CN113433314B - 一种基于可视纳米金检测线的黄曲霉毒素标志物sers侧流免疫传感分析方法 - Google Patents

一种基于可视纳米金检测线的黄曲霉毒素标志物sers侧流免疫传感分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于可视纳米金检测线的黄曲霉毒素标志物SERS侧流免疫传感分析方法。本发明的免疫检测试纸条中的检测线为基于纳米金的可视检测线，有助于SERS信号采集过程对检测线进行准确定位。本发明通过系统优化反应条件，获得了高性能的SERS纳米探针，通过所述试纸条上检测线上捕获的SERS纳米探针的信号强度，对尿液中的AFM1的含量进行定量检测，检出限可达1.66pg/mL。尿液中AFM1回收率为93.8％‑111.3％，标准偏差低于17％，检测时间小于20min。本发明的方法可用于现场环境黄曲霉毒素的暴露评估，准确度高、灵敏度高，具有广阔的应用价值和应用前景。

Description

一种基于可视纳米金检测线的黄曲霉毒素标志物SERS侧流免 疫传感分析方法
技术领域
本发明涉及拉曼光谱检测与竞争性免疫检测技术领域，尤其是涉及一种基于可视纳米金检测线的黄曲霉毒素标志物SERS侧流免疫传感分析方法。
背景技术
黄曲霉毒素是由曲霉属真菌产生的一种常见霉菌毒素(Bennett，2003)。人和动物摄入黄曲霉毒素可引起严重的肝损伤以及引发肝癌，因此黄曲霉毒素被国际癌症研究机构认定为属于为Ι类致癌物。为保障人类和动物健康，目前常通过分析食品和饲料中黄曲霉毒素含量来评估其在人类和动物体内的暴露水平，但由于黄曲霉毒素在食品和饲料原料中分布不均匀，分析过程中容易产生取样和分析误差，因此，分析食品和饲料中黄曲霉毒素含量不能准确反映人和动物体内黄曲霉毒素的实际暴露水平。黄曲霉毒素在被人体和动物体摄入后主要通过肝脏代谢，研究表明，黄曲霉毒素代谢物的浓度与人体和动物体内黄曲霉毒素的摄入量密切相关，因此可以作为黄曲霉毒素暴露的有效生物标志物。血清中的黄曲霉毒素-白蛋白加合物和尿液中的黄曲霉毒素M1(AFM1)是两种主要的黄曲霉毒素暴露标志物，可分别反映黄曲霉毒素的长期(2-3个月)和短期(24小时)暴露。由于采集血清需要专业人员，同时需要不适合于现场环境采集。相比之下，尿液样本采集更为方便。因此尿液AFM1分析更适合于现场环境黄曲霉毒素的暴露水平评估。
由于黄曲霉毒素对人和动物具有遗传毒性和致癌性(IARC,2012)，因此不能设定最大无作用剂量。欧盟化学委员会认为百万分之一的的癌症风险水平可认为是可接受的风险水平(ECHA,2012)，因此Fromme等人据此推导出尿液中AFM1限量水平为30pg/mL。然而，调查数据表明人体尿中的AFM1水平可能远高于建议的限量水平。如Ali等人的研究(2017)表明Rajshahi地区采集的尿液样本中，超过40％的样本检测到AFM1，浓度范围为1.7-190pg/mL，这意味着很多人接触到的黄曲霉毒素水平超过了可接受的限量水平。因此，监测尿液中AFM1的含量，用于评估人和动物中黄曲霉毒素暴露水平非常必要。
目前主要采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测黄曲霉毒素标志物，该方法灵敏度高、准确度和精密度好，但需要昂贵的设备、专业技术人员和复杂的样品制备，不适合在常规实验室和现场环境中快速检测黄曲霉毒素暴露标志物。有文献报道了采用酶免疫测定法用于检测血清和尿液中的黄曲霉毒素暴露标志物。这些方法的检出限约为15-30pg/mL，检测时间超过1h，因此不适合尿液中AFM1的低水平和快速现场检测。
基于表面增强拉曼散射(SERS)的免疫分析是一种新型快速检测技术，该方法结合SERS标记和抗原-抗体免疫反应，具有检测速度快和检测灵敏度高的优点，可满足黄曲霉毒素暴露标志物的低浓度、快速检测需求。SERS 标记技术通常利用金纳米颗粒或银纳米颗粒来增强活性分子的拉曼散射信号，同时与免疫分析结合用于靶分子定量。目前，基于SERS的免疫分析已广泛用于生物医学诊断和食品安全监测领域。如美国Porter小组首先建立了一种基于SERS的免疫分析方法，并先后采用该技术实现了前列腺癌标记物、圆环病毒和副结核抗原的高灵敏度检测。