JP2009236921A - 微粒子標識を使用した分析物アッセイ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】この方法は、試料中の1つ以上の任意の分析物を、散乱光の検出が可能な粒子と特異的に会合させる段階と、前記粒子から散乱光が生じ、かつ1個以上の該粒子から散乱した光を、電子増幅せずに500倍未満の倍率で肉眼検出し得る条件下で、該分析物と会合した任意の粒子に光を照射する段階とを含む。この方法はまた、このような任意の粒子によってそれらの条件下で散乱された光を、分析物の存在の目安として検出する段階をも含む。
【選択図】なし
Description
本出願は、1996年4月25日出願のYguerabide他の「微粒子標識を使用した分析物アッセイ(Analyte Assay Using Particulate Labels)」という名称の米国特許仮出願第60/016,383号に対する優先権を主張し、図面を含むその全体を参照により本明細書の一部とする。
以下は既存の関連検出法の概略である。また、特許請求された発明の詳細を読者が理解するのを補助する、関連科学技術の概要でもある。引用した技術はいずれも、本特許請求の先行技術であることに対する自認と解するべきではない。引用した技術は、本発明の実施に使用する、その技術の一般的な手順および方法を本明細書に再び書く必要がないようにするために、参照により本明細書の一部とするものである。特に、出願人は「結合対(binding-pair)」法の一般的な方法と光散乱の測定法に関係する各項を本明細書の一部とする。
結合対(リガンド−受容体、分子認識結合法等の名でも知られている)技術は、生物医学的分析の多くの応用で重要な役割を果たし、環境科学、獣医学、製剤研究、食品および水質の管理等の分野で重要性が高まりつつある。低濃度(約1ピコモル分析物/分析試料体積未満)の分析物の検出では、蛍光標識、発光標識、化学発光標識または電気化学発光標識と、それらの検出法が使用されることが多い。
粒子による光散乱現象と、診断的アッセイでの微粒子標識の使用と、診断的アッセイでの光散乱法の使用に関しては大量の情報があり、次に、以下の関連技術に関する考察のなかで呈示するが、この関連技術は何ひとつとして、係属中の特許請求の範囲に対する先行技術であることを自認するものではない。この技術は、特許請求された発明の新規性と有用性を理解するための背景として提供する。一般的な光散乱研究には、極めて大きな分野が含まれる。光散乱現象は、過去およそ100年かそこらにわたって精力的に研究されており、人間活動の様々な側面への光散乱知識の応用は、幅広く多様である。
散乱現象のさらなる背景情報が以下の各出版物に見られる。
Zsigmondy,「コロイドと限外顕微鏡:コロイド化学と限外顕微鏡の手引き(Co lloids and the Ultramicroscope‐A Manual of Colloid Chemistry and Ultramicroscopy)」,1914,John Wiley & Sons,Inc.は、金粒子と他のタイプの粒子の様々な光散乱特性が記載されている。
Hunter,「コロイド科学の基礎(Foundation of Colloid Science)」,Vol.I,105,1991は、粒子の観察での光学顕微鏡、限外顕微鏡、電子顕微鏡の使用を記載している。
Shaw他著,「コロイド化学・界面化学入門(Introduction to Colloid and Surface Chemistry)」は、コロイドの光学的特性と、電子顕微鏡と例えば暗視野顕微鏡などの限外顕微鏡の使用を記載している。
Stolz,SpringerTracts,Vol.130は、時間分解光散乱法(time resolve light scattering methodologies)を記載している。
KleinおよびMetz,5「写真の科学と工学(Photographic Science and Engineering)」5-11,1961は、ゼラチン中のコロイド状銀粒子を記載している。
EversoleおよびBroida,15 Physical Review 1644-1654,1977は、銀、金、銅などの様々な金属粒子からの散乱光に及ぼすサイズと形状の影響を記載している。
KreibigおよびZacharias,231 Z.Physik 128-143,1970は、小さな球状の銀粒子および金粒子での表面プラズマ共鳴を記載している。
Bloemer等,37 Physical Review 8015-8021,1988は、マイクロメートル未満のサイズの銀針の光学的特性を記載し、このような針の使用はBloemerの米国特許第5,151,956号に記載され、その中には、導波管内を伝搬する光を偏光にする、金属小粒子の表面プラズモン共鳴が記載されている。
Wiegel.,136 Zeitschrift fur Physik,Bd.,642-653,1954は、コロイド状銀の色と、電子顕微鏡の使用を記載している。
過去およそ35年間にわたり、多種多様のタイプの分析および/または診断の応用におけるコントラスト増強剤あるいは光吸収標識の両方として、金と銀を含む金属粒子が使用されてきた。これらの応用の大多数は、細胞構造、細胞下構造または組織構造を研究するためのマーカーとして金粒子あるいは銀増強金粒子を使用する、細胞免疫化学的研究の範疇に入る。これらの研究では通常、走査型、透過型、BEI(後方散乱電子映像)を含む電子顕微鏡により金属粒子が検出、位置確認される。この方法では、金属の高電子密度性ないし金属の高い原子番号を利用して、高密度の金属によって生成された多数の二次電子および後方散乱電子の力で、金粒子の検出を容易にしている(Hayat,「免疫金−銀染色(Immunogold-silver staining)」参照ページ1および第1章、第6章、第13章、Hayat,「コロイド金(Colloid Gold)」参照章:第1章、第5章、第7章他参照)。
「Geoghehan等(1978年)は、コロイド状金ゾルの赤色ないしピンク色を、パラフィン切片を用いた光学顕微鏡法の免疫金染色に初めて使用した。やや薄い樹脂切片中では、せいぜい14ナノメートルの大きさの金粒子から散乱された光の赤い色が光学顕微鏡法で高濃度の標識抗原を含む細胞オルガネラ中に見られた(LucocqおよびRoth,1984年)。光学顕微鏡法での免疫金染色の感度は、他の免疫細胞化学技法に比較して劣り、前者は一般に受け入れられなかった。金付着物のピンク色は視覚化が困難なのである。」
この節には、診断研究および分析研究向けの金粒子と他の金属粒子の光散乱特性の理解の現状を示す箇所である。この節は、「やや薄い樹脂切片中では、せいぜい14nmの大きさの金粒子からの散乱光の赤い色が光学顕微鏡の中の高濃度の標識抗原を含む細胞オルガネラ中に見られた。」と具体的に述べている。
「コロイド状金(colloidal gold)は当初、その高電子密度性と二次電子放出特性ゆえに、電子顕微鏡法(EM)のマーカーとしてのみ使用されていた(Horisberger,1979年)。光学顕微鏡法(LM)でのコロイド状金の直接視覚化は限られたものであった。高濃度の免疫金を使用すると、細胞がこの試薬によって赤く染色されるのであるが、コロイド状金のサイズは光学顕微鏡のレベルで検出するには小さすぎる(Geoghegan等,1978年、Roth,1982年、Holgate等,1983年。」
上記の両方に述べられているように、光学顕微鏡法によるコロイド状金の検出感度は低いと信じられていた。認識されたこの弱点を克服するため、金粒子の銀増強法が開発された。以下は、1995年の概観書からの別の引用文である。
「光学顕微鏡法向けの免疫金染色の真の飛躍的進歩は、5ミクロンのパラフィン切片中の、免疫グロビン(immunoglobin)と結合したコロイド状金粒子(20nm)の銀増強導入と共に訪れた(Holgate等,1983年)。この手法により、光学顕微鏡での抗原検出能の感度、効率、確度が著しく向上した。IGSSを使用すると、直径がせいぜい1nmの金粒子を光学顕微鏡で視覚化し得る。また、IGSSに供した薄切片も、特に位相差コントラスト照射もしくはエピ偏光照射を使用することにより、光学顕微鏡で見ることができる(Stierhof等,1992年)。」
「LHAのメリットを評価するため、我々の技法を文献に記載されている他の2つの間接的非放射能技法と比較した。比較に最適な技法は、ハイブリダイゼーション・シグナルの銀増強によるストレプトアビジン・コロイド金法であるが、それは、これが粒子技術に匹敵するからである。しかしながら、この方法は、さらなる銀増強の段階によってもそれほど高感度とならず、ナイロン膜上のLHAにより0.6ピコグラムないし2×104個の分子が検出されるのに比べ、この方法によると8ピコグラムのλ−ファージDNAが検出される。」
「表面に結合した標識のみがシグナルを発生する。・・・導波管により生み出される減衰波は、導波管表面に配置された複数のDNA捕捉帯で吸着された微粒子標識からの光を散乱させるのに使用される。減衰波は、導波管表面から数百ナノメートルまでしか達しないので、未結合標識/解離標識は光を散乱せず、洗浄段階が必要とされない。シグナルの強さは表面結合の測定を可能とするのに十分であり、光散乱標識の脱着を実時間で検討し得る。すなわち、検出は速度制限的ではない。チップ上のハイブリダイゼーション・パターンは視覚的に評価することができ、あるいは定量分析用に、1秒の1/30の8ビット・ビデオ・フレーム・グラバー搭載の標準的なCCDカメラを使用することによって得ることもできる。」
「4nmから40nmの間のDNAで単一塩基の識別に十分な導波管シグナルが発生し、したがって蛍光シグナル・システムに匹敵する。」
と示唆している。
「免疫反応によって界面に運ばれるコロイド状金標識の存在によって妨害される減衰波からの後方散乱光」の検出に基づいている。
「・・・臨界角を超えた背面角で検出器を配置すると、優れたSN比が保証される。
著者等は、記載されたイムノアッセイ系が散乱された全内面反射率、すなわち減衰波の伝搬を利用していると説明している。コロイド状金の存在によって減衰波の伝搬が混乱し、その結果、散乱光が生じ、光電子倍増管またはその他のセンサーによって検出されて応答シグナルを発生する。彼らは、自らの発明の重要な側面とは検出器の物理的位置である、と示唆している。
「検出器は、臨界角より大きな角度である位置に配置し、これにより光源方向から後方に散乱される光だけが検出されるようにするのが理想的である。それによって、この配置によりバルク液体媒質中の上位散乱光(superior scattered light)の検出が理想的に回避される。」
入射ビームの全内面反射を使用して減衰波様式の照射が生み出され、光透過性の表面上で検出が行なわれる。専用の装置を使用することが好ましい。
「今まで報告されていず、しかもそれが可能なことが意外にも立証された。
***
金属ゾル粒子、すなわち本発明による進歩した免疫化学的技法は、公知の放射性免疫技術および酵素免疫技術よりも高感度であるばかりか、これによると、様々な化学的組成のゾル粒子を標識に利用することにより、被検媒質中の1つ以上の免疫成分を同時に実証、測定することがさらに可能ともなる。」
金属としては、例えば白金、金、銀および銅、あるいはそれらの塩などがある。
「反応混合物のある種の相中の物理特性および/または金属の濃度および/または形成された金属含有凝集物の測定は、それ自体公知の非常に多くの技法を用いて行なわれる。これらの技法の例としては、何らかの分散液の非常に濃い色が使用され、物理化学的変化でさらに変色する比色定量法、金属ゾルが着色しているという上記の事実に照らして、すでに定性的測定に適用し得ることが多い上記の視覚法、同時定量を可能にする、フレーム放射分光測光法または他のプラズマ放射分光測光法と、高感度フレームレス原子吸収分光測光法の使用などが挙げられる。」フレーム放射分光測光法または他のプラズマ放射分光測光法を使用することにより、試料中の2つ以上の分析物が好ましく検出される。最高感度の好ましい検出法は、フレームレス原子吸収分光測光法によるものである。」
「両方の手順とも、最終生成物は抗原含有領域を覆う多数の金粒体の集積物であり、これにより、コロイド状金ゾルの典型的な赤い色が生じる。」
「典型的な場合では、上記の手順では、用いた金属粒子は約10nmから約100nmの直径を有する。これは、一般に200nmあたりとされている明視野顕微鏡法の解像限界より、かなり小さい。したがって、従来知られていたすべての目視光学顕微鏡法が、固定化集合体の検出への応用が限られていたのは、全くもって理にかなったことである。個々の粒子は、限外顕微鏡技法、特に電子顕微鏡法によってのみ観察することが可能であった。
全く意外なことに、得られる像を電子コントラスト増強に供すれば、今では明視野光学顕微鏡法もしくはエピ偏光顕微鏡により、直径200nmより小さな個々の金属粒子を可視スペクトルの形ではっきり目視できるようにし得ることが分かった。」
と述べている。その著者等は、続く項で
「ゾル粒子免疫アッセイに基づく既存の診断法と比較すると、本法はずっと高い感度を有する。実際、既存の方法は一般に、吸収金属粒子または懸濁金属粒子による光の吸収もしくは散乱に基づいている。例えばブロッティング媒質などの色の観察には、膨大な数の粒子が存在している必要がある。それとは対照的に、本法は単一粒子の観察と計数を可能にするものである。それ故に、本法によると、例えば目視技術や比色技術などの既存の技法では感度が低すぎる応用、例えば肝炎の検出向けなどの応用のための既存の診断的ブロットの進歩が大いに促進されるであろう。」と述べている。
「ガラスまたは細胞の下に吸着した、あるいは細胞内に微量注射されたプラス/マイナス100ナノメートルより小さなサイズを有する個々の金粒子は、光学顕微鏡では見えない。しかしながら、コントラストを電子的に増強するビデオカメラを使用すると、容易に視覚化される。」
と述べている。その著者等は、偏光と反射光の集光による、もしくは「より簡単で、明らかにより高感度の様式」と簡単なカメラの使用による、エピ照射の使用を記載している。その著者等は、位相差コントラスト顕微鏡法により、金粒子を容易に検出し得ることを示唆している。
「比較的大きな金(通常は20〜40nm)で可能であるのとは異なり、5nmの金は、例えば微小管などの構造物上にある、その稠密な集積物ですら光学顕微鏡で見ることができない。それらは、検出が可能な赤色を呈しない。これは最近、粒子サイズを大きくして容易に見える黒染色とする、銀塩による物理的進歩によって是正された。
***
我々は、リガンドをほとんど分子レベルで位置決定する方法を記載した。この方法は、背景の構造物から明白に識別し得る、とびとびの個々のマーカーにより、光学顕微鏡で初めてこれを行ない得るようにするものであるから、新しい。生細胞にも適用できるので、個々の蛋白質の動的挙動を追跡し得る。この方法は、2つの十分に進歩した技術、すなわち金標識とビデオ顕微鏡法とを結びつける。ほとんどの応用は、ほとんどの優れた倍率100倍の油浸対物レンズよりも値段が安く、廉価なビデオ装置によって行ない得る。これを現代のディジタル画像処理と組み合わせると、もっと多くの可能性が生まれる。追加の利点のなかには、なんら価値のないものもある。標識は、個々のとびとびのマーカーから成るので、手による計数も自動的(コンピュータ援用)計数も両方とも容易なうえに信頼できる。マーカーのサイズが小さなことから、浸透と拡散の問題が最小となる。マーカーの荷電をほとんど自在に変化させ得ることは、任意の特定の応用における非特異的な結合を減らすのに役立つであろう。」
この方法は、その著者等によって「ナノ粒子ビデオ限外顕微鏡法ないしナノビッド限外顕微鏡法」と命名された。同様の技術が「Geerts等,351 Nature,763-766,1991に記載されている。
好ましい態様では、粒子が、散乱光特定の波長、色、偏光、角度依存性およびRIFSLIWを有し、かつ眼または光検出手段によって検出可能な特定の光散乱シグナルを生成するのに適したサイズ、組成および形状を有し、粒子濃度の目安として粒子計数法および/または散乱光の強さ測定法が検出に含まれ、粒子が金属様の材料から作成されるか、非金属様の材料を含む混合組成物から作成され、粒子が球状、卵形、あるいは非対称(非対称とは、形状がほぼ球状なものを除外した形状であることをいう)であり、粒子が結合剤、ポリマー、反応性化学基、基礎材料分子、無機化合物および有機化合物で被覆され、アッセイ方式で2個以上の粒子を互いに密着させたときの散乱光の特性の変化が使用され、金属様の材料から成り、結合剤との結合に適した基礎材料分子で被覆された粒子試薬が使用され、2個以上の粒子を互いに十分に接近させて2個以上の粒子の光散乱特性が単一粒子から識別可能となるようにしたアッセイ方式が使用され、互いに近接して保持した2個以上の粒子を引き離していずれか1個の粒子の光散乱特性を変化させるようにしたアッセイ方式が使用され、粒子を一体保持する分子間相互作用を分断すると1個以上の粒子が分子間相互作用から解放されるように、1つ以上の分子間相互作用によって2個以上の粒子を互いに連結したアッセイ方式が使用され、化学的もしくは生物学的な架橋剤を使用して2個以上の粒子を互いに架橋することにより、分析物の、増幅された検出が達成されるアッセイ方式が使用され、粒子が電界、磁界、もしくは関係する電磁界(EMF)中で配向し得るように追加材料から構成され、粒子が磁気特性または強誘電特性をもつ他の粒子に付着し、照射光ビームが他の波長と比較してバックグラウンドを低減するように選択した波長を有する。別の態様では、照射光が定常状態であるかパルス化し、照射光がコヒーレントであるかコヒーレントでなく、照射光が偏光ないし非偏光であり、同一光源もしくは2種類以上の様々な光源からの2種類以上の様々な波長が試料の照射に使用され、散乱光シグナルが検出される。別の態様では、眼または光検出手段により検出し得る、各々1つ以上の散乱光の特性を有する複数の様々な粒子を使用することがこの方法に含まれ、かつ/あるいは複数の異なる粒子が照射または検出の段階で使用され、屈折率増強法を使用して非特異的な光バックグラウンドが低減され、検出器が試料および光ビーム散乱光の前方の包絡線外の角度に配置され、空間周波数フィルタリング法が使用され、非特異的なバックグラウンド光を低減するためにカットオフ・フィルターや狭周波数帯域通過フィルタなどの光学フィルターが検出段階で使用される。さらに別の態様では、検出前に同種金属組織学により粒子サイズが大きくされ、照射光ビームが赤外線を欠き、分析物が血清中に存在し、検出前に粒子が溶液中に放出され、検出前に粒子が濃縮されて小量もしくは固相領域とされ、表面への時間依存性結合により、あるいは検出器または検出器セットを通って粒子を流すことにより粒子が検出され、マイクロアレイ中の固相上で複数の分析物が検出され、マイクロアレイが液体で覆われるか乾燥し、細胞表面、溶解産物、もしくは染色体調製物上で単一または複数の分析物が検出され、照射光ビームが多色白色光もしくは単色光であり、分析物が溶液または固相中に存在し、あるいは顕微鏡スライド、マイクロタイタープレートまたは他のプラスチック容器の上に存在し、粒子が、1nmから500nmの間のサイズを有する金または銀の粒子であり、検出段階に電子手段による散乱光の増幅が含まれず、照射光ビームがプリズムその他の導光システムによって粒子に配向される。
