CN106928397A - 基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素b1分子sers检测方法 - Google Patents

基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素b1分子sers检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106928397A
CN106928397A CN201710153653.7A CN201710153653A CN106928397A CN 106928397 A CN106928397 A CN 106928397A CN 201710153653 A CN201710153653 A CN 201710153653A CN 106928397 A CN106928397 A CN 106928397A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aflatoxin
core
shell
molecularly imprinted
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710153653.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106928397B (zh
Inventor
张芹
孙文
贺路影
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jimei University
Original Assignee
Jimei University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jimei University filed Critical Jimei University
Priority to CN201710153653.7A priority Critical patent/CN106928397B/zh
Publication of CN106928397A publication Critical patent/CN106928397A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106928397B publication Critical patent/CN106928397B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/04—Acids; Metal salts or ammonium salts thereof
    • C08F220/06—Acrylic acid; Methacrylic acid; Metal salts or ammonium salts thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B01J20/268—Polymers created by use of a template, e.g. molecularly imprinted polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F2/00—Processes of polymerisation
    • C08F2/44—Polymerisation in the presence of compounding ingredients, e.g. plasticisers, dyestuffs, fillers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J9/00—Working-up of macromolecular substances to porous or cellular articles or materials; After-treatment thereof
    • C08J9/26—Working-up of macromolecular substances to porous or cellular articles or materials; After-treatment thereof by elimination of a solid phase from a macromolecular composition or article, e.g. leaching out
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K3/00—Use of inorganic substances as compounding ingredients
    • C08K3/02—Elements
    • C08K3/08—Metals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2201/00—Foams characterised by the foaming process
    • C08J2201/04—Foams characterised by the foaming process characterised by the elimination of a liquid or solid component, e.g. precipitation, leaching out, evaporation
    • C08J2201/042—Elimination of an organic solid phase
    • C08J2201/0422—Elimination of an organic solid phase containing oxygen atoms, e.g. saccharose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2333/00—Characterised by the use of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides, or nitriles thereof; Derivatives of such polymers
    • C08J2333/02—Homopolymers or copolymers of acids; Metal or ammonium salts thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K3/00—Use of inorganic substances as compounding ingredients
    • C08K3/02—Elements
    • C08K3/08—Metals
    • C08K2003/0831—Gold
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K2201/00—Specific properties of additives
    • C08K2201/002—Physical properties
    • C08K2201/003—Additives being defined by their diameter
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K2201/00—Specific properties of additives
    • C08K2201/011—Nanostructured additives

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素B1分子SERS检测方法，涉及表面增强拉曼检测。合成金纳米粒子，在金纳米粒子周围包覆黄曲霉素B1分子印迹聚合物，制备得以金纳米为核，分子印迹聚合物为壳的核壳纳米粒子。将壳层的分子印迹聚合物中的模板分子洗脱后，分子印迹聚合物内的空穴可特异性地捕获黄曲霉素B1分子，由于处于金纳米粒子等离子体共振磁场的有效范围内，可实现黄曲霉素B1分子的表面增强拉曼分析检测。以黄曲霉素B1分子为模板分子制备的分子印迹壳层，经过洗脱后得分子印迹聚合物，对黄曲霉素B1具有高度特异性吸附，用作SERS基底可实现黄曲霉素B1的定量检测。该方法的特点是特异性高且样品分析时间短。