随后多个研究小组开发了各种基于SERS的免疫传感分析方法，实现了癌胚抗原、胰腺癌标志物、四环素和氯霉素等的高灵敏度检测。与传统免疫分析方法相比，SERS免疫分析灵敏度提高了1-4个数量级。这些研究充分证明了SERS免疫分析在生物医学诊断和食品安全检测领域检测灵敏度方面的优势，但这些方法中通常使用固相金膜或磁珠作为反应基底进行抗原-抗体免疫反应，需要多次洗涤和孵化步骤，因此不适合靶分子的现场、快速检测。与之相比，侧流免疫分析具有操作简单、反应速度快和检测成本低等特点，非常适合于靶分子的现场、快速检测。但传统常的侧流免疫分析通常采用胶体金标记，方法检测灵敏度相对较低，限制了该法在低含量靶标分析中的进一步应用。近年来，研究人员结合SERS分析和侧流层析技术，建立了多种SERS侧流免疫分析方法，实现对肠毒素B、HIV-1DNA、肺炎球菌溶血素和心脏生物标志物等的快速、高灵敏度检测。但传统的金纳米颗粒或银纳米颗粒的拉曼增强效应仍有待提高。采用新型的混合型纳米颗粒如银壳金核型纳米(Ag@AuNP)颗粒可显著增强拉曼效应，但采用该类型的纳米颗粒结合侧流免疫分析，进行高灵敏SERS分析AFM1的方法未见报道。同时，由于采用的Ag@AuNP可显著增加拉曼信号，因而在侧流层析试纸上捕获少量的SERS纳米探针即可产生强的SERS信号，在很多情况下很难通过肉眼观察到侧流免疫试纸的检测线，因而SERS检测时难以准确定位检测线的位置，从而可能导致分析误差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于可视检测线的SERS侧流免疫分析方法，用于现场快速、准确、灵敏地检测尿液中的黄曲霉毒素M1(AFM1)。
本申请首先构建了基于纳米金的可视检测线，用于SERS检测时检测位置的准确定位；在此基础上，本专利系统优化了纳米探针的制备方式，获得了高性能的SERS纳米探针，在此基础上建立了SERS侧流免疫传感分析方法，实现对尿液中黄曲霉毒素标志物的超高灵敏度快速定量分析。
本发明首先提供一种基于SERS的侧流免疫传感检测试剂盒，包括检测试纸条，所述检测试纸条为侧流免疫层析检测试纸条，检测试纸条的检测线为可视颜色，是将包被抗原与纳米金偶联，然后喷涂于检测线位置得到。
本发明提供的基于SERS的侧流免疫传感检测试剂盒中，所述检测试纸条上的质控线，喷涂有二抗-纳米金复合物。
本发明的实施例中，是将包被抗原(AFM1-BSA)与纳米金偶联，取1 mL 0.3mg/mL的AFM1-BSA抗原(溶于10mM硼酸缓冲液，pH 8.5)，与 1mL浓缩的AuNP溶液混合，孵育30min，得到AFM1-BSA-AuNP复合物。
取1mL 0.5mg/mL的二抗(溶于10mM硼酸缓冲液，pH 8.5)，与1mL 浓缩的AuNP溶液混合，孵育30min，得到二抗-AuNP复合物。
随后将两种复合物分别喷涂于检测试纸条的硝酸纤维素膜上，作为检测线和质控线，喷涂体积为1μL/cm。最后将试纸条于37℃4h干燥，备用。试纸条组装时，将涂有混合包被抗原和羊抗鼠二抗的硝酸纤维素膜固定在底板的中央，将样品垫固定于一端，与中央的硝酸纤维素膜重叠2～4mm。吸收垫固定于另一端，与硝酸纤维素膜重叠2～4mm。最后，将组装好的底板切割成宽度为4mm的试纸条，密封备用。
本发明提供的基于SERS的侧流免疫传感检测试剂盒，还包括与检测试纸条配套使用的检测孔，在检测时，向检测孔中加入检测试剂，所述检测试剂为SERS纳米探针。
所述SERS纳米探针为拉曼标记分子-Au@Ag核-壳纳米颗粒复合物与 AFM1单克隆抗体偶联形成的SERS纳米探针。
所述SERS纳米探针的制备方法为：
(1)制备Au@Ag纳米颗粒，纳米颗粒的粒径为49-98nm；
(2)将Au@Ag纳米颗粒与0.1-0.3M硼酸缓冲溶液按照体积比 (10-30):1混合，加入与Au@Ag纳米颗粒体积比为0.8-32μL/mL的 0.1-1mM拉曼标记分子，震荡反应后离心，去除上清，用与初始Au@Ag 纳米颗粒体积相当的硼酸缓冲溶液复溶；
(3)步骤(2)的复溶体系中加入AFM1单抗，0.5-1.5小时后，加入溶于硼酸缓冲溶液的BSA，终止反应，离心去上清，复溶再离心去上清，反复多次；
(4)沉淀物重悬于含BSA、蔗糖、Triton X-100的磷酸盐缓冲溶液中。
进一步地，本发明提供了一种适用于SERS侧流免疫传感分析方法检测尿液中AFM1的SERS纳米探针，通过以下方法制备得到：