先ず、図面を簡単に説明する。
E−EMR:放射電磁放射線
I−EMR:入射電磁放射線
EMF:電磁界
SC:半導体
Sec:秒
Qr:蛍光量子収量
Iabs:入射光吸収(吸収光量子/秒)
Io:入射光の強さ(光量子/秒)
M:モル濃度(モル/リットル)
ml:ミリリットル
mM:ミリモル
g:グラム
mg:ミリグラム
mm:ミリメートル
μl:マイクロリットル
pI:等電点
Eまたはe:モル吸光係数(M-1cm-1)
C:モル濃度(M)
X:光路長(cm)
If:蛍光の強さ(光量子/秒)
Seff:粒子の散乱効率
Cabs:吸収断面積(cm2)
ACSR:粒子の物理的断面積に対する粒子の吸収断面積の比
Csca:散乱断面積(cm2)
SCSR:粒子の物理的断面積に対する粒子の散乱断面積の比
a:粒子の半径
Cext:粒子の散乱消衰断面積(cm2)
I:溶液厚さXを通過した後に溶液から出る1秒あたりの光量子
N:粒子濃度(粒子/cm3)
t:懸濁液の濁度
Is:散乱強さ(Scattering Intensity)(光量子/秒)
n2:物質の屈折率
n2Rel:n2の真の成分
n2Im:n2の仮想成分
n1:媒体の屈折率
m:媒体屈折率に対する粒子材料屈折率の比
Io:入射光波長(nm)
RI:屈折率係数
Refmed:媒体の屈折率(n1)
em:媒体の誘電率
nm:媒体の屈折率
a:被覆された粒子の分極率を決定する
nm:ナノメートル
cm:センチメートル
μ:ミクロン
本発明は、試料中の1つ以上の分析物の検出と測定のための方法を特徴とする。この方法は、特定の組成、サイズおよび形状の、特定のタイプの粒子の使用と、この粒子の1つ以上の光散乱特性の検出および/または測定に基づく。
以下は、特許請求された発明の完全な理解に役立つ情報を提供する。これらの公式は、本発明の実施と最適化に有用であるが、特許請求の範囲の先行技術と自認するものではない。
本発明の分析物検出用の新規のシグナル発生検出システムの開発において、様々な粒子タイプの種々の光散乱属性を蛍光パラメータの形で評価し得る、新しい公式を開発することが有用であることが分かった。これによると、ε、Qf、蛍光と励起の各スペクトル、放射された光の強さの観察角度依存性、放射された光の偏りの状態など(これらは以下で定義する)を検討し得る。これらの新規の公式によると、当業者は、診断的アッセイもしくは他の任意の応用で使用するときに望ましい光散乱特性を具現するために、組成、サイズ、形状などの個別の粒子パラメータを選択し得る。読者が式8から式15の新しい定式化を理解するように、式1から式7を背景情報として提示する。記載した公式または光散乱パラメータはいずれも、本特許請求の範囲に対する先行技術であることに対する自認と解するべきではない。
出願人は、サイズ、形状、組成、均一性の様々なパラメータをもつ多種多様のタイプの粒子を評価して、粒子パラメータの、どの具体的な構成によると、分析的アッセイと診断的アッセイで容易に検出、測定し得る、望ましい光散乱シグナルが得られるかを決定するために、当技術分野で知られているRayleighとMieの各光散乱理論の、ある種の修正に基づく分析法を開発した。
蛍光材料に対しては、式1によって示すように、毎秒吸収される光子の数と、吸収された光子のうち、光として再び放射される光子の数(Qf)との積によって、蛍光の強さが求められる。
Iabs(λ)=2.303Io(λ)e(λ)Cx (1)
式中、Io(λ)は波長λ入射光の強さ(光子/秒)であり、I(λ)は波長λのときのモル吸光係数(単位:M-1cm-1)であり、Cは蛍光体のモル濃度(単位:M)であり、xは光路長(cm)である。
入射波長λf、励起波長λeでの積算蛍光の強さI(λf)(毎秒全方向に放射される光子の合計)は(低い蛍光体濃度に対して)、
I(λf)=2.303Io(λe)Qf(λf)e(λf)Cx (2)
アッセイ応用での蛍光化合物の有用性の、列挙したパラメータによる評定は、よく知られている手順である。蛍光分子と蛍光技法の使用は、蛍光分子の光安定性と、高レベルの非特異的な蛍光、燐光、および散乱光がある試料中の特定の蛍光放射シグナルを検出する能力とによって限定されている。蛍光分子、あるいは蛍光染料で取り囲んだ粒子などの他の蛍光物質を高感度で検出するには、さらに高度な機器を使用する必要がある。
粒子の吸収断面積(C abs )
波長λの単色光ビームを照射した粒子を考える。粒子の吸収断面積Cabsは、この範囲に当たる光子が不可逆的に吸収されるように粒子を取り巻く面積(通常cm2またはμ2の単位で表す)として定義される。Cabsの値は、粒子のサイズ、組成、形状および均一性に依存する。また、この値は光の波長にも依存し、Cabsの波長に対するプロットから粒子の純粋な吸収プロフィルが得られる。組成が均一な任意の球状粒子のCabsの波長に対するプロフィルは、RayleighまたはMieの理論によって計算し得る。我々の用語では、Cabsは不可逆的光吸収と関係がある。Cabsの性質は、我々が消衰(extinction)断面積Cextを定義する以下の項を参照することによって、さらによく理解し得る。
相対吸収断面積Acsrは、粒子のCabsを粒子の物理的断面積πa2で割った比として定義され、ここでaは粒子の半径であり、すなわちAcsr=Cabs/πa2である。Acsrは、粒子を取り巻く面積に当たる光子を非可逆的に吸収する、粒子の能力の目安を提供する。Acsrは、粒子の組成、形状およびサイズと光の波長に依存して、0から6の範囲の値を有し得る。1よりも大きな値は、粒子がその物理的寸法を超えて到達し、光子をそれに引きつけ、吸収することを意味する。物理学の文献では、Acsrを粒子の吸収効率因子と呼ぶ。この命名法は、Acsrが効率に似つかわしくない、1より大きな値を持ちうるので、誤解を招きかねない。
散乱粒子によって吸収された(ここで、「吸収された」には可逆的吸収と非可逆的吸収とが含まれる)光の光子が、吸収された光子と同一の波長で再び放射される、有限の可能性がある(量子力学的な観点)。再び放射された光子は、入射光子の方向と異なった方向に放射され得る。すなわち、入射光子は吸収と再放射によって散乱される。入射波長での粒子の散乱断面積(Csca)は、その範囲に当たる光子(量子力学的な観点では、吸収され、次いで再び放射される)が散乱されるように粒子を取り巻く面積として定義される。Cscaは通常、cm2またはμ2の単位で表され、粒子の組成、形状、サイズおよび均一性と波長に依存する。光散乱プロフィルCsca対波長は、RayleighまたはMieの理論を使用して、組成が均一な任意の球状粒子に対して計算し得る。
粒子のCscaを粒子の物理的ないし幾何学的断面積で割った比πa2(ここで、ここでaは粒子の半径である)によると、光子を引きつけ、吸収し、粒子を取り巻く面から再び放射する、粒子の能力に対する目安が得られる)。すなわち、Sscr=Csca/πa2である。物理学の文献では、Scsrを散乱効率因子と呼ぶ。
実験的結果と理論的結果によると、Scsrの値は、粒子の組成、形状、均一性およびサイズと光の波長に依存して、1から5以上の範囲にあり得る。1より大きなScsr値は、粒子がその物理的寸法を超えて到達し、光子をそれに引きつけ、吸収し、次いで光子を再び放射することを意味する。これが可能なのは、粒子の半径よりも大きな距離では、光子の電磁波との粒子の電気的な相互作用が起き得るからである。一般に、Scsrは粒予サイズが大きければ大きいほど大きくなる。小さな粒子(約40nm未満)に対しては、Scsrは1より小さく、それより大きな粒子に対しては、Scsrは1以上であり、それより大きな粒子に対しては5の値に達し得る。
光散乱粒子の消衰断面積Cextは、散乱断面積(Csca)と粒子の吸収断面積(Cabs)の和として定義される。
Cext=Csca+Cabs (3)
Cextは通常、cm2またはμ2で表す。
任意の粒子の消衰断面積Cextは、通常の吸収分光計により、与えられた任意の波長で即座に測定し得る。Io(光子/秒)を濃度がN粒子/cm3の粒子の懸濁液に当たる光ビームの強さとする。X(cm)は、溶液の濃さであり、I(光子/秒)は距離xを横断した後に溶液から出る光の量である。この強さは、Cextとの間に式
I(λ)=I(λ)e-NCext(λ) x (4)
の関係がある。この式は、これらのパラメータがλに依存することを明確に示す。光検出器は散乱光を検出しないように設置されていると仮定している。
粒子が純粋な散乱体である場合、すなわちいかなる光も非可逆的に吸収しない場合、Cext=Cscaであり、上記の式は
I=Ioe-NC sca x (5)
=Ioe-tx (6)
と書かれる。
ここで、t=NCscaは、懸濁液の濁り度(turbidity)である。
化学の分野では、与えられた波長で溶液中の物質が光を吸収する強さは、M-1cm-1の単位をもつモル吸光係数eで示される(Mはモル/リットルを表わす)。この係数は、実験的に決定される吸光度と下記式の相関がある。
A(λ)=e(λ)Cx (7)
次に、出願人は自身の理論的方法を簡単に提示する。当業者は、以下の方法を使用してサイズ、形状、および均一性の特定の粒子パラメータを評価、修正および調整して、容易に検出、測定し得る、1つ以上の望ましい光散乱特性を導き出すことができる。試料のタイプ、診断方式、および装置手段の限界に関して考慮する必要がある。例えば、1つの応用では、高い非特異的光バックグラウンドを含む固相試料について処理能力の高い検査装置によって多分析物の検出が行なわれるが、別の応用では溶液中の単一分析物の検出が医務室で行なわれる。
このとき、その波長におけるモル吸光係数は、式(7)と、粒子濃度をN(粒子/cm3)からC(M)へ変換する次式とによって計算し得る。
C(M)=1000N(粒子/cm3)/6.03×1023 (8)
モル吸光係数は、消衰断面積Cextとの間に(逆もまた同じ)式
e(M-1m-1)
=[Cext(cm2/粒子)6.03×1023]/2.303×1000 (9)
=2.63×1020Cext(cm2/粒子) (10)
または
Cext(cm2/粒子)
=2.303(M-1m-1)×1000/6.03×1023 (11)
=3.82×10-21e(M-1m-1) (12)
の関係がある。
式(9)または式(10)によると、Cextからeを計算し得る。
出願人は、被覆された、もしくは被覆されていない粒子に対し、蛍光効率Qrからの類推により、粒子によって吸収された光(可逆的吸収+非可逆的吸収)のうち、散乱光として再び放射される光子の割合として、光散乱効率Seffを定義し得ることを突き止めた。数学的には、出願人は散乱効率を式
Seff=Csca/Cext (13)
=Csca/(Csca+Cabs)
によって定義する。
純粋な散乱体である粒子、すなわち光子を非可逆的に吸収するが、吸収して再び放射するにすぎない材料から構成される粒子に対しては、Sabsは0に等しくSeffは1に等しい。小さなポリスチレン粒子は、スペクトルの可視領域では純粋な散乱体として挙動し、これらの粒子に対しては、Seffは1に等しい。可逆的に非可逆的に光子を吸収する材料から構成されている粒子に対しては、Seffは1より小さい。金粒子は、スペクトルの可視領域で後者のタイプの挙動を示す。
出願人は、被覆された、もしくは被覆されていない粒子によって散乱された光の強さは、毎秒(可逆的に、および非可逆的に)吸収される光子の数と吸収された光子のうち、再び放射される光子の割合との積によって求め得る(量子力学的な観点)ことを突き止めた。光散乱強さの測定は通常、吸収される光の量、Iabs(毎秒吸収される光子)が式
Iabs=Io 2.303eCx (14)
で与えられる希薄溶液中で行なわれる。Ioは入射光の強さ(光子/秒)、εはM-1cm-1で表したときの粒子のモル吸光係数、粒子のCはモル濃度、xは単位cmの光路長である。
出願人はさらに、照射光の強さの合計Is、すなわち全光散乱角にわたって積分した強さは、式
Is=2.303Io(λ)Seff(λ)e(λ)Cx (15)
[式中、Io(λ)は照射光の強さである]によって与えられることに気付いている。この式は、蛍光体に対する式(2)に匹敵する。
CscaとCextによって表したεとSeffに対する式を上式に挿入すると、その結果から、散乱光の強さが散乱断面積(Csca)の大きさに正比例する上、それによって完全に決定されることが分かることに注意する。これは、様々な粒子の相対散乱強さを、その散乱断面積から予測し得ることを意味する。
次いで出願人は、多種多様のアッセイ方式を用いて種々の試料タイプ中の分析物を検出するのに使用し得る、最も重要な光散乱特性のいくつかを簡単にまとめる。測定した光散乱特性で検出されたものは、次のうちの1つまたはそれ以上である。散乱光の強さ、波長、色、偏光、角度依存性、およびRIFSLIW(散乱光の強さおよび/または波長の回転性個別変動)。
照射光が直線的に偏っている場合、非球状の粒子は、回転するに連れてちらつく。粒子は、その配向が、その長軸が偏光の方向に配向するようにしたときに最も強く、モーメントがこの方向と直角のときに最小となる。これに対し、小さな球状の粒子は、偏光を照射してもちらつかない。ある組成の非球状の粒子に対し、散乱光の色は(白色光を照射すると)非対称度に応じて変化する。非対称性が大きくなるに従い、色はより長波長の方向へシフトする。例えば、通常の光学顕微鏡により、DLASLPD様の条件下で観察したところ、粒子が溶液中で回転するに従って銀の非対称粒子が色を変えるのが出願人によって観察された。出願人によって「RIFSLIW」(散乱光の強さおよび/または波長の回転性個別変動)と命名されたこの特性は、本発明の多種多様の観点において、試料中の1つ以上の分析物を、より特異的に、より高感度に検出または測定するのに使用される。
本発明者は最大値の波長におけるε値を前記の表現を用いて計算した。測定ε値は、光の吸収を、標準的な分光光度計で、計算された最大吸収波長において測定することにより得られた。計算で求めたε値と実験的に測定して求めたε値との間の一致は、完全ではないが、極めて良好である。観察結果と結果結果との間に認められる約2倍の相違は金粒子の規定直径が不正確であったことを反映している可能性がある。実験法の詳細は実施例の部分に与えられる。
螢光は、現在、分析物の存在又は不存在を検出するためにデザインされた多くのアッセイに用いられている。
フルオレセインは、最も良く理解されかつ最も広く使用されている螢光化合物である。できるだけ微量のフルオレセイン分子を検出しようと、多くの研究が行われてきた。フルオレセインは、高いモル吸光係数(約6×104M-1cm-1)を有し、約0.8の非常に高い螢光量子収率を有する。
混合した組成の球形粒子を、種々の診断および分析用途にそれらが利用できるかを評価するために理論的および物理学的実験により評価した。理論的評価については、種々の厚さの銀で被覆した金の「コア」粒子および種々の厚さの金またはポリスチレンで被覆した銀コア粒子を検討した。「コア」という用語の意味は球形粒子を言い、その上に異なる光散乱物質の追加の層または厚さを配し、その結果、一定割合の混合した組成をもたらす。直接の物理学的実験は、混合組成から構成される粒子についてなされ、ここで、銀の追加の厚さが直径16nmのコア金粒子に加えられた。これらの例証例では、金および銀が金属様物質の代表例であり、ポリスチレンが非金属様物質の代表例である。これらの例は、一以上の異なる金属様物質および/または非金属様物質の混合物から構成される粒子を含む多くの異なる可能性のある組み合わせのうちのほんの少しである。
理論的および物理的実験の組み合わせから次のように決定した。金属様物質の一定混合組成、例えば、金および銀の混合組成から構成される粒子について、多くの異なる試料のタイプにおいてそして特異的診断および分析用途に有用である新規な光散乱特性が発現する。高い光散乱強度の二以上の光学的に別個の解像可能な波長をもつ粒子は、金属様物質の組成を変化させることにより製造できる。
光線を基準とした非対称粒子の物理的配向は、付加的な散乱光の性質をこれらの粒子の検出に用いることを可能にする。RIFSLIWの性質を本発明の多くの異なる態様に用いて、試料中の一つ以上の分析物又は粒子をより特異的にかつより敏感に検出し及び/又は測定することができる。例えば、散乱光の強度の不安定さ及び/又は色の変化は、どの粒子が表面に結合し、どの粒子が結合しないかを知るための付加的な検出手段を与える。これは非分離式分析(同種)の開発を可能にする。必要であることの全ては、変動しない及び/又は色を変化させない粒子を粒子計数、強度測定等によって検出することである。溶液中の非結合粒子は変動し及び/又は色を変化させるが、表面に結合した粒子は変動しない及び/又は色を変化させない。例えばビデオレコーダーのような、付加的な画像処理手段が非対称粒子と球状粒子(対称粒子)に対して付加的な検出手段を用いることを可能にする。例えば、分離又は非分離フォーマットのいずれかにおいて、結合粒子は、集光レンズの焦点を表面に合わせて、ある時間にわたって一定である単位面積当たりの散乱光シグナルのみを記録することによって検出される。ブラウン運動又は他の種類の運動を経験する溶液中の自由粒子が、これらの粒子に対する単位面積当たり単位時間当たりの可変散乱光強度を生じる。結合した光散乱粒子は空間に固定され、運動しない。画像処理法を用いて、"運動"光散乱粒子を"結合"光散乱粒子から分離することによって、結合粒子量を測定し、試料中の分析物の量に相関させる。当業者は、表面に結合した粒子と、溶液中の非結合球状又は非対称粒子とを区別するために用いることができる多くの他の画像処理方法が存在することを理解するであろう。
