谱技术相结合，提高了免疫层析试纸条的灵敏度，拓宽了光谱学的应用。

Description

一种免疫层析试纸条的高灵敏检测方法
技术领域
本发明涉及食品安全免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种免疫层析试纸条的高灵敏检测方法。
背景技术
免疫试纸条技术是一种新型的免疫层析技术，对致病菌、重金属污染、食品污染物和非法添加剂等进行检测，通过可视化比色可用于间接定性或半定量的检测。免疫试纸条技术操作简便、快速，检测特异性强、灵敏度高，无需特殊仪器设备，对检测人员要求较低，适合于临床医学、实验室、现场快速诊断及家庭的自我检测，已被广泛的应用于对微生物、农药残留、重金属等类别的食品、药品、化工、生物、临床医学诸多领域的检测，具有良好的发展前景。
为了满足食品安全、环境监测和疾病诊断等对检测方法速度和灵敏度的需求，研究工作者构建了大量免疫传感器，如微流控免疫传感器、磁免疫传感器，胶体金免疫分析等。其中，微流控免疫传感器与磁免疫传感器具有较高的灵敏度，然而，由于样品处理和试剂反应等过程复杂，检测周期长，该类传感器在现场检测方面的应用较少。
近年来，基于胶体金免疫层析试纸条构建了大量快速检测方法。传统的胶体金试纸条检测法基于条带的可视化进行目标物的检测，通过试纸条检测线的条带颜色深浅反应待测物浓度，操作简单、快速，检测特异性强，但由于人眼分辨误差大，该免疫试纸条对目标物的检测灵敏度较低，对于细菌的检测限为105-106CFU/mL。与相关国家标准对照，传统的胶体金试纸条检测法已无法满足细菌总数的限值为50CFU/mL的要求。
申请号为201510817001.X的中国发明专利申请提出了一种以金黄色葡萄球菌适配体修饰磁纳米颗粒表面，该材料可以快速识别并捕获待测样品中的金黄色葡萄球菌，将捕捉到的金黄色葡萄球菌与另外一条荧光标记的适配体进行结合，实现夹心结构的荧光标记；将夹心结构复合体注射入毛细管中，利用磁场进行富集；撤掉磁场，以恒定流速推进复合体通过激光诱导荧光检测池得到一定的荧光峰面积，得出金黄色葡萄球菌浓度与荧光峰面积的线性关系，计算出激光诱导荧光检测金黄色葡萄球菌的检测下限为3CFU/mL。该方法有灵敏度高、操作简单和检测限低，但是存在的问题是荧光分子材料容易脱落、信号不稳定，在复杂基质中易出现失活或荧光猝灭。
申请号为201610031644.6的中国发明专利申请提出了将Fe3O4/Ru(bqy)3 2+纳米微球富集金黄色葡萄球菌，然后制备试纸条并上样检测的方法。该方法免去了将金黄色葡萄球菌从免疫磁珠中洗脱下来的步骤，提高了捕获效率，减少了工作量和杂菌污染概率。检测方案稳定性好，对金黄色葡萄球菌的检测为103CFU/mL，另外需额外有机试剂和操作流程参与，并且检测限仍达不到国家检测的标准。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种免疫层析试纸条的高灵敏检测方法。
本发明采用如下技术方案：
一种免疫层析试纸条的高灵敏检测方法，其特征在于，将金属纳米粒子与抗体混合连接后，与待测细菌混合进行特异性捕捉，随后滴加到免疫层析试纸条上与其检测线处的抗体再次捕捉，实现待测细菌的稳定沉积，利用等离子体发射光谱检测系统检测免疫层析试纸条检测线处金属纳米粒子的浓度，进而得到待测细菌的浓度。
具体地，上述高灵敏检测方法通过双抗夹心法实现对目标物的捕获，应用不同的抗体能够实现不同细菌及其他目标物的快速富集和检测，具有广泛的适用性。
在上述技术方案中，所述等离子体发射光谱检测系统包括激光器、光谱仪和3D样品台，所述激光器为Nd：YAG调Q激光器，其脉冲能量在10-280mJ范围内可调。
详细地，上述等离子体发射光谱检测系统所用Nd:YAG调Q激光器波长为1064nm；所用光谱仪的光谱范围为200-1100nm；所用3D样品台用于调节样品的位置，检测过程中，激光器发射的激光经透镜聚焦在样品表面，当激光脉冲的能量密度大于击穿门槛能量时，就会在局部产生等离子体，等离子体随着向外界环境膨胀过程而逐渐冷却，并发射表征样品组分信息的光谱，并用光谱仪对等离子体发射光谱进行采集；通过分析等离子体光谱，结合定量分析模型，可以得到分析样品组分的类别和含量信息。