(1)制备Au@Ag纳米颗粒，纳米颗粒的粒径为49-98nm；
(2)将Au@Ag纳米颗粒与0.1-0.3M硼酸缓冲溶液按照体积比(10-30):1混合，加入与Au@Ag纳米颗粒体积比为0.8-32μL/mL的0.1-1mM拉曼标记分子，震荡反应后离心，去除上清，用与初始Au@Ag 纳米颗粒体积相当的硼酸缓冲溶液复溶；
(3)步骤(2)的复溶体系中加入AFM1单抗，0.5-1.5小时后，加入溶于硼酸缓冲溶液的BSA，终止反应，离心去上清，复溶再离心去上清，反复多次；
(4)沉淀物重悬于含BSA、蔗糖、Triton X-100的磷酸盐缓冲溶液中。
优选地，Au@Ag纳米颗粒的粒径为60-98nm；步骤(2)中拉曼标记分子与Au@Ag纳米颗粒的体积比为4-20μL/mL；所述SERS纳米探针中 AFM1单抗的终浓度为2.0-4.0μg/mL。
更优选地，Au@Ag纳米颗粒的粒径为92nm；步骤(2)中拉曼标记分子与Au@Ag纳米颗粒的体积比为8μL/mL；所述SERS纳米探针中AFM1单抗的终浓度为3.0μg/mL；所述拉曼标记分子包括5,5-二硫代双-2-硝基苯甲酸(DTNB)、对巯基苯胺(PATP)、对巯基苯甲酸(4-MBA)、2,2'- 联吡啶(Bipy)。本发明实施例采用DTNB作为拉曼标记分子。
本发明进一步提供了一种检测黄曲霉素暴露标志物的SERS侧流免疫传感分析方法，包括以下步骤：
(1)待检样品溶液离心后将上清与含有BSA、Triton X-100的PBS溶液等体积混合，利用本发明所述的基于SERS的侧流免疫传感检测试剂盒，将待测样品混合溶液加入检测孔中与检测试剂混合，孵育；所述检测试剂为权利要求6-8任一所述的SERS纳米探针；
(2)将本发明所述的基于SERS的侧流免疫传感检测试剂盒中的检测试纸条浸入检测孔中，溶液向吸收垫方向移动并在检测线及质控线处反应；取出干燥后，用拉曼光谱仪对具有可视颜色的检测线的SERS强调进行测定；
所述拉曼光谱仪的参数设置如下：激发光源采用He-Ne激光器，激发波长为785nm，激光强度为50mW，信号采集时间为1s。
本发明所述的检测黄曲霉素暴露标志物的SERS侧流免疫传感分析方法，适用的待检样品为尿液。
采用本发明所述的检测方法，如果尿液样本中不含AFM1，则SERS纳米探针可与试纸条中硝酸纤维素膜上的包被抗原结合，检测线在激光激发下产生强SERS信号。当尿液样本中含有AFM1时，样品中游离的AFM1将与检测线上的包被抗原竞争SERS纳米探针上的识别位点。因而硝酸纤维素膜上的包被抗原会与较少的SERS纳米探针发生反应，检测线的SERS信号会随之降低。如果样品中含有大量的AFM1，则AFM1会完全阻断SERS 纳米探针与包被抗原的结合，导致检测线上不会产生SERS信号。同时，在硝酸纤维素膜上设置有质控线，当操作正常时，质控线上的二抗可与SERS 纳米探针的抗体发生相互作用，因而不论样品为阴性或阳性，质控线可产生一致的强SERS信号。
本发明采用拉曼标记分子5,5-二硫代双-2-硝基苯甲酸(DTNB)标记合成的Au@Ag核-壳纳米颗粒(Au@Ag NP)，然后将抗AFM1单克隆抗体 (mAb)与DTNB-Au@Ag NP复合物偶联形成SERS纳米探针，并系统研究了Au@Ag NP粒径、DTNB量和抗体量对SERS信号强度和分析灵敏度的影响。同时，本发明开发了一种基于纳米金的可视检测线，可有助于SERS 信号采集过程对检测线进行准确定位。与传统方法采用包被抗原直接喷涂形成检测线不同，本方法首先将包被抗原(AFM1-BSA)与纳米金偶联，然后喷涂于检测线。因纳米金干燥后在试纸上呈现红色，所以无论是阴性和阳性样品，SERS侧流免疫分析后，检测线的颜色均为可视的红色，从而可帮助SERS信号采集时的准确定位。
本发明建立SERS侧流免疫传感分析方法采用的为竞争性免疫分析原理，原理图见图1，最终可通过检测线上捕获的SERS纳米探针产生的SERS 信号强度，对样品中的AFM1的含量进行准确定量。经验证，本发明方法测定尿液中AFM1的检出限为1.66pg/mL，远低于大多数报道的仪器分析和免疫分析。同时尿液中AFM1回收率为93.8％-111.3％，标准偏差低于17％，表明本发明方法具有较好的分析准确度和精密度。并且该方法的检测时间小于20min。本发明的方法可用于现场环境黄曲霉毒素的暴露评估，检测尿液中AFM1的含量准确度高、灵敏度高，省时省力，具有广阔的应用价值和应用前景。