ある一定の用途では、ある一定の種類の組成物を用いて、粒子の表面に"コート"することが、粒子をさらに化学的に安定化するために、又は分析的な診断アッセイへの特定の用途に非常に重要でありうる付加的な表面結合特性を加えるために有用でありうる。例えば、銀が迅速に酸化することは周知である。銀粒子又は、銀を含有する混合組成物の粒子の使用に関して、銀がその化学的安定性に環境の影響をもはや受けないように金又は他の物質の薄い被膜を表面に与えることによって、銀含有粒子を化学的に安定化させることができる。
1種類以上の物質の混合物から成る粒子のこれらの例は、可能である種々な物質の非常に多くの異なる組成物の若干例にすぎず、このことは当業者に自明であろう。
粒子の光散乱特性の検出方法に依存して、粒子集団における粒度の大体の大きさと分布は特に重要であると考えられる。例として、商業的に入手可能な金粒子製剤の多くは約<10〜約<20%あたりの変動係数の粒度分布を見積もっている。%変動係数は、粒子製剤の平均値によって分割された粒度分布の標準偏差として定義される。したがって、20%の変動係数を有する60nm粒子製剤に関して、1つの標準偏差単位は約±12nmである。これは、粒子の約10%が48nmより小さいか又は72nmより大きいことを意味する。寸法のこのような変動は散乱光の強度と散乱光の色とに、製剤中の粒子の大体の"平均"寸法に依存して有意な影響を及ぼす。
本発明者等は、商業的に入手可能な粒子よりも狭い粒度分布を与えるように思われる粒子成長方法を開発した。この方法は最初に"種子"金粒子の製剤を製造して、次に、この"種子"金粒子製剤を用いて、化学的方法によって異なる寸法の金粒子(実施例11と15参照)又は銀粒子(実施例13参照)を"成長させる"。例えば、16nm直径金粒子を"種子"粒子として用いて、適当な試薬を加えることによって、より大きい直径の金粒子を製造する(実施例15参照)。この方法は混合組成粒子を製造するためにも非常に有用である。
ある一定の用途では、個々の粒子の色を用いて、特定の種類の分析物を同定し、定量する。例えば、画像サイトメトリー用途では、細胞表面に付着した種々な種類の粒子の数と色とを検出することによって、種々な種類の細胞表面抗原を同定し、計数することが重要でありうる。このために又は任意の他の関連した種類の多重分析物を検出するために、種々な粒子の粒度分布をできるだけ緊密に保持する必要がある。粒子製剤の平均粒子直径は、同じ用途に用いられて、散乱光の異なる色を生じる小さい粒子と大きい粒子との平均粒度の寸法中点に密接する平均値又は"平均"粒度を用いて、白色光照明下で所望の色の散乱光を生じるように選択されるべきである。この方法で、種々な種類の粒子の散乱光の色によるそれらの分解可能性(resolvability)が最大化する。
他のセクションでは、粒度が増大又は減少したときに散乱光の強度がどのように大きく変化しうるかを説明した。特に、積分光(integrated light)強度測定をおこなうときに、この強度変化を考慮しなければならない。20%変動係数を有する上記60nm粒子製剤を用いる場合には、このことは、粒子の10%が60nmよりも約3倍大きい又は小さい強度を有することを意味する。さらに、この集団の残りの90%における粒子は全く異なる強度を有する。測定される多くの粒子が存在する用途では、"平均"積分光強度は60nm粒子に接近しなければならない。しかし、低濃度の粒子では、このような変化の統計学(statistics)が試料毎の読み取り値の正確さに影響を与える可能性があり、修正アルゴリズムが必要になる可能性がある。できるだけ狭い粒子分布を用いることによって、正確で、容易な測定が促進される。
数種類の分析物アッセイのために、分析物は、吸光特性による分析物の検出が実現可能であるような濃度で存在する。例えば、イムノクロマトグラフィーアッセイ等の分野における現在の問題は、典型的に用いられる大きさ(4〜50nm直径)の金粒子の使用が、それらの吸光色によって光学的に分解されることができない粒子を生成するにすぎないことである。これらの粒子はフィルターペーパー又は同様な診断アッセイ固相媒体上で観察したときにピンクから赤色までを有する。銀粒子及び他の金属様粒子の大きさ及び/又は形状を変えることによって、多くの異なる吸光色を得ることができる。吸光による粒子のこれらの異なる色を用いて、粒子の吸光色によって異なる分析物を検出することができる。肉眼によって検出することができるこれらの色は例えばイムノクロマトグラフィー流動アッセイ、パネル型の及びマイクロアレイ又は大きい固相の単独又は多重分析物アッセイのような、多くの種類の固相アッセイに非常に有用である。銀の球状及び非対称粒子と、他の金属様粒子のある一定の混合組成物とは吸光による広範囲な色を可能にする。
オートメタログラフィーと関連技術を用いて既存の金属様粒子の大きさを小さい率(factor)又は大きい率で拡大することができる。金属及び/又は半導体物質から成る粒子の吸光力、特に金粒子及び銀粒子の吸光力は、肉眼又は吸光度を測定するように設定された機器を用いて、これらの粒子の存在を定量及び/又は検出するためにしばしば利用されている。このような方法は、メタログラフィーによって拡大された少数の粒子を検出するその能力において、本発明の光散乱検出方法に劣っている。
光学顕微鏡検査、テレコミュニケーション及び他の関連分野における屈折率マッチング方法(matching technique)は当該技術分野において周知である。この方法は一般的に、光線が1つの媒質又はデバイスから他の媒質又はデバイスヘ、例えば1つの物質の表面から他の異なる物質の表面へ通過するときに生ずる、非特異的な光散乱と反射とを減ずるために用いられる。
式中、refmedは媒質の屈折率であり、mは粒子の屈折率/refmedに等しい。mは絶対的に波長に依存するが、正確な依存性は粒子組成及び媒質によって変化する。色を有さない大抵の溶媒の屈折率は通常、少なくともスペクトルの可視領域において、波長に依存しない。
m2+2=0 (17)
である。上記式をmに関して解くと、
m=√−2 (18)
=1.41i (19)
が得られ、式中、i=√−1である。上記式は、屈折率が1.41の値を有する純粋な虚数であるときに、屈折率ファクターがその最高値を有し、粒子からの光散乱が最大になることを示す。表16に提示した算出データは予想された傾向に従わない。さらに、屈折率強化方法は、最大光散乱が金属様粒子に関して生ずる入射波長からはるかに移動した入射波長において非常に良好に作用する。
上記例はこの組合せ方法の多くの可能な変形の1例にすぎない。他の変形は当業者に明らかであろう。
哺乳動物の血清は多くの医学的に重要な物質を含有しており、これらの物質の定量及び/又は存在は臨床実験室その他の所で測定されている。血清中のこれらの分析物の存在を測定するために多くの異なるシグナル発生及び検出系が用いられており、これらには、例えば蛍光、光散乱及び化学発光のような光シグナル発生方法と、直接標識方法とシグナル増幅方法の両方を含むフォーマットに用いられる比色方法がある。天然の血清は、蛍光、化学発光又は光散乱機構のいずれかによって非特異的光シグナルを生成することができる多様な物質を含有する。さらに、血清はしばしば、トレーサー実体(entity)からの特異的光シグナルの発生及び/又は検出を妨害する物質を含有する。これらの問題は、純粋な又は殆ど純粋な血清試料中で分析物検出をおこなうことを不可能でないとしても困難にする。
胎児ウシ血清はBiowhitaker(Walkerville,MD)から購入、カタログNo.14−501Fo血清は販売前に1μフィルターを通過したものであり、透明であったが、わら色であった。血清pHはpH9〜9.5に調節した。放射光の波長濾過はおこなわなかった。
(a)この場合に得られる光シグナルは1の値を表す。このシグナルは3.7x10-7Mフルオレセインに等しかった。
哺乳動物の血清は約3.7g%のタンパク質を含有し、その約2/3が血清アルブミンである。血清中のポリスチレン粒子の検出は、血清中のタンパク質及び他の物質並びに多くの他のソースに起因する非特異的光散乱によって妨害される。ポリスチレン粒子と、血清中のタンパク質及び他の物質との光散乱強度対入射可視波長プロフィルの類似性が、血清又は任意の他の高度散乱媒質中のポリスチレン粒子を検出する能力を重度に限定する。
金粒子はそれぞれ59.6nmの実測直径を有した。95.7%血清はわら色を有し、1cm路程と543nm波長において約0.14の光学密度を有する。約5mmの内径を有する6mmx50mmガラス管中で限界散乱測定をおこなった。血清による吸光度が散乱光シグナルを約15%減ずることが推定される。
固相検出方法
上記セクションでは、本発明者等は本発明の種々な態様を、これらが金属様粒子のある一定の光散乱特性と溶液中のこれらの粒子の検出とに関するかぎり、説明した。次には、表面に存在する又は表面に非常に接近して存在する粒子を検出するための本発明の方法を説明する。
本発明者等は、粒子からの散乱光を集めるために種々な種類の光収集光学デバイスを用いることが可能であることを発見した。本発明者等は、粒子計数と強度測定(単位面積当たりの積分強度)の両方を用いて、本発明のDLASLPD照射及び検出方法によって一定面積中の粒子の特異的光散乱特性の1種類以上を検出している。本発明者等がおこなった実験の大部分において、粒子密度がμ2当たり約0.1粒子であるときに、計数測定法を用いることが一般に有用であることを本発明者等は発見しており、粒子密度がμ2当たり約0.1粒子より大きいときに、総積分光強度を測定することが有用な測定方法であることを本発明者等は発見する。しかし、約0.1粒子/μ2より大きい又は小さい粒子密度において計数測定方法又は積分光強度測定方法が使用可能であることに注目すべきである。
本発明者等は、表面における又は表面近くの粒子の散乱光を検出するために集光レンズの使用が不必要である方法も開発している。この配置において、本発明者等は通常、問題の表面からの散乱光を積分光強度によって検出する。これは肉眼によって、又は既述したように光検出器によっておこなうことができる。直径が約120nm以下である金属様粒子を用いる場合には、散乱光の前方方向の包絡線(envelope)の外側の角度に本発明者等の検出器(肉眼又は光検出器)を配置することによって、粒子光散乱シグナル/総非特異的光バックグラウンド比率を有意に増大することができることを本発明者等は発見した。
照射及び検出のDLASLPD方法を詳細に説明する前に、何らかの形式で用いた場合に、光散乱粒子を検出するためのシグナルと、シグナル/バックグラウンド比率範囲とを決定する重要な概念(key concepts)を要約することが有利であろう。これらの方法は、例えばより強力な光源、より高度な平行光源、短波長バンド光源、異なる波長の光源、より敏感な光検出器を用いるような、種々な装置要素を調節及び/又は変更することの他に、照射源と試料の間及び/又は試料と検出器の間の光学及び/又は空間的フィルター、及び/又は共焦点又は同様なイメージング方法である。これらの対策及び方法は以下で略述する。
この方法の詳細を次に説明する。
1.一般的概念
ここで説明する固相方法は、光散乱粒子の検出に適用可能である。この場合に、1種類以上の光散乱特性の検出と測定は試料中の一つ以上の分析物の存在、不存在又は濃度に相関される。これらの方法は、マイクロアレイ、アレイチップ又は同様なフォーマットを含めた既知固相分析方法の全てではないとしても殆どに適用可能である。この方法は広範囲な感度(低い感度から超高感度まで)を有するように設計される。この感度範囲は、使用の容易さと安価な装置とによって得られる。
照射系は(1)高い光強度のビームを光散乱粒子のパッチ(又はドット群)に供給し、(2)直接又は反射によって検出系に入る照射光の量を最小にするように設計される。このことは、検出系の集光角度の外側である角度に光線とその反射とを抑制することによって達成される。一つの照射方法では、集光レンズと光源とを固相面の両側に配置し(下方から照射)、他の方法では、照射光源と拡大レンズとを面の同じ側に配置する。
図1は、用いる基本的照射方法の一つの概略図を示す。この方法では、光は面の下方から固相面Sに作用する。Sは透明であると想定される(但し、若干の色を帯びることもできる)。Oは、光散乱粒子を含有する表面上の領域である。拡大レンズ又は集光レンズLはSの上方に位置付けられる。Lが集光する角度は陰影つき円錐Cとして示され(レンズLの集光円錐)、その先端は表面S(光散乱粒子が位置付けられるところ)にあり、底面はレンズの直径Dによって定められる。照射光線(LB)はLの集光円錐に入らないように角度をつけられる。矢印はLBの進行方向を示す。
N.A.=n sin(θH) (36)
[式中、nはレンズと点Oとの間の媒質の屈折率である]
によってθHに関連づけられる。媒質は例えば、空気(n=1)、水(n=1.33)又は浸漬油(n=1.5)であることができる。小さい値のθHに関しては、N.A.はD/2fにほぼ等しく、この場合にDはレンズの直径であり、fは焦点距離である。
倍率 N.A. θ H (度)
x10 0.25 14.47
x20 0.5 30
x40 0.65 40.54
x63 0.85 58.2
図3のダイヤグラムに関して、Snellの屈折の法則を説明する。この図は屈折率ni(iは入射媒質に対して)の媒質に沿って進行し、屈折率nt(tは透過媒質に対して)の媒質の表面に作用する光線を示す。入射光の一部は媒質t中に透過され、一部は反射されて(反射ビーム)、媒質i中に戻る。入射角がθiであるならば、反射ビームの角度は次式のように表されうるSnellの法則によって得られる:
ni Sin(θi)=nt Sin(θt) (37)
ni<ntであるならば、θi<θtである。ni>ntであるならば、θi>θtである。これらの角度が、表面Sに垂直であるラインを基準にして測定されることに注目のこと。反射ビームは角度θr=θiを形成する(即ち、反射角と入射角とは等しい)。
種々な入射角θiに関する反射される入射光強度の割合Rは、Fresnelの反射式を用いて算出することができる(強度がこの場合に単位時間当たり、単位面積当たりのエネルギーとして定義されることを注目すべきである。強度は放射照度とも呼ばれる)。しかし、簡略化のために、Rをθiに関連づけるプロットに関して本発明者等の考察を説明する。θiへのRの正確な依存姓は、niとntの値と、入射光の偏光状態とによって決定される。反射に関する重要な事実を次に挙げる。
図4は、ni=1(空気)及びnt=1.5(後者はガラス又はプラスチックの屈折率に近い)である場合と、入射面に対して平行に偏光した光(rp)と垂直に偏光した光(rs)とに関するR対θiのプロットを示す。入射面は、入射光線とこの面に対して垂直なラインとを含有する面として定義される(図3参照)。偏光しない光の反射率Rは、入射面に対して平行に偏光した光と垂直に偏光した光とのグラフの平均によって与えられる。図4では、偏光しない光の反射率グラフはOrd(通常として)で標識する。図4のグラフは次のことを示す:
Tan(θb)=nt (38)
ni=1(空気)を想定して算出することができる。nt=1.5では、上記式はθb=56.3を生じる。Brewster角において、θi+θt=90°であることに注目すべきである。したがって、nt=1.5に関して、θi=θb=56.3°かつθt=33.7°である。Brewster角より大きい角度に関しては、rpはωの増加と共に迅速に増加して、90°において100%の値に達する。
図5は、ni=1.54及びnt=1に関する偏光の反射率対入射角(ω=θi)のプロットを示す。これらのプロットはni<ntに関する図4のプロットとは全く異なる。最大に有意な差は、約41°より大きい入射角では、全ての光が反射される(100%反射、全反射)ことである。全内部反射が生ずる最小の入射角は臨界入射角θcと呼ばれる。この角度の値はniとntの値に依存する。niとntの値からθcを算出するための式は、臨界角における入射光線と透過光線との角度を考慮することによって誘導することができる。臨界角θcでは、反射ビームは入射光の大部分を含有し、正反射の法則によって要求される表面に垂直なラインを基準にして角度θcを形成する。透過光は低い強度を有し、垂直ラインを基準にしたその角度θtは90°である。即ち、透過光線は表面に対して平行に進行する。それ故、Snellの式にθt=90°を導入することによって、θcの値を得ることができる。この導入は次式をもたらす:
nt Sin(90)=ni Sin(θc) (39)
Sin(90)=1であるので、Sin(θc)=ni/nt (40)
と表すことができる。nt=1.54かつni=1(空気)に関しては、上記式はθc=40.5°を生じる。臨界角が偏光しない光、入射面に対して垂直に又は平行に偏光した光に対して同じであることに注目すべきである。即ち、θcは光が偏光していないか又は平面偏光しているかに関係しない。
最初に、粒子が空気中で乾燥した顕微鏡スライドの表面上に存在する簡単な場合を考える。即ち、粒子は乾燥しており、空気が顕微鏡スライドの両面の媒質である。図6は、この場合に関与する反射と屈折の概略図を示す。最初の反射は表面S1で生ずる(ni<nt,ni=1及びnt=1.5)。図4は、70°までの入射角に対して反射される光の割合は20%未満である。それ故、S1における反射はこの照射方法において問題ではない。表面2は、光が低屈折率から高屈折率へ進行し、この表面において全内部反射が起こる可能性が存在するので、問題になる可能性がある。ni=1.5かつnt=1(空気)の表面において全内部反射が起こる臨界角は約42°である(式40によって算出)。次の問題は、表面1における入射光が大きい角度を有するときに、この臨界角が得られるか否かである。