具体地，该等离子体发射光谱检测系统的检测原理如下：
Nd：YAG激光器发射出脉冲激光，经过聚焦透镜聚焦在免疫层析试纸条的检测线上，试纸条表面吸收高功率的激光后，在试纸条表面附近瞬间形成发光等离子体。等离子体随着向外界环境膨胀过程而逐渐冷却，并发射表征样品组分信息的光谱，利用光谱仪对等离子体发射光谱进行采集，通过软件分析得到待测物浓度。
进一步地，在上述技术方案中，所述待测细菌为金黄色葡萄球菌。
具体地，在上述技术方案中，所述免疫层析试纸条检测线处包被的抗体为bs-0326r。
具体地，在上述技术方案中，所述免疫层析试纸条还包括，包被在控制线处用于检测连接金属纳米粒子的抗体的活性的羊抗鼠IgG抗体。
再进一步地，在上述技术方案中，所述免疫层析试纸条包括样品垫、PVC底板、硝酸纤维素膜、吸水滤纸、控制线和检测线，所述样品垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸沿层析方向设置在所述PVC底板上，且所述控制线和检测线沿层析方向设置在所述硝酸纤维素膜上。
具体地，该免疫层析试纸条的检测原理如下:
待测细菌与连接抗体的纳米粒子颗粒混合物滴到样本垫后，通过层析作用向检测线处移动，并在检测线处待测目标物被检测线处的抗体再次捕捉，形成双抗夹心结构，从而将待测物固定沉积，多余的连接抗体的纳米颗粒则会继续向前移动，并与控制线处的抗体结合显色，此处显色表明纳米颗粒连接的抗体是有活性的。
又进一步地，在上述技术方案中，所述连接金属纳米粒子的抗体为ab37644。
又进一步地，在上述技术方案中，所述金属纳米粒子为金银合金纳米粒子，优选为质量比为2:3的金银合金纳米粒子。
在上述技术方案中，所述利用等离子体发射光谱检测检测线处金属纳米粒子浓度的取点个数大于4个。
本发明另一方面还提供了上述高灵敏检测方法在细菌检测中的应用。
本发明的优点：
(1)本发明所提供的方法相较于传统免疫层析试纸条的目视检测限，结合等离子体发射光谱技术的免疫层析试纸条快速高灵敏读出方法，有效避免了视觉比色的误差并实现定量化检测，对目标物检测限提高了约4个数量级，满足相关标准的检测要求。同时无需辅助试剂添加和复杂前处理流程，检测速度快，灵敏度高；
(2)本发明所提供的方法将传统的免疫试纸条与等离子体光谱技术相结合，构建了一个高灵敏、稳定、快速的新型检测方法，提高了免疫层析试纸条的灵敏度，同时也是将等离子体光谱技术引入免疫学领域，拓宽了光谱学的应用。
附图说明
图1为本发明实施例中免疫层析试纸条的结构示意图；
图2为本发明实施例中等离子体光谱检测系统的结构示意图；
图3为本发明实施例中金黄色葡萄球菌检测定标曲线与可视化检测结果对比。
图中：样品垫1，PVC底板2，硝酸纤维素膜(NC膜)3，吸水滤纸4，控制线(C线)5，检测线(T线)6，层析方向7，Nd:YAG激光器8，信号延迟发生器9，光谱仪10，电脑11，3D样品12。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。
若未特别指明，本发明实施例中所用的种子和药剂均为可商业获得的。
若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
本发明实施例提供了一种免疫层析试纸条的高灵敏检测方法，具体用于检测金黄色葡萄球菌，其步骤包括：
S1、纳米颗粒的制备
合成银金质量比3:2的金属纳米颗粒，合成方法如下：首先在烧瓶里加入80mL的去离子水，再加入用0.22μm过滤网过滤质量分数为1％的柠檬酸三钠的溶液1.12mL，然后放到磁力搅拌器上进行加热搅拌至沸腾，接着加入质量分数为99.9％的稀释了5倍的HAuCl4溶液0.32mL继续煮沸2分半钟，最后加入质量分数为1％的AgNO3的溶液0.48mL，继续煮沸15分钟直至稳定。