附图说明
图1为SERS侧流免疫传感分析AFM1原理图。
图2为不同粒径的透射电镜图，图中AuNP、Au@Ag NP-1、Au@Ag NP-2、Au@Ag NP-3、Au@Ag NP-4、Au@Ag NP-5和Au@Ag NP-6的粒径分别为32、38、49、60、84、92和98nm。Au@AgsNP(FETEM)为Au@Ag NP-5的高分辨透射电镜图。
图3为Au@AgNP粒径(A)和DTNB量(B)对SERS信号强度的影响以及抗体用量(C)对SERS免疫分析灵敏度的影响，A图中Au@Ag NP-1、Au@Ag NP-2、Au@Ag NP-3、Au@Ag NP-4、Au@Ag NP-5和Au@Ag NP-6的粒径分别为38、49、60、84、92和98nm。
图4为普通检测线试纸条(A)和本发明可视检测线试纸条(B)SERS 免疫分析系列加标样品图。
图5为SERS纳米探针(a)与SERS纳米探针+AuNP混合物(b)拉曼光谱图。
图6为典型SERS试纸条分析加标AFM1结果图(A)、对应拉曼光谱图(B)和标准曲线图(C)。
图7为SERS侧流免疫传感分析特异性试验分析结果。图中从左至右：空白尿液；空白尿液中添加1ng/mLAFM1；空白尿液中添加10ng/mL玉米赤霉烯酮；空白尿液中添加10ng/mL呕吐毒素；空白尿液中添加10ng/mL伏马毒素；空白尿液中添加10ng/mL赭曲霉毒素A；空白尿液中添加 10ng/mLT-2毒素。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 Au@Ag纳米颗粒的制备和鉴定
Au@Ag NPs的制备过程参照Blanco-Covián等的方法：首先，在室温下将60μL的抗坏血酸(Ascorbic acid，AA)(200mM)和15μL的AgNO3 (200mM)加入到10mL粒径约为30nm的AuNPs溶液中，在搅拌条件下反应30min。然后继续加入60μL的AA(200mM)和15μL的AgNO3(200mM)反应30min(第二次循环)。随着加入次数的增多，其Au@Ag NPs的银壳厚度不断增加。根据不同循环次数，分别制备循环次数为1、2、 4、6、8和10次的Au@Ag NPs，并且将所得颗粒分别离心20min，将颗粒再次复溶于10mL超纯水中。最后，将制得的不同粒径纳米粒子进行紫外- 可见光光谱和透射电镜扫描鉴定。
结果表明：随着循环次数的的增加，银层厚度不断增加，Au@Ag NPs 的直径也不断增加。经电镜鉴定(图2)，最终合成的Au@Ag NPs的平均粒径分别为32、38、49、60、84、92和98nm。同时合成的Au@AgNP包含明显的核-壳结构，表明Au@Ag NPs合成成功。
实施例2 SERS纳米探针的制备和优化
将制备的10mL 92nm Au@A NPs与500μL硼酸缓冲液(0.2M，pH 8.5) 混合，加入300μL 1mM DTNB，室温下轻微震荡反应30min后，离心，去除上清中多余的拉曼分子后，使用10mL硼酸缓冲液(2.0mM，pH 8.5) 复溶。随后在DTNB-Au@Ag NPs溶液中加入抗AFM1单克隆抗体，并缓慢搅拌反应1h。最后分别加入1mL溶于硼酸缓冲液(2.0mM，pH 8.5)的 10％BSA，用于掩蔽纳米粒子表面上的裸露位点以终止反应。将此悬浮液分别以3,000rpm和3,400rpm离心10min后去除上清液，以除去多余的试剂。复溶后离心，反复进行两次，将沉淀物重悬于含有0.5％BSA、0.5％蔗糖和0.1％Triton X-100的磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.4)中，最后取50μL 溶液于每个微孔中，冻干保存备用。
同时，本试验考察了Au@Ag粒径、DTNB量和抗体用量对制备的SERS 纳米探针产生信号强度的影响。图3的A图表明，随着粒径的增加，SERS 信号强度上升，粒径达到92nm后基本保持稳定，因此最终选择Au@AgNPs (92nm)用于本试验研究。