この照射方法は図10に示す。S、L、C及びLBの意味は図2と同じである。この図では、励起光線が表面の上方から表面Sに作用する。集光レンズもSの上方である。励起光線は、入射又は反射光線がレンズLの集光円錐Cに入らないように角度を付けられる。この照射方法では、ビームパス(path of the beam)中の種々な面から反射される光を、拡大レンズ又はイメージングレンズLの集光円錐C中に反射されないように維持することが必要である。各面において反射角は入射角と同じであるので、Lによる好ましくない反射光の収集は、照射光線を円錐Cの外側であるような角度に限定することによって最小化される。上記セクションにおけると同様に、反射が光散乱粒子に供給される光エネルギー量を有意に減ぜず、臨界反射が乾燥した又は水で覆われた粒子に生じないことを実証することができる。表面の人為的結果による非特異的光散乱は上記セクションで考察したとおりである。
i.図11はプリズムのセットアップの概略図である。その最も簡単な形式の一つでは、これは、検出されるべき光散乱粒子を含有するマイクロタイター穴、ガラススライド、プラスチック又はガラス基体上のマイクロチップ等を乗せることができる三角形プリズムから成る。光散乱粒子を含有する試料室又はスライドをプリズムの上面S2に乗せ、粒子含有面をレンズLの焦点に配置する。試料室又はスライドとプリズムとの間に浸漬油を配置して、屈折率適合によって非特異的光を最小にする。粒子は空気中で乾燥状態である。S2における屈折率適合が正確又は殆ど正確であるならば、光線はS2において有意な屈折又は反射を受けない。したがって、照射光線はプリズムと、光散乱粒子を含有する面とを横切って、ほぼ直線に進行する。しかし、空気−プリズム界面S1とS3において屈折が生じる。S1に対して垂直である方向でプリズムに入る照射光線(入射角は0°である)を考え、このプリズムが45°プリズム(角度γ=45°)であると想定する。光線はS1からS3上の点Oまで直線状態で進行するので、面S1に45の角度で衝突する。光線は次に、空気からガラスへの臨界角が約42°であるので、全内部反射を受ける。したがって、プリズムなしの下方からの照射(図6参照)とは対照的に、プリズム配置は臨界反射を可能にする。プリズムの不存在下では(図6)、図6に示すようにS1における光の反射のために臨界反射を達成することができないことを思い出す(図7も参照)。例えばプリズムのような導光系を用いる場合に高エネルギー光線を供給するために、照射光線は42°未満の角度でS3に衝突するように(図11)導かれなければならない。次の問題は、S3における42°未満の入射角が、S3を出る光がレンズLの集光円錐の外側でなければならないという条件を満たすことを可能にするかどうかである。S3における入射角が35°であると想定する。Snellの法則から(ni=1.5及びnt=1による)、流出角度(exit angle)は62°であり、これは本発明の最も必要な対物レンズ、即ち、θH=41°のx40対物レンズの集光円錐の外側である。図11のプリズム配置が、暗色バックグラウンドを維持しながら、空気中の乾燥光散乱粒子への高い光エネルギーの供給を可能にすると結論される。
前節では、光散乱粒子(表面に付着しているかまたは表面のすぐ上方で遊離しているもの)への光エネルギーの効果的な供給を支配し、同時に、集められる非特異光を最小にする諸要素(反射と屈折)に重点を置いて、本発明者らの照射と検出との(拡大レンズ)系について検討した。この節では、拡大レンズLにより作られた拡大された像を、接眼レンズを通して目視観察することにより得られる実験上の詳細を提出する。
本発明者らは、三つの各々異なるタイプの光源を以下の通り使用した。
i.Leica顕微鏡照射器
これは標準的な市販の顕微鏡照射器である。タングステンフィラメント白熱電球とレンズとを使用しており、レンズは、照射器の先端から約22mmの距離のところに5×7mmのフィラメントの集束像を作り出す。より集束した光ビームを作り出すために、本発明者らは×10対物レンズを顕微鏡に取り付けた。レンズは、照射器の先端から約6.5cmのところにある。対物レンズは、対物レンズから約7mmの距離のところに、直径約4〜5mmの集束光のスポットを作り出す。
ii.Bausch and Lomb Fiber Lite照射器
これも市販の照射器である。放物面反射体上に取り付けられている150ワットのタングステン白熱電球を使用している。反射体は、直径約25mmのほぼ平行な光を作り出す。直径11mmの光学的光導体(束ねられた多くの小さな光ファイバーからなる)を、白熱電球の近くに位置決めする。次にこの光学的光導体を二つの等しい光導体に分割し、各々は直径約5.3mmで長さ約2フィートとする。本発明者らはこの光導体の一つを使用する。集束光スポットを作り出すために本発明者らは、光ファイバーの端部から約25mmのところに位置決めされた焦点距離25mmのレンズ(直径20mm)を使用して、光ファイバーからの光を平行にする。コリメーティングレンズから約50mmのところに位置決めした×10対物レンズにより、次に平行光を集束して直径5mmの光スポットにする。コリメーティングレンズと対物レンズとは、たわまないように光ファイバーに取り付けられている小型ホルダ中にある。光ファイバーに可撓性があるため、このタイプの光源系は、たわまないLeica顕微鏡照射器よりもはるかに使い易い。
iii.特注照射器
これは、本発明者らが組み立てた照射器である。放物面反射体上に取り付けられている12V、28ワットのタングステン白熱電球を使用している。反射体は、ほぼ平行な光のビームを作り出し、この光のビームは、直径0.125インチを有する光学的導体に集束する。この光学的導体は長さ36インチである。反射体からの光は、電球の近くに位置決めされているレンズ(焦点距離23mm、直径9mm)により、光ファイバーに集束する。光導体は開口数0.55を有し、かつ、平面半角60°の光円錐を受け入れる。
光導体の他の端部から出る光を、ファイバーの端部から約17mmのところに位置決めされている焦点距離12mmのレンズ(直径11mm)により、平行にする。平行光は最終的に、×10対物レンズにより集束して、直径5mmの明るいスポットになる。対物レンズは、コリメーティングレンズから約26mmの距離のところに位置決めされている。5mmの明るいスポットは、集束レンズの端部から約12mmの距離のところにある。
図12に示すのは、例えばプリズムのような幾つかの光導体の線図であり、本発明者らは、これが本発明者らの照射系に有用であることを見い出した。こうしたものの幾つかは、古典的な意味では実際にはプリズムではく、むしろ光ガイダーまたは光導体と呼ぶことができる。光ガイダーは、光が効果的に斜めに供給されることを可能にし、同時に、反射光ビームが、入射光面に対向する面から出ることを可能にする。これは以下の理由で、何らかの最小寸法を有さなければならない。光ビームが入りかつ反射光が出るスポットは、表面の不規則性が原因で、かなりの非特異光散乱を生じ得る。こうしたスポットを、特異的光散乱粒子のパッチから十分に除去することにより、非特異的光散乱へのその寄与を最小にしなければならない。光導体を試料チャンバーと一体化して成形でき、従って光ガイダーと分析部片との間に浸漬油を使用する必要性を無くすことができる。本発明者らは、そのような装置を試作するために、小さな光導体をプラスチックチャンバーの底部に接着剤で接着した。チャンバーは、試料チャンバー穴の内部表面にコートされたストレプトアビジンスポットのマイクロアレイを有する。マイクロアレイの個々のマイクロスポットに結合している光散乱粒子の、この装置を使用した本発明者らの検出及び測定は、二つの表面間に浸漬油を用いてプリズム上に置いた試料チャンバーによる本発明者らの粒子計数による測定及び強度測定と本質的に同じである。
目視顕微鏡観察用の接眼レンズを使用して、本発明者らは、粒子の明るさと、バックグラウンドの暗さと、様々なタイプの臨床アッセイ形式における有用性とに特に重点を置いて、幾つかの照射装置を評価した。良好な結果を生じる幾つかの装置が見い出された。本明細書においては、優れた結果を生じ、最も使い易く、最も高価でない装置の一つに検討を限定する。優れた結果により本発明者らが意味するのは、拡大レンズとして×10及び×40対物レンズを使用した際の暗いバックグラウンド上の明るい粒子である。
本発明者らは、DLASLPDビデオコントラスト強化方法を使用することで、試料中で金属様粒子と非金属様粒子とをより大きい感度で検出できることを確認した。この方法は、結像した非特異光バックグラウンドを電子的に調整して、結像した映像面からバックグラウンドを本質的に除去し、同時に、個々の粒子を可視に保つステップを含む。この方法は、本明細書において説明される他の諸方法と共にきわめてうまく働く。本発明者らは、この方法を使用して生じる、改良された特異性と感度とを観察した。
本発明の特定の態様を取り上げ、かつ、ここでそれを、使い易さと様々な試験環境及び条件への適合可能性とに関してさらに改良するという趣旨において、本発明者らは、アッセイを行いかつ分析物を検出するために使用する試料チャンバーの設計に、本発明の幾つかの態様を実施できることを見い出した。
広範囲の分析物タイプがあることは従来技術において周知である。こうした分析物は、様々な試料環境中に、例えば、水、尿、血液、痰、組織、土壌、空気、及びその他同様なものの中に存在する。個々のタイプの分析アッセイの要件によって決まるが、考察の対象となっている分析物に関して半定量情報または定量情報、またはその両方を得たいことがある。条件によっては、小さく、廉価で、非常に携帯性の高い器械で分析を実行するが望ましい。例えば、消費者用、現場での使用(研究室から離れて)、または病院での臨床である。問題になっている分析物に関して、半定量及び/または定量測定値を迅速に得ることが望まれている。他の用途では、1日に数個の試料を試験するような小さな研究室で分析物を検出するためには、小さく廉価な器械で定量的結果を得られるものを有するのが望ましい。例えば、診察室、診療所、サテライト試験室、研究所及びその他同様なものである。また、高スループット試験のような、1日につき数百〜千の試料を試験したい条件もある。上記の試験条件及び環境の各々は、従って、各々異なるタイプの装置手段を必要とする。そのような装置の、使い易さとコストとの見地からの利益と不利益とは、試料中の単数または複数の分析物の試験の正確な要件が明確に定義されている際に、詳細に決定できるだけである。
単数または複数の適切な結合剤と適切な濃度の結合剤及び分析物とを使用することにより、凝集(agglutination)、凝集(aggregation)、架橋、網目形成及び類似の結合事象が起こり得、かつ、こうした事象を使用して試料中の一種類以上の分析物を検出できることは従来技術において周知である。幾つかのイムノアッセイでは、抗原が可溶でかつ多価な場台、可視の沈殿物が形成され、一方、抗原が粒子状でかつ多価な場合、凝集(agglutinate)またはクランプした粒子が形成される。幾つかの核酸アッセイでは、一種類の特異的一本鎖プローブが、二つ以上の一本鎖標的と「架橋」して、網目を増殖できる。代わりに、二種類以上の各々異なる非反復一本鎖核酸プローブを、同一の標的一本鎖核酸上の様々な部位に結合させるために使用できる。この手法では、二つ以上の標的による架橋を成し遂げることができるか、または、単に二つの非反復プローブ配列を同一の標的に結合させることで検出できるように配慮されている。
光散乱粒子を使用するアッセイ形式の実施例
下記に与えるのは、様々なアッセイ形式における本発明の幅広い多用性と大きな有用性とを証明する、幾つかの実例である。平均的な当業者であれば、従来可能だったものより、より特異的で、より使い易い、及びより敏感な、試料中の一種類以上の分析物の検出に対応している、本発明の多くの変形例があることを認識できよう。
一組の実験において、基材分子付着の方法を使用して、直径40nmの金粒子の合成物の表面をビオチン化した。遠心分離により精製し、洗浄した後、この材料の一滴をガラススライド上に置き、カバーガラスで覆い、光照射及び検出のためのDLASLPD方法を使用して光学顕微鏡で観察した。材料は均質に見え、粒子はブラウン運動により非常に速く動いており、緑色を呈していた。次にカバーガラスを除去し、一滴のストレプトアビジンの溶液をスライドの上に置いてから、カバーガラスで覆い直した。ある時間経過した後、新しく黄色−オレンジとオレンジ、及びオレンジ−白色の粒子構造が溶液中に現われ、これは緑色の粒子よりもはるかに大きな強度を有し、かつはるかにゆっくりと動いていた。こうした新たな粒子構造の幾つかはまた非対称に見え、というのは粒子は溶液中で回転するにつれ明滅したからである。しばらくの時間の後、多くの緑色の粒子は消滅しており、多くの黄色−オレンジとオレンジの粒子凝集体が存在した。顕微鏡でカバーガラスの縁部を調べた際に、縁部は、オレンジ、黄色−オレンジ、及びオレンジ−白色の非常に色の鮮やかな粒子凝集体でコートされていた。本発明者らは、類似の現象をホモポリマー核酸系において観察した。こうした観察により示されるのは、本発明の様々な形態において粒子散乱光特性の変化を使用することで、凝集体の可視化により、または「遊離」単一粒子数の減少により、または他の方法の使用によりバルク溶液中で、分子結合事象を検出できるということである。例えば、バルク溶液またはフロー系における検出のためには、適切な条件下で溶液の一部を照射しかつ溶液から発する散乱光の変化を捜すことにより、独特の散乱光特性を持つ新しい粒子形態の数の増大、及び/または、最初の特性を持つ粒子量の減少を使用できる。代わりに、フローを基にした系を使用することにより、試料中の材料をより特異的に分析できる。例えば、試料溶液の一部または全部を粒子毎に分析できるような、マイクロチャネル、毛管、またはフローサイトメトリー装置を使用する。溶液は、単数または複数の照射光源及び単数または複数の検出器のそばを流れるか、または代わりに、溶液は、マイクロチャネルまたは毛管中に捕捉され、次にマイクロチャネルまたは管の全部または一部を分析するために、試料容器、光源または検出器(またはこれらの何らかの組み合わせ)を試料の長手方向に動かす。
分子的事象、化学的事象、または他の事象の結果として、分析物の存在を検出するために本発明を使用できる、アッセイ形式の用途がある。例えば、分子内または分子間結合、連結、または他の分子構造を変化させることで、この処理の結果として分子の幾何学的形状全体を変化させるか、または、単数または複数の分子断片を解離させるようにする。例えばペプチド類、タンパク質類、核酸類、または医薬品類及びその他同様なものを、従来技術において周知の様々な手段によって、試料容器の表面に付着させることができる。こうした物質の幾つかの内部には、化学的処理、生物学的処理、または他の処理により切断または別の方法で変化させることができる一種類以上の分子内連結または結合部位がある。例えば、特定の酵素またはリボザイムの存在を検出でき、そのためには、その活性の結果として放出される切断生成物の量を監視する。単数または複数の光散乱粒子を分子構造の諸領域に直接にまたは間接に付着させる際には、切断処理への影響が最小になるようにする。溶液中の遊離粒子の存在または量を、または代わりに、試料容器にまたは他の粒子に付着している結合粒子の減少を、酵素の存在、量及び活性と関連させることができる。別の例では、全ての粒子が多価で抗体−抗原結合により結合するように、光散乱粒子を抗原性物質でコートしてから、抗体と混合する。この網目または凝集(agglutinate)材料を、試料容器中に置くかまたは希望するなら試料容器に付着させる。試料を容器中に置き、これは(同一の抗体または抗原または幾分類似した構造を持つ競合抗体または抗原であるかもしれない)分析物を含むかもしれない。試料中に存在する、抗原または抗体特異性分析物の存在と量によって、抗体と粒子にコートされた抗原との何分の一かは、競合により網目構造から解離する。存在する分析物の量を検出でき、そのためには、溶液中の粒子の量を測定する及び/または凝集(agglutinate)した網目に残っている粒子の量を測定する。粒子上に抗体をコートすることで、または、他の結合剤、例えば核酸類、ペプチド類、受容体類、医薬品類、ホルモン類及びその他同様なものを使用することで、この方法に関する変形例も使用できる。
別の実例では、結合剤でコートした粒子のブラウン運動を画像解析形式に使用することで、存在する分析物の存在と量とを検出できる。またこの方法を使用して、一つのパートナーが粒子に付着し、かつ、他のパートナーは溶液中に遊離しているような結合対における、分子結合事象と特性とを研究できる。そのような能力は、抗体類、抗原類、医薬品類、受容体類及び分子結合特性が重要な任意の物質の結合特性の特徴付けにおいてきわめて重要である。例えば、40nmの金粒子合成物を、抗原、医薬品、または抗体を表面に含むように作る。こうした粒子−結合剤を次に顕微鏡スライド上に置き、DLASLPD照射及び検出方法を使用して顕微鏡上で見る。そのブラウン運動特性を定量化する。次に、粒子上に付着した結合剤に結合できる分析物を含むかもしれない試料溶液を加える。加えた溶液が結合剤パートナーを含む場合、これは粒子上に結合している結合剤に結合するので、ブラウン運動の変化が観察できる。代わりに、特徴付けの用途のために、分子特性を特徴付け中の既知の濃度の物質を、既知の濃度で滴定し、その結合特性を決定する。このようにして、大抵の任意の分子認識結合対の分子結合事象を研究できる。