S2、纳米颗粒连接抗体
将合成好的金银纳米颗粒冷却至室温后，取出1mL的金银纳米颗粒然后滴加14μL的0.2M K2CO3溶液，调节pH为8.5，此时抗体的活性最高，然后摇匀。接着加入1.6mg/mLab37644抗体(Abcam，用于捕获金黄色葡萄球菌)8μg后放到振荡器上震荡15分钟，然后加入20％的BSA溶液52.5μL进行封闭，可以减小后续的一抗或二抗等和载体的非特异性结合，放到振荡器上震荡5分钟。最后放到离心机里，离心机转速设置为3000r/min，离心时间30分钟。取出试管后去除上清液，然后滴加展开剂定容至300μL。
S3、加样到免疫层析试纸条
将金黄色葡萄球菌的菌液进行稀释，用PBS缓冲液配置成0-107CFU/mL的浓度梯度。取出50μL不同的浓度梯度的金黄色葡萄球菌溶液与50μL上述配置好的纳米颗粒与ab37644抗体的络合物，混合均匀后加入到免疫层析试纸条样品垫上。
具体地，免疫层析试纸条的结构如图1所示，包括样品垫1、PVC底板2、硝酸纤维素膜(NC膜)3、吸水滤纸4、控制线(C线)5、检测线(T线)6和层析方向7。
其中：
样品垫：待测物与金属纳米颗粒和抗体的结合物混合均匀后，放到此处；
PVC底板：用于放硝酸纤维素膜和其他部分材料；
硝酸纤维素膜：在免疫试纸条中作为检测线和控制线的承载体，也是免疫反应的发生处；
吸水滤纸：用于吸收多余的液体；
控制线：此处包被抗体2(羊抗鼠IgG)，用于检测金属纳米颗粒连接的抗体是否具有活性；
检测线：此处包被抗体1(bs-0326r，购自北京博奥森生物技术有限公司)，用来捕获待检测的目标物金黄色葡萄球菌，捕获目标物则在此处出现带色的条带；
层析方向：试纸条的样品垫处添加物质的流动方向。
检测原理如下:
待测目标物与连接抗体的纳米粒子颗粒混合物滴到样本垫1后，通过层析作用向检测线6处移动，并在检测线处待测目标物被T线处的抗体再次捕捉，形成双抗夹心结构，从而将待测物固定沉积，多余的连接抗体的纳米颗粒则会继续向前移动，并与控制线5处的抗体结合显色，此处显色表明纳米颗粒连接的抗体是有活性的。
金属纳米颗粒连接的ab37644抗体可以捕获目标物金黄色葡萄球菌，通过免疫试纸条的层析作用向前移动，当该复合物流经测试线时，会与包被在测试线上的bs-0326r抗体发生特异性反应，形成双抗夹心结构。随着该结构在测试线的逐渐累积，在测试线处就会出现带色条带。而包被在控制线处的羊抗鼠IgG(免疫球蛋白)则是用来检测纳米颗粒连接的抗体是否具有活性。
S4、免疫层析试纸条的检测
等待免疫试纸条干燥，干燥后观察免疫层析试纸条的检测线，通过目视检测可以得出金黄色葡萄球菌的检测限为104CFU/mL，如图3A所示。把免疫层析试纸条粘在一起，然后放到样品台上。
具体地，如图2所示，等离子体发射光谱检测系统装置由以下几个部分组成：Nd:YAG激光器8，信号延迟发生器9，光谱仪10，电脑11，3D样品12。
其中：
Nd：YAG激光器：发射脉冲激光，经透镜聚焦在样品表面产生等离子体；
信号延迟发生器：控制激光器产生脉冲激光与光谱仪采集光谱之间的时延；
光谱仪：对等离子体发射光谱进行采集；
电脑：对采集的光谱数据进行处理，并通过定标模型计算待测物浓度；
3D样品台：放样品的地方，通过调节样品台可以调整到合适的位置。
检测原理：
Nd：YAG激光器发射出脉冲激光，经过聚焦透镜聚焦在免疫层析试纸条的检测线上，试纸条表面吸收高功率的激光后，在试纸条表面附近瞬间形成发光等离子体。等离子体随着向外界环境膨胀过程而逐渐冷却，并发射表征样品组分信息的光谱，利用光谱仪对等离子体发射光谱进行采集，通过软件分析得到待测物浓度。