图3的B图表明，SERS信号强度随拉曼标记物体积的增加而逐渐上升，当拉曼标记物体积大于8μL后保持平稳，且反应体系较为稳定。因此，拉曼标记物体积选择为8μL/mLAu@Ag NPs。图3的C图表明，当纳米粒子溶液中抗AFM1抗体的最终浓度为3.0μg/mL相应的抑制率达到最大，因此， SERS纳米探针制备中抗体用量选择为3.0μg/mL Au@Ag NPs。
实施例3本发明的具有可视检测线的SERS侧流检测试纸条的制备
分别制备AFM1-BSA-AuNP和二抗-AuNP复合物。制备过程如下：取 1mL 0.3mg/mL的AFM1-BSA抗原和1mL 0.5mg/mL的二抗(溶于10mM 硼酸缓冲液，pH 8.5)，分别与1mL浓缩的AuNP溶液混合，孵育30min。随后将两种复合物分别喷涂于硝酸纤维素膜上，作为检测线和质控线，喷涂体积为1μL/cm。最后将试纸条于37℃4h干燥，备用。试纸条组装时，将涂有混合包被抗原和羊抗鼠二抗的硝酸纤维素膜固定在底板的中央，将样品垫固定于一端，与中央的硝酸纤维素膜重叠2～4mm。吸收垫固定于另一端，与硝酸纤维素膜重叠2～4mm。最后，将组装好的底板切割成宽度为 4mm的试纸条，密封备用。
实施例4检测尿液中AFM1的SERS侧流免疫传感分析方法的建立
本试验采用竞争性免疫分析原理(图1)。首先将包被抗原 (AFM1-BSA-AuNP)喷涂在硝酸纤维素膜上作为检测线。SERS纳米探针置于检测孔中作为检测试剂。检测时，将处理后的尿液样本加入到检测孔中，与检测试剂混合。如果尿液样本中不含AFM1，则SERS纳米探针可与硝酸纤维素膜上的包被抗原结合，检测线在激光激发下产生强SERS信号。当尿液样本中含有AFM1时，样品中游离的AFM1将与检测线上的包被抗原竞争SERS纳米探针上的识别位点。因而硝酸纤维素膜上的包被抗原会与较少的SERS纳米探针发生反应，检测线的SERS信号会随之降低。如果样品中含有大量的AFM1，则AFM1会完全阻断SERS纳米探针与包被抗原的结合，导致检测线上不会产生SERS信号。同时，在硝酸纤维素膜上设置有质控线，当操作正常时，质控线上的二抗可与SERS纳米探针的抗体发生相互作用，因而不论样品为阴性或阳性，质控线可产生一致的强SERS信号。对于定量分析，通过在空白尿液样本中加入系列稀释的AFM1标准溶液并进行SERS-LFIA分析，计算加标样品和空白样品的SERS强度比值(B/B0)，与AFM1浓度的对数值进行线性拟合绘制标准曲线。将未知样品分析产生的SERS强度代入校准曲线，可计算出样品中AFM1的含量。
实际检测时，尿液样本在6,000rpm离心5min,所得上清与含有1％Triton和1％BSA的PBS溶液等体积混合。取200μL加至含有SERS纳米探针微孔板中，轻微混合，室温下孵育3min后，将试纸条浸入样品孔中，溶液向吸收垫方向移动并在检测线及质控线处反应。8min后取出，干燥后用拉曼光谱仪对检测线SERS强度进行测定。试验中光谱仪的参数设置如下：激发光源采用He-Ne激光器，激发波长为785nm，激光强度为50mW，信号采集时间为1s。
(1)普通检测线和本发明的可视检测线效果对比
图4为普通试纸条和含本发明的可视检测线试纸条分析加标样品结果。由图4的A可见，当样品中AFM1含量超过0.037ng/mL时，通过肉眼观察不到检测线，因而SERS检测时难以对检测线位置进行准确定位。由图4 的B可见，不管样品中AFM1含量高低，检测线均为红色，因此有利于SERS 检测中信号的采集。
由图5可知，同等浓度的SERS纳米探针，与AuNP混合前后，不影响拉曼光谱的谱峰位置和信号强度，因此，检测线上包被有AuNP不会对SERS 信号产生影响。
(2)标准曲线和灵敏度的确定
由图6可知，随着AFM1含量的上升，SERS信号强度逐渐下降。以 AFM1的对数浓度值为横坐标，以B/B0为纵坐标建立标准曲线。其中B为不同浓度的AFM1加标溶液在1332cm-1处所对应的SERS强度；B0为AFM1浓度为0ng/mL时在1332cm-1处的SERS强度。结果表明在0.0041-1ng/mL 浓度范围内，相对SERS强度与AFM1浓度对数值线性关系良好，线性方程为y＝0.123×ln(x)+0.1125，R2＝0.9899。同时，该方法的灵敏度通过检测限 (LOD)表示，LOD值确定为相比空白样品，SERS信号强度下降10％时所对应的样品中分析物的浓度。经过计算本方法测定尿液中AFM1的LOD 值为1.66pg/mL。