ある種の分析及び診断アッセイでは、粒子の散乱光特性の検出可能性を増大させ、その結果非常に簡易化された検出器械を必要とするかまたは検出器械を必要としない方が好ましいことがある。適切な分子認識結合対と粒子とを使用することにより、検出レベルすなわち感度を大幅に増大させることが可能である。一本鎖ホモポリマー配列類、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、及び他の結合対系を使用して、多くの粒子を「連鎖」させ「組み立て」できる。例として、サンドイッチ状の抗体−抗原−抗体構造が形成される固相アッセイを設計する。一つの抗体は固相に付着しているので、抗原分析物が捕捉される。次にビオチン基を含む追加の抗体を加える。さらに、ストレプトアビジンをコートした粒子と遊離ビオチンとを溶液に加える。(固相−抗体)−抗原−(抗体−ビオチン)から、複合体は成長して、...(ストレプトアビジン−粒子)−ビオチン−(ストレプトアビジン−粒子)−...構造になり、この構造は、共に結合している多くの粒子を含む。そのような粒子凝集体または網目構造は、一つの粒子よりもはるかに検出が容易な高レベルの強度を生じる。別の例として、ポリデオキシアデニル酸(Poly dA)及びポリチミジル酸(Poly dT)または他のホモポリマー一本鎖核酸類を使用でき、ここでPoly dAホモポリマー配列は、一本鎖「プローブ」分子のある領域に組み込まれる。粒子を、このホモポリマーに相補的なdT配列でコートしてから、追加の「遊離」dA一本鎖類と共に試料に加え、多くの粒子を含む構造を作り出す。上記の例は例示を目的としており、普通の当業者であれば、分析及び診断の条件と要件とによって、本発明のこの態様の多くの変形例が可能であることを認識できよう。
抗体のようなタンパク質性結合剤の、金属様及び非金属様粒子及び他の表面への、吸着の方法による付着は、従来技術において周知ある(M.Horisberger,Scanning Electron Microscopy(1981),2,p9-31を参照されたい)。吸着の方法を、例えば、抗体分子と共に使用して、結合特性を有する物質を粒子に付着できる。抗体の場合には、抗体分子の粒子への付着はまた、粒子に部分的な化学的安定性を与える。吸着条件を注意深く制御すれば、抗体分子のなかには、その各々の抗原に対してなお結合活性を所有するものもある。金属粒子の化学的安定化剤としての特定の合成ポリマーまたは生物学的ポリマーの使用も、従来技術において周知である(Heller et al.(1960),Journal of Polymer Science,47,p203-217を参照されたい)。粒子への及び他の表面への物質の吸着の方法は、本明細書において参考のために引用する。
i基材(base material)分子法
粒子や他の表面に物質を結合させるこの方法には、基材分子の使用を含む2工程法か用いられる。適切な基材分子は、吸着や他の化学的プロセスにより、表面に接近して、それと相互作用することができ、またたとえば結合剤のような補助物質を結合させることができる接近容易な官能基を有する物質である。基材分子は、粒子に化学的安定性を与える付加的性質を有することもできる。概して、基材分子は高分子形状(分子量サイズが1000以上)を有するがそれより小さい場合もあれば、はるかに大きい場合もあり得る。好ましい基材分子は、高親和力で粒子に結合し、該粒子にあるレベルの物理的安定性を与え、またほとんどいかなる物質をも容易に接合させる接近容易な化学基を有するものである。化学基は化学結合、共有結合、または非共有結合によって、結合剤または他の物質を結合させることができる。たとえば共有結合は光化学結合または化学結合を含むことができよう。非共有結合は、ストレプタビジンのような分子との、または疎水性、水素結合もしくは静電相互作用による架橋を含むことができよう。基材分子は、適当な化学薬剤または架橋剤を用いて、いくつかの基本単位分子を一緒に、粒子表面のいたるところで架橋させるのに用いることができる1種以上の化学基を含有することもできる。
我々は、結合剤を含む多種類の物質の、金属および金属様粒子ならびに表面への直接結合を可能にする特別な方法を開発した。物性物理学および関連分野の技術では、ある種の小分子(分子量1000未満)を金属表面等に結合させることが可能なことは公知である。大抵のこれら小分子には、小分子の一部は金属表面に結合することはできるが他の部分は表面に結合しない分子内の特定位置の或る種の化学基がある。たとえば、チオールおよびジスルフィド含有物質、ならびにn−アルコン酸およびある洗浄剤分子のような両親媒性物質の金属表面への吸着が物性物理学の分野では公知である(Nuzzoら,(1983),Journal of the American C hemical Society,105,p4481-4483;Allaraら,(1984),Langmuir,1,p45-52;およびBainら,(1989),Journal of the American Chemical Society,111,p321-335参照)。物質の金属表面への吸着法はこれによって参照として本明細書に組み入れられる。したがって、上記物質の結合を可能にする性質は、適当な薬品、結合させようとする物質の分子構造内の特定位置に組み込むことによって結合剤および他の物質に与えることができる。ある種の物質は他の物質よりもこの方法が容易である。たとえば、分子構造が電荷を有するかまたはイオン化し、もしくは分子構造の一端において疎水性であるが他端では親水性であるように分極している物質が概してこの方法の特定変形に有効である。
分析のミクロアレイ法またはミクロパターン法は、固相の個々の空間的にアドレス可能な領域を用いて、異種の分析物を検出する。たとえば、各空間的にアドレス可能な領域すなわちミクロスポット(microspot)は異種の抗体、受容体、核酸等を含むことができる。固相における空間的にアドレス可能な領域の配列は、用いられる固相の大きさ、分析物または異なる領域の数、および検出方法によって指令される。特定種類の結合剤を含有するそれぞれの空間的にアドレス可能なミクロスポットは、ミクロアレイをつくるのに用いられる方法によって角形、円形または任意のパターンとして形成させることができる。その寸法は数平方ミクロンから数ミリメートルまたはそれ以上であることができる。ミクロアレイ法は、単一の分析物検出に用いられ、また固相に結合する分析物の量に関連する固相シグナルを測定することによって最終定量化が行われる多くの固相フォーマットのいずれか1つを用いて実行させることができる。実際には、ミクロアレイ法の一般的分析工程は次の通りである。ミクロアレイを分析物試料、たとえば血清に曝露し、適当な保温時間後、アレイを洗って、第2の分析物結合物に曝露する。1つのフォーマットでは、光散乱性を検出する光散乱粒子に、第2の分析物結合物を結合させる。その上各ミクロスポットに結合した光散乱粒子の数は各ミクロスポット中に存在する分析物の数の尺度であり、試料中の分析物の濃度と相関させることができる。別のフォーマットでは、第2の特定分析物結合物を光散乱粒子に結合させない。この後者のフォーマットでは、第2の特定結合物に明確に結合する第3の物を光散乱粒子に結合させる。この第3の物は、たとえば第2の物と共有結合したビオチンと明確に結合するストレプタビジンであることができる。光散乱粒子に結合させた第3の物を用いて、第2の物を検出するために用いることができる多くの他の測定法がある。これらいずれのフォーマットにおいても、各ミクロスポットに結合した分析物の量は、各ミクロスポットに結合した光散乱粒子の数に関連する光散乱シグナルを測定することによって決定される。
a.単純な光学顕微鏡を用いるDLASLPD法
i.スポット上の粒子の表面低密度(1μ 2 当り粒子が0.1未満)
測定すべき試料の数が多くない場合には、各スポットにおける粒子の数を、各スポットにおける粒子数の視覚的または他の計数法によって求めることができる。バックグラウンドの計数も行う。計数は液体被覆または乾燥ミクロアレイにおいて行うことができる。正と考えられるミクロスポット当りの粒子の数は従来の供試実験によって明確にされる。多くの試料を試験しようとする場合には、単純なビデオ検出器および対象計数ソフトウェアを用いて自動的に行うことができる。
正のタイプかまたは負のタイプの分析かによって、視覚観察または光検出法によって各スポットからの強度を検出することができる。強度がバックグラウンドの強度よりも強い場合には結果は正である。定量的な結果が必要で、試験する試料があまり多くない場合には(たとえば臨床(bedside)、現場、小規模の臨床、または研究実験室試験)、2個の観察窓付き顕微鏡による手動方式を次のように用いることができる。単一のミクロスポットは狭い光ビームで照射する。ビームは1つの観察窓からの視覚観察によってスポット上に位置ぎめし、迷光シグナルのレベルにより、空間的フィルター開口部があろうとなかろうと、感光デバイスによって強度を定量的に測定する。各スポットからの散乱光強度を、ビームによって各スポットを手動走査することにより測定する。もしくは、ビームは手動で走査できようし、また各スポットから検出される光は、検出器領域を照射スポットと共焦点に保つ大面積の光検出器または小面積の検出器により検出することができよう。これは自動化することもできよう。多くの試料を分析しようとする場合には、ミクロアレイを幅広い光ビームで照射して、ミクロスポットアレイの像をビデオカメラおよびフレームグラバー(frame grabber)によって定量化することができる。次にソフトウェア画像分析によって各ミクロスポットの強度を求める。我々は、これらの方法が極めて鋭敏で、試料中の幅広い濃度の1つ以上の分析物を検出できることを確めた。当業者はこの方法の多くの他の変形が可能であることを理解するであろう。
ミクロアレイに関する我々の研究において、金属様粒子が好ましい光散乱粒子であることを見出した。特定のミクロアレイ用途に用いられる粒子種の大きさ、形状、組成および均一性は主として次のものによる:試料中の非特定光バックグラウンドの量;ミクロアレイが乾燥しているかまたは液体で被覆されているかどうか;個々の固相結合領域の寸法;検出される分析物の量および濃度範囲;肉眼または光検出器による検出;ならびに粒子計数測定および/または強度測定。
この発見は、本発明が開示したような最適の光および検出法を用いないときでさえも、当該技術の既存の診断検出法において本発明の種々の態様を使用できることを意味する。たとえば、レーザー共焦点顕微鏡検査法、明視野およびエピ照射(epi-illumination)顕微鏡検査法ならびに反射コントラストおよび示差干渉コントラスト顕微鏡検査法を、ある種の金属様粒子とともにミクロアレイチップにおける多重分析物の測定等に用いることができる。
本発明の方法はミクロアレイフォーマットを用いて1つ以上の分析物を検出するためのすぐれた手段を提供する。次の方法は、ある分析用途において有用な補足的変形を提供する。
我々は照明および検出法を小型化して、単一または多重光ファイバーを基盤とする装置をつくることができる。これは検出するためにイメージ化法を用いる方法に代りうる方法を提供する。
当業者は前記の具体例が本発明の可能な多くの変形の極く二三に過ぎないことを理解するであろう。
重要な分子の現在成長しつつある組合せ(combinatorial)合成分野における恐るべき問題は、新たに合成された組合せ分子の数コピー(copies)を検出するための高感度の実際的で使いやすいシグナルおよび検出技術ならびに測定フォーマットの欠除である。
金属様粒子は、適切な物質を被覆すると、たとえば組合せ合成のような化学合成または生化学合成を行うためのすぐれた基質になる。金属様粒子の特定被覆は、たとえばポリマー、抗体、タンパク質、核酸、アミノ酸、反応性化学基等より成ることができる。たとえば、金属様粒子は化学的に反応性あるアミン基を含むポリエチレングリコールで被覆される。次に、金属様被覆粒子表面に多数あるこれらアミン基において合成が開始される。明確に活性化されうる他の反応性化学基をアミン基の代りに用いることができる。別の例では、アミノ酸または小さなペプチドを、金属または金属様粒子表面に直接被覆するか、または金属様粒子表面に被覆されるポリマーまたは他の種類の高分子に化学結合させる。次いで金属様被覆粒子において合成が開始される。さらに他の例では、反応基を金属様粒子表面に結合させて、タンパク質、核酸、化学または生化学合成を行うことができる。粒子表面の反応基の数は次のように変えることもできる。反応性アミン基(または他の反応基)があろうとなかろうと、ポリエチレングリコール化合物(分子量20,000)の混合物を、適当な比率で混合して、粒子当り表面上の所望の数の反応基を達成させる。こうして、金属様粒子を、金属様粒子当り特定量の化学合成サイトまたは結合サイトで被覆する。サイトの特定数および反応基の種類は、たとえば次の化学合成または臨床試薬用のような特定必要性に合うように変えることができる。たとえば、臨床用の用途には、金属様粒子当り控え目な数の特定結合剤分子を加えることが所望の測定性能を得るのに重要であろう。さらに、上記ポリエチレン化合物について記載したと同じアプローチを用い、所望の物質(すなわち種々の結合剤または化学基等)を適当な比率で混合することによって2種類以上の反応性合成または結合サイトの特定量を同じ金属様粒子上に置くことができる。このような被覆粒子は、たとえば同じ粒子を用いて2種類以上の分子を単離し、精製し、さらに検出するのに有効であることができる。高密度(グラム/cm3)の多種類の金属様粒子は、関心のある分子の精製、単離および同定にも多くの利点を与える。MLSP型粒子は媒質内で粒子がさらに容易に処理される別の利点を与える。上記の例はこの方法の多くの可能な変形のわずか数例にすぎない。当業者には他の変形が明らかであろう。
本発明は、粒子の散乱光性能の検出によって、試料中の1つ以上の分析物を検出する方法を特徴とする。本明細書に開示する本発明の種々の態様は、診断分野以外の多くの他の特定用途に直接適用することができることに留意すべきである。当該技術または光学情報および貯蔵、映像形成および処理、電気光学的シグナル変換およびスイッチ、電気通信、情報変換器や多くの他の関連用途のような分野の技術の熟練者はこの開示によって、分析診断測定以外の分野のとりわけ問題を解決して新製品を生成させる本発明の種々の態様を実施することを可能にした。
SpectraMetrix光度計は励起光ビームに対して直角の散乱または放射光である光の強度を測定する直角光度計である。該機器の略図を図21に示す。光源は顕微鏡照明器または他の種類の光源である。この機器はモノクロメーターがあろうとなかろうと使用することができる。光度計には異なる光源を接続するアダプターが備えてある。光電子増倍(PM)管によって散乱または放射光を検出する。光度計には、試料を交換する間、光がPM管に届かないようにする手動光シャッターがある。必要に応じて入射または放射光路に光学フィルターまたは偏波器を挿入する。試料キュベットとして種々の直径の円筒形キュベット(たとえば試験管)を使用する。しかし、適当なホルダーを有する任意の種類の光透過性試料容器を使用することもできる。直径6mmで長さ50mmの試験管を使用し、本明細書に記載したデータを得るのに、赤外線(熱)フィルターのついた顕微鏡照明器を使用した。
a.6×50mmの培養管中の60nm、4×10-12Mの金ゾルを分光器の試料ホルダーに入れる。管の角度を垂直に対して40ないし50°になるように調節する。焦点に合わせた励起光ビームがキュベットの中心を横切るように角度をつけた管を位置ぎめする。励起光を管の前面(集光レンズに対する面)に当てないようにする。これは検出システムの方に反射する光の量が増すからである。
実施例1から10の全ては、粒子からの散乱光、若しくは蛍光性分子からの放射(emitted)光、又はその両方の測定を含有する。かかる光信号を測定するために使用された計器は、前記したスペクトラ メトリクス社製の光度計である。
結果を表6、7及び8に示す。計算は既知の光散乱相関、及び前記した我々が新規に定義した相関を用いて行った。水中の粒子に対する実験的測定は、スペクトラ メトリクス社製の光度計を用いて、所定の照度及び所定の波長における溶液中に遊離している粒子が散乱する光を検出することにより行った。下記の工程を行った;
(a)対照粒子試料及び比較できるサイズの粒子試料に、同じ組成及び強度の入射光を照射する
(b)水を含み、かつ、粒子を含まない対照チューブから放射される光信号を測定する
(c)既知の濃度の粒子を含むチューブから放射される光信号を測定する
(d)(c)の光信号値から(b)の対照光信号値を減ずる
(e)等濃度の金粒子及びポリスチレン粒子から得られる光信号を比較する
結果を表10に示す。同様の光検出方法を、6mm×50mmのガラスチューブ内の全ての試料から放射される光信号を測定するために実行した。金粒子又はフルオレセインの両方から由来する光信号の測定において、光学フィルターは用いなかった。
全ての測定を水中で行った。フルオレセインを含有する溶液のpHは8−9であった。水のみを含有するチューブの光信号値を、フルオレセイン又は金粒子からのみ由来する光信号を得るために、金粒子又はフルオレセインの値から減じた。
粒子からの光信号を測定するために下記の工程を行った;
A(a)同じ組成及び強度の入射光を全ての試料に照射する
(b)水を含み、かつ、粒子を含有しない対照チューブから放射される光信号を測定する
(c)既知の濃度の粒子を含有するチューブから放射される光信号を測定する
(d)(c)の光信号値から(b)の対照光信号値を減ずる
フルオレセインからの光信号を測定するために下記の工程を行った;
B(a)上記と同じ強度及び組成の入射光を試料に照射する
(b)対照チューブから放射される光信号を測定する
(c)既知の濃度のフルオレセインを含有するチューブから放射される光信号を測定する
(d)(c)の光信号値から(b)の対照光信号値を減ずる
C(a)既知濃度の粒子及びフルオレセイン分子から得られた光信号を比較する
結果を表11に示す。かかる結果は入射光強度の違いに対して補正されていない。最大光放射(490nm)がフルオレセインから生じる波長及び最大散乱光が金粒子から生じる波長の単色入射光を用いた。490nmにおける入射光強度は、金粒子に対して用いられた強度と比較して幾分低強度のものであり、520nmにて約86%の強度乃至565nmにて約80%の強度の範囲内である。一方、光電子増倍管の量子効率はフルオレセインの一次放射波長(520nm)において0.34乃至560nmにおいて0.18の範囲内である。