在本实施例中，激光器使用的是美国海洋光学的调Q Nd:YAG激光器CFR2000，波长为1064nm，光谱仪使用的是美国海洋光学的HR2000+。通过高精度三维平台调节平台的升降可以调整样品的分析位置，设置激光的脉冲能量为180mJ，激光斑点大小为75μm，延迟时间为0μs。在免疫试纸条的检测线上选取5个点，用等离子体光谱技术对其进行测量，观察Ag(I)328.04nm处的光谱图，所得的光谱如图3B所示。利用采集到的光谱数据和对应的金黄色葡萄球菌的浓度建立定量标准曲线如图3C所示，浓度为10-106CFU/mL的金黄色葡萄球菌与光谱数据有着良好的线性关系，R2＝0.991，检测限为1.6CFU/mL。
图3为本发明实施例中金黄色葡萄球菌检测定标曲线与可视化检测结果对比。图3-A所示的是滴加不同浓度的金黄色葡萄球菌试纸条，其中，滴加104CFU/mL金黄色葡萄球菌的试纸条的检测线处开始显现出线，说明检测到目标物金黄色葡萄球菌，目视检测限为104CFU/mL；图3-B所示的是滴加了0-107CFU/mL金黄色葡萄球菌试纸条用等离子体光谱技术测量得到的光谱图，从光谱图中可以看出随着滴加金黄色葡萄球菌浓度的增长等离子体光谱强度相对应增强；图3-C所示的是滴加金黄色葡萄球菌和等离子体光谱强度的定量标准曲线和拟合直线，浓度为10-106CFU/mL的金黄色葡萄球菌与光谱数据有着良好的线性关系，线性相关系数R2＝0.991，等离子体光谱技术对金黄色葡萄球菌的检测限为1.6CFU/mL。
最后，以上仅为本发明的较佳实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种免疫层析试纸条的高灵敏检测方法，其特征在于，将金属纳米粒子与抗体混合连接后，与待测细菌混合进行特异性捕捉，随后滴加到免疫层析试纸条上与其检测线处的抗体再次捕捉，实现待测细菌的稳定沉积，利用等离子体发射光谱检测系统检测免疫层析试纸条检测线处金属纳米粒子的浓度，进而得到待测细菌的浓度；
所述金属纳米粒子为金银合金纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的高灵敏检测方法，其特征在于，所述等离子体发射光谱检测系统包括激光器、光谱仪和3D样品台，所述激光器为Nd：YAG调Q激光器，其脉冲能量在10-280mJ范围内可调。
3.根据权利要求1或2所述的高灵敏检测方法，其特征在于，所述待测细菌为金黄色葡萄球菌。
4.根据权利要求3所述的高灵敏检测方法，其特征在于，所述免疫层析试纸条检测线处包被的抗体为bs-0326r。
5.根据权利要求3所述的高灵敏检测方法，其特征在于，所述免疫层析试纸条还包括，包被在控制线处用于检测连接金属纳米粒子的抗体的活性的羊抗鼠IgG抗体。
6.根据权利要求4或5所述的高灵敏检测方法，其特征在于，所述免疫层析试纸条包括样品垫、PVC底板、硝酸纤维素膜、吸水滤纸、控制线和检测线，所述样品垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸沿层析方向设置在所述PVC底板上，且所述控制线和检测线沿层析方向设置在所述硝酸纤维素膜上。
7.根据权利要求3所述的高灵敏检测方法，其特征在于，与所述金属纳米粒子连接的抗体为ab37644。
8.根据权利要求6所述的高灵敏检测方法，其特征在于，与所述金属纳米粒子连接的抗体为ab37644。
9.根据权利要求4或5所述的高灵敏检测方法，其特征在于，与所述金属纳米粒子连接的抗体为ab37644。
10.根据权利要求3所述的高灵敏检测方法，其特征在于，所述金属纳米粒子为质量比为2:3的金银合金纳米粒子。
11.根据权利要求6所述的高灵敏检测方法，其特征在于，所述金属纳米粒子为质量比为2:3的金银合金纳米粒子。
12.根据权利要求4或5所述的高灵敏检测方法，其特征在于，所述金属纳米粒子为质量比为2:3的金银合金纳米粒子。
13.根据权利要求1所述的高灵敏检测方法，其特征在于，利用等离子体发射光谱检测检测线处金属纳米粒子浓度的取点个数大于4个。
14.权利要求1-13任一项所述的高灵敏检测方法在细菌检测中的应用。
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