(3)方法准确度和精密度(添加回收试验)
将不同浓度的AFM1标准溶液添加到空白尿液样品中，进行加标回收测定，评价该SERS-LFIA分析方法的准确度和精密度。测定时采用拉曼光谱仪对检测线的拉曼信号强度进行采集，代入标准曲线计算样品中AFM1的浓度并计算回收率和变异系数。结果如表1所示，在0.01～0.2ng/mL的添加浓度范围内，AFM1的回收率在93.8％～111.3％之间，变异系数小于17％，表明该SERS侧流免疫传感分析的准确度和精密度较高。
表1 SERS侧流免疫传感分析尿液中AFM1的添加回收率和变异系数
Figure BDA0002422432740000111
(4)方法的特异性
分别将AFM1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素和 T-2毒素加入至空白尿液样本中，随后采用建立的SERS侧流免疫传感器进行分析。结果如图7所示，AFM1可显著抑制检测线SERS信号强度，而其余常见霉菌毒素不会对检测线SERS信号强度带来显著影响，因此，本发明方法对AFM1具有较强的特异性。
(5)方法的重现性
采用3批次SERS纳米探针和侧流层析试纸条，对20pg/mL和80 pg/mLAFM1加标样品进行测定。结果如表2所示。结果表明，三批次SERS 侧流免疫传感分析相同浓度的AFM1，变异系数小于17％，说明该方法分析的重复性较好。
表2 SERS侧流免疫传感分析尿液中AFM1的重复性测定结果
Figure BDA0002422432740000121
(6)与文献报道方法的对比
通过与文献报道的检测黄曲霉毒素M1的方法对比，本发明建立的基于可视检测线的SERS侧流免疫传感分析方法的灵敏度优于其它方法，同时也优于文献报道的SERS免疫分析黄曲霉毒素B1的方法，并且本发明方法的检测时间小于20分钟，比其它分析方法时间更短或相当。
表3本发明方法与文献报道方法检测黄曲霉毒素(M1或B1)的对比
Figure BDA0002422432740000122
Figure BDA0002422432740000131
虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种检测黄曲霉素暴露标志物的SERS侧流免疫传感试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测试纸条，所述检测试纸条为侧流免疫层析检测试纸条，检测试纸条的检测线为可视颜色，是将包被抗原与纳米金偶联，然后喷涂于检测线位置得到；
所述检测试纸条上的质控线，喷涂有二抗-纳米金复合物；
所述试剂盒还包括与检测试纸条配套使用的检测孔，在检测时，向检测孔中加入检测试剂，所述检测试剂为SERS纳米探针；
所述SERS纳米探针为拉曼标记分子-Au@Ag纳米颗粒复合物与AFM1单克隆抗体偶联形成的SERS纳米探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述SERS纳米探针的制备方法为：
（1）制备Au@Ag纳米颗粒，纳米颗粒的粒径为49-98 nm；
（2）将Au@Ag纳米颗粒与0.1-0.3 M硼酸缓冲溶液按照体积比（10-30）:1混合，加入与Au@Ag纳米颗粒体积比为0.8-32 μL /mL的0.1-1mM拉曼标记分子，震荡反应后离心，去除上清，用与初始Au@Ag纳米颗粒体积相当的硼酸缓冲溶液复溶；
（3）步骤（2）的复溶体系中加入AFM1单克隆抗体，0.5-1.5小时后，加入溶于硼酸缓冲溶液的BSA，终止反应，离心去上清，复溶再离心去上清，反复多次；
（4）沉淀物重悬于含BSA、蔗糖、Triton X-100的磷酸盐缓冲溶液中。
3.一种检测黄曲霉素暴露标志物的SERS侧流免疫传感分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）待检样品溶液离心后将上清与含有BSA、Triton X-100的PBS溶液等体积混合，利用权利要求1或2所述的试剂盒，将待测样品混合溶液加入检测孔中与检测试剂混合，孵育；（2）将所述试剂盒中的检测试纸条浸入检测孔中，溶液向吸收垫方向移动并在检测线及质控线处反应；取出干燥后，用拉曼光谱仪对具有可视颜色的检测线的SERS强度进行测定。