入射波長を除いて、同様の光検出方法を6mm×50mmのガラスチューブ中の全ての試料に対して用いた。金粒子及びフルオレセインの両方に由来する光信号の測定において、光学フィルターを用いなかった。
全ての測定を水中で行った。フルオレセインを含有する溶液のpHは8-9であった。水のみを含有するチューブの光信号値を、フルオレセイン又は金粒子からのみ由来する光信号を得るために、金粒子又はフルオレセインの値から減じた。
粒子からの光信号を測定するために下記の工程を行った;
A(a)水を含有し、かつ、粒子を含有しない対照チューブから放射される光信号を測定する
(b)既知の濃度の粒子を含有するチューブから放射される光信号を測定する
(c)(b)の光信号値から(a)の対照光信号値を減ずる
フルオレセインからの光信号を測定するために下記の工程を行った;
B(a)対照チューブから放射される光信号を測定する
(b)既知の濃度のフルオレセインを含有するチューブから放射される光信号を測定する
(c)(b)の光信号値から(a)の対照光信号値を減ずる
C(a)既知濃度の粒子及びフルオレセイン分子から得られた光信号を比較する
結果を表12に示す。かかる結果は入射光強度の違いに対して補正されていない。
全ての試料に単色入射光を照射した。粒径が100nmである金粒子には、粒子からの最大光散乱が発生する近傍の波長の入射単色光を照射した。ポリスチレン−フルオレセイン化合物粒子の試料には、最大フルオレセイン励起光が発生する波長(490nm)の単色入射光を照射した。かかるフルオレセイン化合物に対する最大フルオレセイン放射は515nmで発生する。490nmにおける入射光強度は555nmにおける入射光強度の約80%であった。光電子増倍管の555nmにおける量子効率は515nmにおける量子効率の約60%であった。
A(a)水を含有し、かつ、粒子を含有しない対照チューブから放射される光信号を測定する
(b)既知の濃度の粒子を含有するチューブから放射される光信号を測定する
(c)(b)の光信号値から(a)の対照光信号値を減ずる
フルオレセインからの光信号を測定するために下記の工程を行った;
B(a)対照チューブから放射される光信号を測定する
(b)既知の濃度のフルオレセインを含有するチューブから放射される光信号を測定する
(c)(b)の光信号値から(a)の対照光信号値を減ずる
C(a)既知濃度の粒子から得られた光信号を比較する
結果を表17に示す。血清はバイオウィッタカー社(ウォーカービル、メリーランド)から購入した。かかる血清は、購入の前に1ミクロンのフィルターを通してろ過されており、わら色の外観であった。フルオレセインの測定に対して、血清をpH9乃至はpH9.5に調節した。金粒子を含有する溶液に、粒子からの最大光散乱が発生する波長である、543nmの単色入射光を照射した。フルオレセインを含有する溶液に、最大フルオレセイン励起が発生する490nmの入射光を照射した。
入射波長を除いて、同様の光検出方法を、6mm×50mmのガラスチューブ内の全ての試料について用いた。金粒子若しくはフルオレセイン粒子両方からの光信号を測定する際に、光学フィルターは用いなかった。
測定は、一定濃度の血清中で行った。フルオレセイン又は金粒子由来の光信号のみを得るために、フルオレセイン若しくは金粒子の光信号値から適切な濃度の血清のみを含有するチューブの光信号値を減じた。
粒子からの光信号を測定するために下記の工程を行った;
A(a)適切な濃度の血清を含有し、かつ、粒子を含有しない対照チューブから放射される光信号を測定する
(b)既知の濃度の粒子を含有するチューブから放射される光信号を測定する
(c)(b)の光信号値から(a)の対照光信号値を減ずる フルオレセイン溶液からの光信号を測定するために下記の工程を行った;
B(a)対照チューブから放射される光信号を測定する
(b)既知の濃度のフルオレセインを含有するチューブから放射される光信号を測定する
(c)(b)の光信号値から(a)の対照光信号値を減ずる
C(a)既知濃度の粒子から得られた光信号を比較する
結果を表18に示す。フルオレセインの測定に対して、フルオレセイン含有試料から放射された光信号を、光電子増倍管に衝突させる前に、コダック社製No.16ラッターフィルターに透過させた。フルオレセイン溶液からの最大光強度は、入射単色波長が498nmの場合に観測され、金粒子からの最大光散乱は554nmの場合に観測された。金粒子又はポリスチレン粒子からの光信号を測定する際には、光学フィルターを用いなかった。フルオレセインの測定に対して、血清のpHを約pH9に調節した。
入射波長を除いて、同様の光検出方法を、6mm×50mmのガラスチューブ内の全ての試料について用いた。血清については実施例7に記載した。
測定は、一定濃度の血清中で行った。フルオレセイン又は金粒子由来の光信号のみを得るために、金粒子若しくはフルオレセインの光信号値から適切な濃度の血清のみを含有するチューブの光信号値を減じた。
粒子からの光信号を測定するために下記の工程を行った;
A(a)適切な濃度の血清を含有し、かつ、粒子を含有しない対照チューブから放射される光信号を測定する
(b)既知の濃度の粒子を含有するチューブから放射される光信号を測定する
(c)(b)の光信号値から(a)の対照光信号値を減ずる
フルオレセイン溶液からの光信号を測定するために下記の工程を行った;
B(a)対照チューブから放射される光信号を測定する
(b)既知の濃度のフルオレセインを含有するチューブから放射される光信号を測定する
(c)(b)の光信号値から(a)の対照光信号値を減ずる
C(a)既知濃度の粒子から得られた光信号を比較する
結果を表19に示す。測定は、一定濃度の血清中で行った。ポリスチレン又は金粒子由来の光信号のみを得るために、金粒予若しくはポリスチレンの光信号値から適切な濃度の血清のみを含有するチューブの光信号値を減じた。光学的ろ過は行わなかった。 粒子からの光信号を測定するために下記の工程を行った;
(a)適切な濃度の血清を含有し、かつ、粒子を含有しない対照チューブから放射される光信号を測定する
(b)既知の濃度の粒子を含有するチューブから放射される光信号を測定する
(c)(b)の光信号値から(a)の対照光信号値を減ずる
(b)既知濃度の粒子から得られた光信号を比較する
入射波長を除いて、同様の光検出方法を、6mm×50mmのガラスチューブ内の全ての試料について用いた。血清については実施例7に記載した。
結果を表20に示す。95.7%濃度の血清は透明なわら色であり、1センチメートルの透過長、543nmの入射光波長において、0.14の吸光度を有する。光散乱測定は、内径5mm、6mm×50mmのガラスチューブ中で行った。波長が543nmの入射光及び散乱光両方の吸収の差を基準として、血清試料中に存在する金粒子からの光散乱信号は、水中に存在する同じ濃度の金粒子からの信号のおよそ80%であった。本実施例において光学フィルターは用いなかった。
下記の実施例を行った;
(a)全ての試料に同じ組成と強度の入射光を照射した。
(b)水又は適切な濃度の血清を含有し、かつ、粒子を含有しない対照チューブから放射される光信号を測定する
(c)既知の濃度の粒子を含有するチューブから放射される光信号を測定する
(d)(c)の光信号値から(b)の対照光信号値を減ずる
(d)既知濃度の金、血清及び水から得られた光信号を比較する
2.5mlの滅菌した水を0.1グラムのHAuCl4・3H2Oに加えて4%のHAuCl4・3H2O溶液を形成した。かかる溶液を遠心分離器にかけ粒子物質を除去した。別のフラスコにおいて、10mlの滅菌した水を0.1グラムのクエン酸ナトリウムに加えて1%のクエン酸ナトリウム溶液を形成した。かかるクエン酸塩溶液を0.4μのポリカーボネイト膜フィルターを通してろ過し、粒子物質を除去した。非常にきれいな250mlの三角フラスコに、100mlの滅菌水と0.25mlの4%HAuCl4・3H2Oを加えた。かかるフラスコを、設定を4にした熱攪拌器上に置き、100mlのビーカーで覆った。混合物が沸騰を始めたときに、2mlの1%のクエン酸ナトリウムを加えた。かかる溶液は、クエン酸塩を加えた後、1分以内に黒変した。かかる溶液は続いて紫色へと変化し、最終的には濃赤色となった。かかる赤色への変化は、クエン酸塩を加えた後、約2分後に達成された。かかる混合物の溶液をさらに30分間攪拌し、続いて室温へと冷却し、並びに総体積を100mlにするために滅菌水を加えた。最終的な金濃度は約0.005%であり、並びに粒子濃度は、全ての金の塩が金粒子に変換されたと仮定して、1.2×1012粒子/mlであった。
1グラムのPEG化合物(MW 20000)を100mlの滅菌水に加えて1%のPEG化合物溶液を形成し、かかる溶液を50mlの注射器を用いて0.4μのポリカーボネイト膜でろ過した。所定の体積の粒子を安定化させるために、かかる体積の粒子溶液を1%のPEG化合物溶液に加え、最終的なPEG濃度を0.1%にした。
10mlの滅菌水を30mlのビーカー中で沸騰させる。次に2ミリグラムのゼラチンをゆっくりと加え、かかる溶液を攪拌しながら全てのゼラチンが溶解するまで煮沸を続けた。かかる溶液を次に室温へと冷却した。2mlの47%クエン酸塩pH5緩衝液を加えた。5nm金粒子を含有する0.18mlの溶液(約0.005%の金濃度、3.8×1013金粒子/ml)を、3mlの5.7%ヒドロキノン溶液の添加によって流し込むことにより加えた。かかる混合物を良く混合した後、滅菌水を加えることによって最終的な体積を20mlとした。50μlの4%乳酸銀溶液を10μlずつ加え、かかる混合物を手で素早く攪拌した。最終的な銀濃度は約0.005%であり、最終的な銀被覆粒子濃度は約3.4×1011粒子/mlであった。添加した全ての銀が各々の金粒子に等しく被覆したと仮定すると、粒径は30nmであると計算される。最後の添加の後、かかるゾルは室内光の下で明るい黄色を呈色する。バルク溶液において、6mm×50mmのガラスチューブ中の少量のゾルによって散乱された光は、白色光の狭いビームによって照射された場合、青色を呈色する。10倍の対物レンズと12.5倍の接眼レンズを用いて、DLASLPD条件下、スペクトラ メトリクス社製顕微鏡で、銀のゾル希釈液をを顕微鏡的に試験した場合、異なる色の明るい粒子の混合物が容易に観測された。かかる粒子の内で多数を占めるのは、紫がかった青色の粒子であった。黄色、緑色及び赤色の粒子もまた存在した。本明細書中の実施例において用いられている粒径5nmの金粒子の濃度を調節することにより、粒径が20nm乃至100nmの範囲の銀被膜粒子を調製した。
実施例13に記載されている希釈された銀粒子のゾルの小滴(small drop)のを顕微鏡ガラススライドの上に置き、カバーガラスで覆うことにより、カバーガラスと顕微鏡スライドとの間に非常に薄いゾルのフィルムを形成した。薄い銀のゾルフィルムのスポットを非常に狭い光のビームによって照射し、入射光が目に入らない角度から肉眼で観察した場合、照射スポットに青色の散乱光が認められる。次に銀のゾルフィルムを、DLASLPD条件下、10倍の対物レンズと12.5倍の接眼レンズを用いて光学顕微鏡で顕微鏡的に調べた。数分の間に、ほとんどの粒子がガラススライド及びカバーガラスに付着し固定されるのが観測された。青色の粒子の量が最も多かった。次に、細い探針の先端でカバーガラス上の点を加圧した場合、加圧された領域の粒子の色が、元来の青色から永続的に変化した(散乱光検出)。加圧された領域の中心においては、粒子は赤色であった。かかる中心点は、複数の異なる色の同心円によって囲まれていた。中心から外に向かって、赤色から緑色、黄色、青色へと変化していた。赤色、緑色及び黄色の粒子は非常に明るい色であった。我々が行った理論計算によると小さい銀粒子が青色を呈色することが示唆されている。加圧の効果は、粒子の形状を変化させることであると思われる。我々の結果は、それゆえに、小さい銀粒子はその形状を変えることによって、元来の青色の散乱光色を他の散乱光色へと変換することができるということを示すものである。カバーガラスを除去することにより、加圧された領域の色の異なる粒子を液相へと分散させることができることを見出した。かかる液相において、かかる粒子はブラウン運動を行い、緑色及び赤色の粒子によって散乱される光は明滅するが、この事実からかかる粒子は非球形粒子であることが期待される。
24mgのヒドロキシルアミンを1mlの滅菌水へ加え、混合し、次に10mlの注射針に取り付けられている4μのポリカーボネイト膜フィルターを通してろ過することにより、ヒドロキシルアミン塩酸塩の2.4%溶液を調製した。2.5mlの滅菌水を試験管中の0.1gのHAuCl4・3H2Oに加え、混合し、次に遠心分離器にかけて粒子物質を除去することにより、4%のHAuCl4・3H2O溶液を調製した。25mlの滅菌水を250mlの三角フラスコに加え、続いて表1に示してある望ましい粒径における体積の16nmの金粒子を加えた。次に、表1に記載されている体積の4%HAuCl4・3H2O溶液を加えた。最後に総体積を100mlにするために滅菌水を加えた。ここで、表1に記載されている体積のヒドロキシルアミン塩酸塩溶液を素早く手で攪拌しながら加え、かかる混合物を30分間放置した。ヒドロキシルアミン塩酸塩溶液を加えて数分の内に、透明でわずかにピンク色であった溶液の色は、最終的な透明な赤色又はくすんだ茶色へと粒径によって変化した。より小さい粒径が赤色の溶液を与える。
より大きい粒径の粒子を、前記の方法と同じ方法に従い、しかしながら表2に記載の溶液の体積を用い、及び16nmの金の溶液の代わりに100nmの粒径の金粒子溶液を用いて調製した。
25mlの滅菌水を250mlの三角フラスコに加え、続いて6.4mlの0.005%16nm金粒子のゾルを加え、生じた溶液を混合した。0.234mlの40mg/mlであるL(+)乳酸銀溶液を次に加えた。深い紫色がただちに観測された。続いて十分な量の滅菌水を加えて総体積を100mlにした。手で素早く攪拌している間に、1.25mlの24mg/mlであるヒドロキシルアミン塩酸塩溶液を加えると、生じたゾルの色は銀色がかったラベンダー色であった。少量のゾルをガラススライド上にのせ、DLASLPD条件下で光学顕微鏡を用いて試験した。赤色、緑色、紫色、及び黄色の粒子が観測された。試験管中のかかる粒子の希釈溶液中における白色光照射による散乱光は、氷のような青であった。
種々の組み合わせの粒子についての信号及び検出媒介変数、並びに、固相アッセイのように固相上の粒子検出するための照射方法及び検出方法を調査するために、モデルシステムを設定した。
かかるシステムは、第一に牛の血清アルブミン(bovine serum albumin(BSA))によるガラススライドの被覆、及び次に、媒介変数を調査するための前記の領域における異なる量の金粒子の沈着(deposit)を含む。本実施例中において、スライドをBSAによって被覆するために用いた方法について議論する。
1.5gのBSAを15mlの滅菌した超純水に加え、混合し、次に0.44mmのポリカーボネイト膜でかかる溶液をろ過することにより10%のBSA水溶液を調製した。20μlの10%BSA溶液を10mlの滅菌水に加え及びかかるBSA溶液を0.4mmのポリカーボネイト膜でろ過することにより、0.02%のBSA(200μg BSA/ml)溶液を調製した。
通常の顕微鏡ガラススライドは、メタノールに浸したブラシでこすり洗いをすることにより洗浄した。かかるスライドは、ブラシをかけた後、洗浄びんを用いて滅菌水をかけることにより続いて洗浄した。ガラススライドは、スライドを0.02%のBSAを含有するビーカー内の滅菌水中にに沈め、1時間インキュベートすることにより、BSAで被覆した。次にスライドをビーカーから取り出し、洗浄びんの滅菌水ですすいだ。スライドの両方の面をすすいだ。次に、かかるスライドを滅菌水で満ちた150mlのビーカーに約10分間沈めた。かかるスライドを滅菌水で再びすすいだ。遊離のBSAは被覆したスライドに金属粒子が結合するのを妨げるため、スライドから遊離のBSAを除去するのは最も大切なことである。次に、かかるBSA被覆ガラススライドを乾燥し、清潔なプラスチックの箱の中で保管する。
小さな円を(直径約8mm)、金粒子が沈着する領域を印づけるために、ダイアモンド画線器を用いてBSA被覆ガラススライド上に刻んだ。望ましい金粒子濃度の無保護金粒子溶液3μlを、スライド上の一つの印づけた領域に沈着させる。かかる金粒子溶液を、金粒子と刻んだ印との相互作用を防ぐために、実際に刻んだ印の反対側に沈着させる。
金粒子密度が規則正しく減少している金粒子の一連のパッチをガラススライド上に調製するために、スライドの中心線上に一連のパッチを作ることが望ましい。かかる配列を達成するために、自家製のホルダー上にスライドを置くことによって、正しい配列で金のパッチを沈着させることができる。かかるパッチは室内灯では観測できないと言うことを言及しておかなければいけない(つまり、粒子密度が低いために室内灯の下では呈色しないのである)。そこで、パッチの位置を認識するために、スライドの横に印し付けをする。かかる印は、粒子を沈着させる際に付けられる。粒子のパッチを形成するために、望ましい金粒子濃度に希釈された無保護金溶液3μlを沈着させる。次に、かかるスライドを密閉されたプラスチックの箱の中に所定の時間インキュベートする。かかる箱の内壁と底を、スライド上の金のゾルが蒸発するのを防ぐために、湿ったペーパータオルで覆っておく。かかるスライドを取り出し、パスツールピペットを用いて滅菌水ですすぐ。スライド上のBSAに対する金粒子の最も効果的な結合を達成するために、金粒子溶液のpHはBSAのpI(pI=4.58−5.45)に対して調節するべきであるということが分かった。
下記の溶液を調製した。2mgのBSA−ビオチンを2mlの滅菌水に加え500ml三角フラスコ中の蒸留した水に対して数時間室温で透析することによって1mg/mlのBSA−ビオチン溶液を調製した。かかる水を四回交換した。最後の交換には滅菌水を用いた。20mMのトリスサリン、0.1%のPEG化合物、0.02%のアジ化ナトリウムpH7.4緩衝液もまた調製した。全ての溶液を0.4μポリカーボネイト膜フィルターを通してろ過した。ポリスチレン試験管を、洗浄びんを用いて滅菌水でしっかり洗浄し、60mm粒径の金の粒子溶液4mlで満たし、医療用遠心分離器で30分間遠心分離した。