4.如权利要求3所述的SERS侧流免疫传感分析方法，其特征在于，待检样品为尿液。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114216892B (zh) * 2021-11-30 2024-02-06 厦门大学 一种基于sers快速准确检测粮食中玉米赤霉烯酮毒素的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101900728A (zh) * 2010-08-05 2010-12-01 中国农业科学院油料作物研究所 半定量化检测黄曲霉毒素b1的多检测线免疫层析试纸条及其制备方法
CN103604926A (zh) * 2013-11-27 2014-02-26 云南师范大学 一种免疫层析试纸条检测微囊藻毒素-lr的方法
CN106928397A (zh) * 2017-03-15 2017-07-07 集美大学 基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素b1分子sers检测方法
CN109900890A (zh) * 2019-03-28 2019-06-18 天津科技大学 一种检测小分子物质的黑磷-金纳米粒子复合物光热定量免疫层析试纸条及其制备方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150038347A1 (en) * 2010-03-19 2015-02-05 The University of Wyoming,an institution of higher of the State of Wyoming Surface enhanced raman spectroscopy
US20140178902A1 (en) * 2011-05-16 2014-06-26 National University Of Ireland, Maynooth Method for detecting infections
US20160341723A1 (en) * 2015-10-25 2016-11-24 Nahid Sarlak Au nanoparticles encapsulated in nanocompoites and applications thereof in rapid detection of an analyte

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101900728A (zh) * 2010-08-05 2010-12-01 中国农业科学院油料作物研究所 半定量化检测黄曲霉毒素b1的多检测线免疫层析试纸条及其制备方法
CN103604926A (zh) * 2013-11-27 2014-02-26 云南师范大学 一种免疫层析试纸条检测微囊藻毒素-lr的方法
CN106928397A (zh) * 2017-03-15 2017-07-07 集美大学 基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素b1分子sers检测方法
CN109900890A (zh) * 2019-03-28 2019-06-18 天津科技大学 一种检测小分子物质的黑磷-金纳米粒子复合物光热定量免疫层析试纸条及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Multiplex SERS-based lateral flow immunosensor for the detection of major mycotoxins in maize utilizing dual Raman labels and triple test lines;Wanjun Zhang等;《Journal of Hazardous Materials》;20200219;第393卷;第1-9页 *

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