次にかかる粒子を前記の方法で洗浄した。柔らかいペレットを10mlの滅菌水に再懸濁させた。
金粒子溶液のpHを下記のように調節した:1%PEG化合物の溶液100μlをきれいなポリカーボネイトチューブに加えた。かかるチューブに、60nmの金のゾル1mlを加え、2分間そのままにしておいた。0.02MのK2CO3を、pH6.6が達成されるまで2μlずつ金のゾルに加えた。pHを調節するために必要な0.02MのK2CO3のμl数を、残りのml数の金のゾルに0.02MのK2CO3を加えるために計算して加えたが、この場合は80μlであった。pH6.6の金のゾル9.5mlを、ポリカーボネイト中の1mg/mlのBSA−ビオチン溶液1.15mlに加え、室温にて5分間インキュベートした。次にかかる溶液を医療用の遠心分離器で30分間遠心分離し、上澄みを取り出した。生じた柔らかいペレットを3mlの滅菌水に再懸濁させ、次に前記した方法で遠心分離し、上澄みを取り出し、並びに0.1%のPEG化合物溶液に再懸濁させ、再び遠心分離した。上澄みを取り出し、ペレットを20mMのトリスサリン、0.1%のPEG化合物溶液に再懸濁し遠心分離した。次に上澄みを取り出すと、200μlの柔らかいペレットが得られた。50μlのかかる溶液を、80μ粒径のねじれアビジン(streptavidin)のスポットを含有するプラスチックのくぼみ(well)に加え、かかるくぼみを湿気のある箱の中で一晩インキュベートした。次に、かかるくぼみを、くぼみから水を流しとるために、パスツールピペットを用いて滅菌水で数回洗浄した。顕微鏡で検出するために、かかるくぼみを60μlの滅菌水で満たした。
BSA−ビオチン−金結合剤(60nm粒径の金粒子)を、くぼみの底表面に80μm粒径ねじれアビジンのスポットからなるマイクロアレイを含有するプラスチックのくぼみに加えた。適切なインキュベート時間の後、かかるくぼみを洗浄し、及び我々が開発した光学顕微鏡システムを用いてDLASLPD条件下で観測した。BSA−ビオチン−金で標識された粒子が個々の80μ個別スポットと結合しているのを観察した。粒子を添加する前は見えなかった80μねじれアビジンスポットが、明るいはっきりとした円形のスポットとして現れた。BSA−ビオチン−金粒子の異なる表面密度で含有する個々のスポットを、異なるインキュベート時間又は異なるBSA−ビオチン−金濃度を用いることによって得た。約200倍の倍率で我々の顕微鏡を用いることにより、低結合密度でねじれアビジンスポットに結合している個々の粒子を、容易に肉眼で検出することができた。カウント、及び個々の80μスポットからの積分光強度の測定を自動化するために、ビデオ画像処理ソフトウェアの使用を試み、かかるソフトウェアはサンディエゴのとある会社から24時間契約で借りた。ビデオ画像の取り込みは廉価な白黒ビデオカメラ、ビデオフレーム取り込み器及び単純なデスクトップコンピューターの画像を用いて行い、かかる画像はアレイデバイスくぼみ中の25の個々のスポットを含有する。かかるソフトウェアは、個々のスポットの積算光強度を測定できただけではなく、個々のスポットあたりの粒子の数も測定できた。例えば、低密度のBSA−ビオチン−金結合材で標識された一つのねじれアビジンスポットを、粒子カウントモードを用いてビデオ画像システムで分析することができた。バックグラウンドの信号についていくらかの情報を得るために、ねじれアビジンで被覆されていない固相領域の80μ粒径のスポットを、バックグラウンドを決定するために分析した。かかる予備的なモデルシステムにおいて、信号/バックグラウンド比は、スポット上の標識密度が約0.06粒子/μm2で、最適化されていない照射条件及び検出条件の場合において、317/25−13であった。かかる最適化されていない予備的なデータに基づいて、かかるデータは、信号/バックグラウンド比が3/1の場合、0.015粒子/μm2の粒子密度が検出可能であるということを示す。より最適化された条件下において、より低い感度レベルがさらに低くなるかもしれない。
60nmの金のゾルを10倍に希釈し、及び各々20μlの希釈液をスポットとしてBSA被覆スライド上に沈着させた。次に、カバーガラスをかけていないかかるスライドをポロプリズム上に浸積油と共にのせた。各々の金のゾルスポットの直径は約4mmであった。下記の表に各々のスポットにおける適切な情報を記載する。
h=V/A
ここでVはスポット中の液体の体積を表し(20ml=0.02cm3)、Aはスポットの面積(単位はcm2)を表す。A=1.2cm2を用いると、h=0.016cm=160nmとなった。かかる高さは、肉眼又は電気的及び光学的検出方法の深さの範囲より小さいため、各々のスポットはあたかも全ての粒子がスライドの表面にあるかのようにふるまい(幾何学の視点から)、並びに、表において報告されている感度は、表面に沈着した粒子に対する感度と類似するものである。
一連の60nm金粒子溶液の希釈液を形成し、3μlの各々の希釈液を小さなスポットとしてBSA被覆スライド上に沈着させた。かかるスポットは同一のスライド上で一列に並んでいた。かかるスライドを湿気のある箱の中に6.5時間インキュベートし、続いて滅菌水ですすいだ。各々のスポット上の粒子密度を、DLASLPD条件下で光学顕微鏡を用いて粒子をカウントすることにより決定し、かかる顕微鏡は較正された網線のある接眼レンズを備えていた。下記の表に結果を示す。
2組のの3.4×10-12M(0.005%の金)60nmの金のゾルの希釈液を調製し、各々の希釈液2mlをガラススライド上の個別のスポット中に沈着させた。各々のスポットの直径は約4mm(領域=6.28×106m2)であった。異なるスポットを、同じスライド上の中央に一列に並べて位置づけた。各々のスポットの粒子濃度及び密度を下記の表に示す。
肉眼で検出できる散乱光強度における最低粒子密度を決定するために、浸積油を用いてスライドをポロプリズム上に置いた。まだ液体状態である各々のスポットに、ファイバーの末端に10倍の対物レンズを有するボシュロム社製の照明器からの光を連続的に照射した。照射器によって作られたスポットの直径は約4mmであった。暗室において、夜において、0.0385の密度まで観測することができたが、後者の場合はかすかに見ることができたのみであった。
60nmの金のゾルの異なる希釈液を、異なるイムロンくぼみ(Immulon Wells)中に置いた(各々のくぼみ中に200μl)。散乱光強度を測定するために、くぼみの底を、10倍の対物レンズを装備しているレイカ社製の顕微鏡照射器で照射した。かかるくぼみの底は対物レンズから数nmの距離にあった。対物レンズからの光は、くぼみの中心に焦点を合わせられたビームを生じさせる。かかるビームの、焦点における直径は約5mmであった。散乱光を、くぼみの横壁からの光を検出するように位置づけられた光ダイオードによって検出した(直角における検出)。散乱光を、バックグラウンドの光検出を制限するために光ダイオードの前に位置づけられた小さな穴(直径約1mm)を通して検出した。異なる金のゾルの希釈液を含有するくぼみをお互いに結びつけ、並びに各々のくぼみを、照射光路及び検出光路において連続した位置に位置づけることができた。光ダイオードの出力を、電流モードにおいて作用する演算増幅器を用いて測定した。演算増幅器のフィードバック抵抗は増幅器の感度を決定する。光ダイオードは光起電力モードで作用された。2組の60nmの金の希釈液を調製し、光ダイオードを用いてその強度を測定した。
11倍の希釈液(3.4×10-11)を2倍ずつ希釈した。結果を下記に示す。
上記の結果により、くぼみ中では、60nmの金粒子を1.9×10-11乃至1×10-13の範囲で検出できることが分かった。より上の範囲も測定できるかもしれない。
0.005%金(60nm)溶液の2倍希釈液3μlを、BSA被覆スライド上の5個のスポット各々に沈着させた。かかるスライドを5分間インキュベートし、次に150mlの蒸留水を含有するビーカーへ導入した。かかる水により、結合していない金がスライドから洗い除かれた。次に、我々が開発した照射器(スペクトラ メトリクス社製白光照射器)を用いて、スポットに照射を行った。各々のスポット中の金粒子は、環を形成し(すなわち、粒子は均一に分散するのではなく環の範囲に閉じこめられた)、かかる環は緑色光を散乱し、暗室においても肉眼ではっきりと観測することができた。
金のドットをインキュベートしている間、金粒子スポット中の液体を攪拌するために指を用いてスライドの横側を静かにたたくという点を除いて、新規に被覆したBSAスライドを用いて繰り返して実験を行った。5分後、かかるスライドをビーカー中の150mlの滅菌水へと導入し、各々のスポットによって散乱される光を、順番にスペクトラ メトリクス社製白光照射器を用いて観測した。かかる照射器は、スライド上に直径約5mmである光の点を生じさせた。金のゾルが沈着した場所の散乱光を通して、金のスポットをはっきりと観測することができた。水につけたスライドについてのスポットを観測すると、スライドの不完全性により散乱光は減少していた。全てのスポットは緑色光を散乱し、視覚検出による評価においてほぼ同じ強度であった。小さい、光を散乱しない点(暗点)が各々のスポットの中心に現れた。
6個の8mm×50mm(1.6ml)ポリスチレンチューブを、洗浄びん中の滅菌水ですすぐことにより洗浄した。過剰の水を、チューブを振ることにより各々のチューブから除去したが、チューブの乾燥は行わなかった。次に、金粒子溶液(60nm、0.005%)を連続的に1、2、4、8、16及び32倍に希釈した。各々のチューブは500mlの金粒子溶液を有した。かかる希釈された金のゾルはポリスチレンチューブ中で安定であった(散乱光の色が放置しておいても変化しなかった)。凝集(aggregation)が起こったという証拠は見受けられなかった。異なる希釈液から散乱される光の色は下記の様であった。金粒子を非安定化させると思われる塩(かかる塩は金のゾルを形成するために用いられた)を取り除くために、滅菌水を用いて、かかる観測に用いられた金のゾルを数回洗浄した。
1%のNaClによって引き起こされる凝集(aggregation)に対して、1mlの60nm、0.005%の金のゾルを安定化させるために、900mgのBSAが必要であることを見出した。
本実施例において、異なる表面密度(25粒子/μ2乃至100粒子/μ2)の金粒子をガラススライド上に沈着する方法を示す。本実施例中のスポットは、実施例30及び31において、裸眼及びDLASLPD法を用いて光学顕微鏡で観測される、かかるスポットから散乱される光(白色光散乱)の強度、色及び均一性を決定するために用いられる。
60nmの金のゾル(0.005%、3×1010粒子/ml)4mlを、医療用の遠心分離器を用いて、最大速度にて、全ての金粒子がチューブの底に沈降するまで(約30分間)遠心分離した。上澄みを取り除き、柔らかいペレットを1、2、及び4倍に希釈した。かかる柔らかいペレットは、3×1011粒子/mlの粒子濃度を有すると見積もられた。各々の希釈液4mlをBSA被覆ガラススライド上の個別のスポットに沈着させ、各々のスポット中の液体を室温にて蒸発させた。各々のスポットに沈着した粒子の数(1倍希釈の金のゾルが3×1011粒子/mlであると仮定した)を下記の表に示す。ここで、60nm粒子(粒子で飽和した単層)によって達成されうる最大粒子密度が、354粒子/μ2であることを言及しておかなくてはならない。
本実施例において、実施例29に記載の方法で調製された金粒子スポットを、DLASLPD照射を用いて視覚的及び顕微鏡的に試験する。かかるスポットは乾燥されており、金粒子はそれゆえに空気中にさらされている。
a 1倍希釈スポット
室内灯下において、スポットは暗い紫色を呈色し、粒径1mm未満のより明るいスポットを中心に有する。DLASLPD照射下において、かかるスポットはかなり均一な白っぽいオレンジ色を呈色した。かかるスポットは非常に濃色であった。顕微鏡のDLASLPD条件下では(10倍の対物レンズ、特別な2倍拡大、12.5倍の接眼レンズ)、接眼レンズを通して観測されるスポットは、非常に濃いオレンジ色を呈色した。個別の粒子を容易に観測することができた。幾つかの粒子は、互いに非常に近接した位置に存在するか、又は重なり合っていた。大多数の粒子はオレンジ色であるが、緑色の粒子も存在する。顕微鏡の空間的分解能未満で互いに離れている2つ又は3つ以上の粒子は、1つの粒子として観測された。粒子間の空間がその光散乱特性を摂動させるほど十分に近接している場合、かかる粒子群は、1つの粒子が呈色する色とは異なる色を呈色する1つの粒子に見える。粒子密度が高い場合、理論計算から、多くの粒子が顕微鏡の分解能より小さい距離しか離れずに分散されるであろうことが期待される。10倍又は20倍の対物レンズで観測する限り、スポットの観測のされ方に大きな相違はなかった。スポットの外側であるスライド上の領域(バックグラウンド)は、濃色のスポットと比較して非常に暗かった。2.5倍の対物レンズを用いると、スポット全体を観測することができた。かかるスポットは濃いオレンジ色であり、その周囲には小さな緑色の輪が見受けられた。スポットの色は、オレンジ色の領域中においてかなり均一であると観測されるが、幾つかのパッチが他のパッチより明るく見受けられる。緑色の輪における粒子の表面密度は、オレンジ領域の密度よりかなり低い。
室内灯下において、スポットは中程度の濃度の紫色を呈色し、粒径約2mmの濃い紫色のスポットを中心に有する。DLASLPD照射下において、かかるスポットはかなり均一な白っぽい黄色を呈色した。かかるスポットは非常に濃色であった。光学顕微鏡においてDLASLPD条件下では(10倍及び20倍、の対物レンズ、特別な2倍拡大、12.5倍の接眼レンズ)、接眼レンズを通して観測されるスポットは、非常に濃いオレンジ色を呈色したが、かかる色は1倍希釈における色ほど均一ではなかった。緑色がかったパッチが見受けられる。非常に近接した位置に存在する粒子が観測された。大多数の粒子はオレンジ色であるが、緑色のパッチ中に多量に存在する緑色の粒子もいくらか見受けられた。10倍又は20倍の対物レンズで観測する限り、スポットの観測のされ方に大きな相違はなかった。スポットの外側の領域は、濃色のスポットと比較して非常に暗かった。2.5倍の対物レンズを用いると、スポット全体を観測することができた。かかるスポットは濃いオレンジ色であり、その周囲には小さな緑色の輪が見受けられた。スポットの色は、オレンジ色の領域中においてかなり均一に見受けられるが、幾つかのパッチが他のパッチより明るく見受けられる。かかる非均一性は、最適化されていない照射システムの不均一性に幾分影響を受けている。
室内灯下において、スポットは非常に明るい紫色を呈色し、小さな暗いスポットを中心に有する(粒径約1mm)。DLASLPD照射下において、かかるスポットはかなり均一な白っぽい緑色を呈色した。かかるスポットは非常に濃色であった。光学顕微鏡においてDLASLPD条件下では(10倍の対物レンズ、特別な2倍拡大、12.5倍の接眼レンズ)、接眼レンズを通して観測されるスポットは、非常に非均一であり、かかる非均一性はおそらく非一様な溶媒の蒸発に由来するものである。スポットの中心においては、非常に濃いオレンジ色又はラベンダー色が見受けられる。かかる中心領域において、粒子は非常に近接した位置に存在するか又は重なり合っており、ここでほとんどの粒子はオレンジ色を、及び幾らかの粒子は緑色を呈色している。中心から離れると、スポットは緑色を呈色するようになり、多数の緑色の粒子と幾らかのオレンジ色の粒子が見受けられるようになった。中心から外周へ向かっていくと、緑色と黄色の別の輪が存在する。スポットの外側は(バックグラウンド)、濃色のスポットと比較して非常に暗い。2.5倍の対物レンズを用いることにより、スポット全体を観測することができる。かかるスポットは卵形の外観であり、中心にオレンジ色又はラベンダー色のスポット(直径約1.5mm)を有する。かかる中心は、別の緑がかった黄色及び緑色の濃色の輪によって囲まれている。外周の小さな輪の色はさほど濃くなく(しかしそれでも濃い)、はっきりとした緑色である。かかる外周領域において、ほとんど全部の粒子が緑色の粒子であり、40倍の対物レンズ及び特別な2倍拡大を用いてカウントすることができた。緑色粒子領域における粒子表面密度は、約20粒子/39.1μ2又は約0.5粒子/μ2であった。ほとんど外周に近くなると、粒子カウントは急速に減衰し、約7粒子/100μ2又は約0.07粒子/μ2しか観測されなかった。かかるスポットにおける粒子の傾斜によって、約1粒子/μ2のカウント限界まで粒子をカウントすることができた。
a 上記に記載の方法により、小さい(4mm)スポット上に高表面密度で金粒子を沈着させることができる。スポットを形成する際に用いる蒸発工程から期待されるように、室内灯で観測した場合、沈着は完全に均一にはならない。
b 光学顕微鏡におけるDLASLPD条件下において、1倍及び2倍の希釈液スポットはかなり均一である。4倍の希釈液に対しては、スポットは幾分不均一性を示す。
c スポットの粒子密度は、粒子カウントを意義のあるものにするには高すぎるようである(個々の粒子を識別するには粒子同士が近すぎる)。しかしながら、4倍希釈スポットの外周においては、粒子をカウントすることができ、かかる領域における密度はおよそ0.5粒子/μ2であった。かかる粒子密度は、我々の顕微鏡の分解能でカウントしうる最大粒子密度に近いものである。
ビーカー中の150ml無菌水に実施例30で使用するスライドを沈めた。粒子はスライドからはがれないようであった。10倍の対物レンズを備えた顕微鏡の照明を使用して、沈めたスライド中の金スポットが狭いビームの光で各々別々に照射できた。スポットの色は(肉眼で観察して)空気から水に入って行っても変化しないように見えた。ガラススライドをビーカーの水から取りだし、カバーガラスで覆った。水の薄膜が金粒子を囲んだ。顕微鏡により、次のように観察された。
対物レンズ2.5倍、補助拡大レンズ1.25倍および接眼レンズ12.5倍にした光学顕微鏡を用いてDLASLPD条件下で観察すると、スポットはほぼ均一のオレンジラベンダー色の外観であった。スポットの周囲は明るい、黄緑色の粒子を含んでいた。周囲の粒子は、10倍〜40倍の対物レンズで容易に観察できた。粒子の表面密度はスポット全体にわたって非常に高く、周囲においてさえ高かったが、縁際の非常に細い環の部分では個々の粒子が明るい対象物として容易に観察できる。
2.5倍の対物レンズおよび1.25倍の補助拡大レンズを使用して12.5倍の接眼レンズにより、全体のスポットを観察できた。スポットは全体にわたって非常に強力な黄色であり、ほぼ均一に見えた。スポットのほとんどは黄色であったが、縁に向かってスポットは黄緑色となった。40倍の対物レンズおよび1.25倍の補助拡大レンズを用いて、非常に高表面密度の粒子を観察できた。粒子のほとんどは黄緑色であった。少数は緑色〜赤色であった。スポットは、縁では粒子密度が非常に急速にゼロに落ちる(暗色の背景)以外は非常に顕著に均一な強度であった。間に暗色空間がある個々の粒子は、粒子表面密度が低い縁において容易に観察でき、計数できた。
全体スポットを、2.5倍対物レンズと1.25倍補助拡大レンズを用いて観察できた。スポットは非常に強烈な黄緑色であり、色は非常に均一であり、スポットが多くの緑色の斑点であった空気中の観察と対照的であった。個々の粒子は、40倍の対物レンズおよび1.25倍の補助拡大レンズを用いて容易に観察できた。水中の粒子は空気中よりも強力または鮮明であった。周囲の粒子は主要部分が緑色でないが、しかし水中で最も多い粒子が黄緑色であり、いくらかが赤色およびオレンジ色であった。スポットの大部分は、非常に強烈な黄色であった。個々の粒子は40倍の対物レンズを用いて観察できたが、しかし、粒子は非常に緻密であり重なっていた。スポットの最も強力な領域では、40倍の対物レンズおよび2倍の補助拡大レンズを用いて観察される粒子は、約25個の粒子/39.1μ2すなわち約0.6個の粒子/μ2の密度であった。この数は、顕微鏡の解像限界のため真の粒子表面密度を表さないかもしれない。
水中に金スポットを置くと、スポットに一層均一な外観を与えるように見える。スポットの2倍および4倍希釈は、DLASLPD条件下で光学顕微鏡の照明を用いて肉眼により観察するとき(プリズム上にスライド設置し、浸漬油でプリズムに付着されている)双方とも黄色であるようである。1倍希釈スポットは眼で見てオレンジ色であるようである。
この実施例は、懸濁物中の光散乱強度測定により金粒子のマグネチックビーズへの特異的な結合を検出し定量化しそしてDLASLPD条件下で光学顕微鏡によりマグネチックビーズに結合されている個々の金粒子を検出する能力を示す。
下記の散乱光強度が測定された。
金粒子が結合したマグネチックビーズの一滴を、顕微鏡のガラススライド上に載せ、カバーガラスで覆った。次いで、光学顕微鏡を用いてDLASLPD条件下でスライドを試験した。マグネチックビーズは、強く散乱する対象物として容易に観察できたが、ビーズ上の金粒子は、大きなマグネチックビーズによる強い散乱のため、観察がより困難であった。しかし、水媒質を、屈折率約1.4〜1.5の浴用媒質に置換すると、粒子はよりはっきりと観察できた。また、スライドに対して垂直の線に関して高い角度で照射光ビームを傾斜させた場合、金粒子はよりはっきりと観察できた。
1.化学的に活性化したポリエチレングリコール−アミン被覆Au粒子の製造 核酸のAu粒子への結合のための反応性アミン基を次のようにして得た。実施例12に記載した方法を使用して、40nmAu粒子をビス(ポリオキシエチレンビス[3−アミノ−2−ヒドロキシプロピル])ポリエチレン化合物で被覆した。これにより、核酸の粒子への結合のためのいくつかの化学反応性アミン基を有するポリエチレン化合物の薄い被覆を有する直径40nmのAu粒子を得る。
ポリシチジル酸(ポリ(C))およびポリイノシン酸(ポリ(I))のホモポリマーを次のように化学修飾させた。0.8mgおよび1.3mgのポリ(I)およびポリ(C)を別の管に入れた。各々の管に、イミダゾール緩衝液(pH8.5)中の1−エチル−3,3−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド(CDI)の0.1M溶液1.0mlを加え、1時間インキュベートした。次いで、核酸を、エタノール析出により析出させ、ハイブリダイゼーション緩衝液(20mMトリス−HCl,100mMNaCl,1mMEDTA pH7.6)中に再懸濁させた。
ポリ(I)およびポリ(C)の双方の調製に同じプロトコールを使用した。50μlの核酸溶液に20μlの40nm−Au−PEG活性化粒子溶液および100μlのHepes 0.2M、pH8.0を加え、50℃で1時間インキュベートした。反応に続いて、ポリ(C)およびポリ(I)40nmAu−核酸結合体を遠心分離により採取し、洗い、ハイブリダイゼーション緩衝液中に再懸濁させた。
核酸−40nmAu粒子結合体のハイブリダイゼーション特性(40nm直径金粒子と当該粒子のポリマー被覆表面に共有結合した核酸)を次のようにして検討した。DLASLPD法を使用する光学顕微鏡を使用した。図9に示されているようなガラススライド−液体カバー片(slip)からなる実験用構成を使用した。ポリ(C)−Au粒子結合調製物の一滴をスライド上に載せ、カバー片で覆った。顕微鏡コンデンサー上に一滴の浸漬用油を載せ、次いでコンデンサーの一番上にスライドを載せた。10倍の対物レンズを使用した。溶液はほぼ均一に見え、ポリ(C)−Au粒子結合体は視野中に浮遊しているように見えた。それらのブラウン運動は、核酸で標識されていない40nmAu粒子について先に観察されたものよりも少ないようであった。少量のポリ(C)−Au粒子がガラススライドの表面に貼り付いているようであった。殆どが2〜4個のポリ(C)−Au粒子の少数の凝集体のポリ(C)−Au粒子であった。これらの凝集体構造は、それらが視野中を浮遊したとき、一単位として移動した。スライドの表面に付着したポリ(C)−Au粒子の粒子密度は、数分間このスライドを観察するにつれて上昇したことに気がついた。ポリ(C)−Au粒子からもたらされる散乱光の色は緑色であった。カバースライドを取り外し、次いで、ポリ(C)−Au滴を含むスライドの湿った領域の隣に一滴のポリ(I)−Au調製物を載せた。この2スポット間の接触は、ポリ(I)−Au滴からポリ(C)−Auを含むスライドの湿った部分まで液体の線を引く金属プローブを使用することにより行った。次いで、カバースライドを上に載せ、それから、そのスライドを顕微鏡上に戻し、観察した。時間を経過すると、多数ポリ(I)−Au−ポリ(C)−Au粒子凝集体の数の増加形成が観察された。約20分後、スライドを走査させ、非常に少数が単独の粒子であり、粒子の殆どが数個の粒子の凝集状態であり、それらの内の多くがガラススライドに貼り付いていたことが観察された。凝集体は、明瞭な形態、すなわち、特有の方向性があるように見え、これらの粒子凝集体は会合され、あるものは無作為に一巻きに巻かれたひも状として見え、その他のものは枝分かれした鎖の網目状態として見えた。これらの多凝集体の外観は、対照ポリ(C)−Auスライドで観察される少数の凝集体と比較して非常に異なった。40倍の対物レンズに代え、そして、いくつかの凝集体では、粒子のいくつかが緑色ではなくてより黄色であった。次いで、ポリ(Au)−ポリ(I)−Au反応体を含有するスライドのカバー片を取り、このスライド上に一滴の10-5M臭化エチジウムを加え、カバー片で覆った。スライド上の粒子の凝集体からくる淡いオレンジ色を観察した。すなわち、その色は緑色と同様に見え、粒子の黄緑色は淡いオレンジ色の背景上に位置されていた。凝集体から離れた領域ではオレンジ色は観察されなかった。この淡いオレンジ色は、粒子凝集体付近およびその中に核酸の二重鎖構造があったことを示した。我々はこれをポリ(C)−Au結合体とポリ(I)−Au結合体のハイブリダイゼーションであると解釈した。このスライドを除き、一滴のポリ(I)−Auを含む対照スライドを顕微鏡で観察した。このポリ(I)−Au調製物がポリ(C)−Au対照スライドと比べて多くの小さい凝集体として約2倍有するように見えた以外、対照ポリ(C)−Auスライドと比較して同じような観察であった。散乱光の色は緑色を呈し、いくらかの凝集体は黄緑色を呈した。
ビオチンで被覆された直径約2ミクロンの球形ポリスチレン粒子の溶液一滴を顕微鏡用ガラススライド上に載せ、DLASLPD条件下で光学顕微鏡中で観察した。ポリスチレン粒子は明るい白色光点源として容易に観察された。次いで、ポリスチレン粒子滴上にストレブトアビジンで被覆した60nm金粒子調製物一滴を載せ、この調製物を顕微鏡中で観察した。明るい白色ポリスチレン粒子が観察され、黄緑色の弱いハローがポリスチレン粒子の周りに観察された。スライドから溶液を蒸発させ、次いで、調製物上に一滴の顕微鏡用浸漬油を載せ、それから顕微鏡で観察した。個々の金粒子および黄緑色金粒子の大きな円環領域を容易に観察できた。ポリスチレン粒子は、黄緑色のハローすなわち環により囲まれた殆ど暗色〜黒色のスポットとして見えた。この方法は、固体粒状物質およびガラスやその他のビーズのような小さな固相、ならびに生物学的細胞等の表面に結合した金粒子もしくはその他の金属様粒子を検出するのに使用できる。
クエン酸塩法により製造した直径約100nmの金粒子を使用した。この溶液の一部を別々の容器に入れ、他の箇所に記載した方法を使用してポリエチレングリコール化合物(MW=20,000)で金粒子を被覆した。
被覆および未被覆粒子の光散乱比較について、各溶液が桃色がかった赤色の淡い色合いとなるまで水で試料を希釈した。試料についての散乱光強度対入射波長形態をSpectraMetrix Photometerを使用してまとめた。
その他の実施態様は次の請求の範囲内にある。
Claims (48)
- 試料中の1つ以上の分析物の特異的な検出法であって、
前記試料中の前記1つ以上の分析物に散乱光が検出可能な粒子を特異的に会合させる段階と、
前記粒子から散乱光が生じ、かつ1個以上の前記粒子から散乱した光を電子増幅せずに500倍未満の倍率で肉眼検出し得る条件下で、前記分析物と会合した前記粒子に光を照射する段階と、
前記条件下で前記粒子によって散乱された前記光を、前記1つ以上の分析物の存在の目安として検出する段階と
を含む方法。 - 前記肉眼で観察し、白色光を照射すると、前記粒子が特定の有色光を生じるのに適したサイズを有する、請求の範囲第1項の方法。
- 前記特定の有色光の色により、前記1つ以上の分析物の存在または量の目安が提供される、請求の範囲第2項の方法。
- 前記検出が、前記1つ以上の分析物の濃度の測定値として散乱光強度の測定を含む、請求の範囲第1項の方法。
- 前記検出が、前記1つ以上の分析物の濃度の測定として散乱光の色の測定を含む、請求の範囲第1項の方法。
- 前記肉眼で観察し、白色光を照射すると、前記粒子が特定の有色光を生じるのに適した組成を有する、請求の範囲第1項の方法。
- 前記粒子が固相結合分析物と会合した、請求の範囲第1項の方法。
- 前記検出段階の間前記粒子が液相中にある、請求の範囲第1項の方法。
- 前記分析物が固相と結合した、請求の範囲第1項の方法。
- 前記分析物が溶液中に遊離した、請求の範囲第1項の方法。
- 前記試料が、前記1つ以上の分析物を各々含んだ別個の領域を含むマイクロアレイまたはアレイチップである、請求の範囲第1項の方法。
- 前記光が多色白色光である、請求の範囲第1項の方法。
- 単色光照射光源を用いて前記光を供給する、請求の範囲第1項の方法。
- 前記方法が、前記肉眼で観察すると各々異なる視覚的外観を有する複数の異なる粒子を提供する段階を含む、請求の範囲第1項の方法。
- 前記粒子を同種(homogeneous)アッセイの中で用い、2個以上の粒子を互いに十分に接近させていずれか1個の粒子の光散乱特性を変化させるようにし、前記変化が前記1つ以上の分析物の存在の目安となる、請求の範囲第1項の方法。
- 前記粒子をアッセイの中で用い、2個以上の粒子を互いに十分に接近させて2個以上の粒子の光散乱特性が単一粒子から識別可能となるようにし、前記光散乱が前記1つ以上の分析物の存在の目安となる、請求の範囲第1項の方法。
- 前記粒子を同種アッセイの中で用い、2個以上の粒子を互いに十分に接近させて2個以上の粒子の光散乱特性が単一粒子から識別可能となるようにし、前記光散乱が前記1つ以上の分析物の存在の目安となる、請求の範囲第1項の方法。
- 前記粒子を同種アッセイの中で用い、互いに近接して保持した2個以上の粒子を引き離していずれか1個の粒子の光散乱特性を変化させるようにし、前記変化が前記1つ以上の分析物の存在の目安となる、請求の範囲第1項の方法。
- 前記粒子を同種アッセイの中で用い、1つ以上の分子間相互作用により2個以上の粒子を互いに連結した方法であって、粒子を粒子を一体保持する分子間相互作用を分断して1個以上の粒子を分子間相互作用から解放し、前記解放が前記1個以上の粒子の存在の目安となる、請求の範囲第1項の方法。
- 前記粒子が金粒子または銀粒子である、請求の範囲第1項の方法。
- 前記粒子が1から500ナノメートルの間のサイズを有する、請求の範囲第1項の方法。
- プリズムまたはその他の導光系により前記光を前記粒子に指向させる、請求の範囲第1項の方法。
- 少なくとも1種類の光散乱物質から作成された特異的に検出し得る金属様の光散乱粒子の集団であって、前記粒子が、化学的安定性ならびに分析物と結合する能力を前記粒子に付与する、少なくともさらに1種類の材料をその表面に含み、前記粒子の集団が十分なサイズ均一性をもつのに適し、したがって前記集団中の個々の粒子の光散乱特性が粒子相互間で類似する集団。
- 前記粒子を金属、金属化合物、金属酸化物、半導体、超伝導体から成るグループから選択される材料から形成する、請求の範囲第23項の粒子。
- 金属様の材料を組成物の一部として含む混合組成物で前記粒子を形成する、請求の範囲第23項の集団。
- 金属、金属化合物、金属酸化物、半導体、超伝導体から成るグループから選択される少なくとも1つの材料から形成され、直径1から500ナノメートルの特異的に検出可能な光散乱粒子試薬であって、前記粒子試薬が粒子表面と結合するのに適し、かつ結合試薬と結合するのに適した基礎分子を含み、前記粒子試薬が分析物と結合し得る光散乱粒子試薬。
- 前記粒子がポリマー、無機材料、有機材料、蛋白質材料、基礎分子材料、結合剤から成るグループから選択される被覆を有する、請求の範囲第23項または第26項の集団または粒子。
- 前記粒子が球状である、請求の範囲第23項または第26項の集団または粒子。
- 前記粒子が卵形または楕円体である、請求の範囲第28項の集団または粒子。
- 前記粒子が非対称である、請求の範囲第29項の集団または粒子。
- 前記粒子が変動係数5%未満の粒度分布を有する、請求の範囲第23項または第26項の集団または粒子。
- 前記粒子が変動係数10%未満の粒度分布を有する、請求の範囲第23項または第26項の集団または粒子。
- 前記粒子が変動係数15%未満の粒度分布を有する、請求の範囲第23項または第26項の集団または粒子。
- 前記粒子が金を含む、請求の範囲第23項の集団。
- 前記粒子が金と銀の混合組成物を含む、請求の範囲第23項の集団。
- 前記粒子が銀と磁性材料または強誘電性材料から構成される、請求の範囲第23項の集団。
- 前記粒子が金と磁性材料または強誘電性材料から構成される、請求の範囲第23項の集団。
- 前記粒子が金属様の材料と磁性材料または強誘電性材料との混合物から構成される、請求の範囲第23項の集団。
- 前記粒子がポリマー、蛋白質、核酸、無機化合物および有機化合物、基礎材料分子、結合剤から成るグループから選択される表面被覆を有する金から成り、前記粒子が10から50ナノメートルの間の直径を有し、白色光を照射すると緑色散乱光を生じる、請求の範囲第23項の集団。
- 前記粒子がポリマー、蛋白質、無機化合物および有機化合物、基礎材料分子、結合剤から成るグループから選択される表面被覆を有する金から成り、前記粒子の直径が50から70ナノメートルの間であり、白色光を照射すると黄緑色ないし黄色の散乱光を生じる、請求の範囲第23項の集団。
- 前記粒子がポリマー、蛋白質、無機化合物、有機化合物、基礎材料分子、結合剤から成るグループから選択される表面被覆を有する金から成り、前記粒子が約70から120ナノメートルの間の直径を有し、白色光を照射すると橙色ないし橙赤色の散乱光を生じる、請求の範囲第23項の集団。
- 前記粒子がポリマー、蛋白質、無機化合物、有機化合物、基礎材料分子、結合剤から成るグループから選択される表面被覆を有する金から成り、前記粒子が120ナノメートルより大きく1ミクロンより小さい直径を有し、白色光を照射すると橙色ないし橙赤色の散乱光を生じる、請求の範囲第23項の集団。
- 前記粒子がポリマー、蛋白質、無機化合物、有機化合物、基礎材料分子、結合剤から成るグループから選択される表面被覆を有する銀から成り、前記粒子が5から50ナノメートルの間の直径を有し、白色光を照射すると青色散乱光を生じる、請求の範囲第23項の集団。
- 光が前記試料に届き、かつ前記試料と結合した粒子からの散乱光が最大限に検出できるような角度に向けた光源を含む固相試料分析用の装置であって、前記粒子から散乱光が生じ、かつ1個以上の前記粒子から散乱した光を電子増幅せずに500倍未満の倍率で肉眼検出し得る条件下で、前記試料と会合した前記粒子に前記光を照射し得るように、前記装置を組み立て配置した装置。
- 前記試料からの散乱光前方の強度包絡線外に集光レンズ検出器を置いた、請求の範囲第44項の装置。
- 前記散乱光を検出できるように構成、配置された、必要なコンピュータ・ソフトウェアまたはファームウェアを有する粒子計数器を備えた、請求の範囲第44項の装置。
- 前記試料を載せる表面に対してほぼ垂直となるように前記装置の中に集光レンズを設けた、請求の範囲第44項の装置。
- マイクロアレイの測定ができるように前記装置を組み立て配置し、前記マイクロアレイが10立方ミクロンから1立方ミリメートルの間の寸法を有する、請求の範囲第44項の装置。
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