Description

基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素B1分子 SERS检测方法
技术领域
本发明涉及表面增强拉曼的检测，尤其是涉及基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素B1分子SERS检测方法。
背景技术
黄曲霉素(aflatoxin，AFT)是一类真菌毒素，主要是由黄曲霉(Aspergillusflavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和集峰曲霉(Aspergillus nomius)产生的次生代谢产物(潘中华，徐燕芳，成恒嵩.黄曲霉毒素分析方法进展[J].农业环境与发展，1995，(2):30～33.)。目前已分离鉴定出AFB1、AFB2、AFB2a、AFG1、AFG2、AFG2a、AFM1、AFM2等18种属于该类的毒素，其中黄曲霉素B1的毒性及致癌性是最高的，其毒性约为氰化钾的10倍，砒霜的68倍，致癌性为二甲基亚硝胺的75倍，奶油黄的900倍(张文玲，袁涛，李书国.近10年粮油食品中黄曲霉毒素检测技术的研究进展[J].粮食加工，2012，(1):77～81.)，3,4-苯并芘的4000倍，人畜误食该毒素能够引起内脏出血性坏死(Butler W H.Acute toxicityof aflatoxin B1in rats[J].British J.Cancer，1964，(4):756～762.)慢性中毒及引发癌症(叶雪珠，王小骊，赵燕申，等.黄曲霉毒素B1检测方法的分析[J].食品与发酵工业，2003，(10):90～92.)。世界卫生组织已经于1993年将其列为I级致癌物(Elisabete Y S，Mario A O，Fabia Y F，et al.Evaluation of fumonisin-aflatoxin co-occurrence inBrazilian corn hybrids by ELISA[J].Food Addit.Contam.，2001，(8):719～729.)。由于黄曲霉素具有脂溶性，油料作物如花生、大豆等发霉是黄曲霉素污染食物的主要途径，且黄曲霉素B1耐高温，一般烹调手段难以破坏，低剂量摄入黄曲霉素B1就会造成中毒，因此建立对黄曲霉素B1的痕量分析方法具有重要意义。现有对黄曲霉素B1的检测手段主要有：薄层分析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)、毛细管电泳法(CE)和荧光光度法(IAC/S FB)(Wei J，Okerberg E，Dunlap J，et al.Determination of biologicaltoxins using capillary electrokinetic chromatography with multiphoton-excitedfluorescence[J].Anal.Chem.，2000，(72):1360～1363.)等。其中，HPLC法和ELISA法应用较为普遍，适用于标准化，但需要对待测样品进行复杂的样品处理和提纯，检测耗时长，仪器所需的维护成本比较昂贵，并且载体稀释作用会相对降低检测的灵敏度，不适合基层检测机构大批量检测。
表面增强拉曼光谱(SERS)具有发射谱带窄、息量大、谱稳定性高、同物质具有特征的拉曼散射信号等特点，对常规拉曼信号有明显增强，最大增强因子可以达到1014～1015，在痕量检测方面具有高灵敏度、高分辨率等优势，因此被广泛采用。黄曲霉素B1与金纳米基底表面没有相互作用的官能团，如果想利用SERS手段检测，必须借助物理或化学的吸附作用使目标分子靠近SERS基底表面。文献报道上主要采用通过物理手段富集或在金纳米上通过化学修饰能与黄曲霉素B1相互作用的分子来捕获黄曲霉素B1，使其进入金纳米表面的等离子体共振磁场有效范围内，实现拉曼信号增强，从而进行SERS检测。这些方法大致分为两类，第一类是在金纳米粒子表面修饰相应抗体(Juhui Ko，Chankil Lee，Jaebum Choo，Highly sensitive SERS-based immunoassay of aflatoxin B1using silica-encapsulated hollow gold nanoparticles[J].Journal of Hazardous Materials，2015，(285):11～17.)或对应寡核苷酸适体(Yuan Zhao，Yaxin Yang，Yaodong Luo，XuanYang，Manli Li，and Qijun Song.Double Detection of Mycotoxins Based on SERSLabels Embedded Ag@Au Core-Shell Nanoparticles[J].ACS Appl.Mater.Interfaces，2015，(39):21780～21786)实现对黄曲霉素的捕捉。第二类是在金纳米外修饰Fe3O4壳层使之具有磁性，在外界磁场作用下，纳米粒子发生聚集，利用聚集效应将黄曲霉素B1分子夹在纳米粒子的狭缝中，进入“热点”从而实现SERS检测(郏侃.金磁纳米颗粒的制备及其在表面增强拉曼光谱快速检测黄曲霉毒素中的应用[D].浙江工业大学，2015.)。但是单纯依靠磁性纳米粒子聚集作用对溶液中游离的黄曲霉素B1分子聚集效率低，难以实现低浓度下黄曲霉素B1的稳定检测结果。
发明内容
本发明的目的在于提供基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素B1分子SERS检测方法。
本发明包括以下步骤：
1)合成金纳米粒子；
在步骤1)中，所述合成金纳米粒子的具体方法可为：取氯金酸水溶液于容器中，回流加热至沸腾，再加入柠檬酸钠水溶液，保持沸腾状态继续搅拌，加入柠檬酸钠后，溶液颜色首先由淡黄色迅速变成深蓝色，然后逐渐变成酒红色并保持稳定40min后，即可制得金纳米粒子；所述氯金酸水溶液与柠檬酸钠水溶液的体积比可为(100～200)︰(1～2)，所述氯金酸水溶液可采用质量分数为0.01％的氯金酸水溶液，所述柠檬酸钠水溶液可采用质量分数为1％的柠檬酸钠水溶液；所述回流加热至沸腾可在磁力搅拌下回流加热至沸腾；所述金纳米粒子为球形或椭圆形金纳米粒子，粒径为40～80nm；氯金酸浓度为0.1～0.3mmol/L，柠檬酸钠浓度为30～40mmol/L；所述回流加热的时间可为30～50min。
2)配制预聚合溶液；
在步骤2)中，所述配制预聚合溶液的具体方法可为：配制甲基丙烯酸溶液，加入黄曲霉素B1溶液，混匀后冷藏静置，即得预聚合溶液；所述甲基丙烯酸溶液的摩尔浓度可为(1.1～1.3)×10-3mol/L；所述黄曲霉素B1溶液与甲基丙烯酸的浓度比可为1︰(4～5)；所述冷藏的温度可为3～5℃，静置的时间可为4～6h。
3)合成核壳纳米粒子；
在步骤3)中，所述合成核壳纳米粒子的具体方法可为：将金溶胶浓缩，重新分散在装有乙腈的容器中，加入步骤2)得到的预聚合溶液，再加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯溶液和聚乙烯吡咯烷酮溶液，然后加入自由基反应的引发剂偶氮二异丁腈，搅拌混匀，通氮气排除体系内空气后密封，恒温油浴反应，即得以金纳米粒子为核，黄曲霉素B1分子印迹聚合物为壳层的核壳纳米粒子；所述将金溶胶浓缩可将40mL金溶胶浓缩至1mL；所述乙腈的加入量可为40～60mL；所述乙二醇二甲基丙烯酸酯溶液的摩尔浓度可为(1.1～1.3)×10- 3mol/L，所述聚乙烯吡咯烷酮溶液的质量分数可为1％～1.5％；所述偶氮二异丁腈的加入量可为20～50mg；所述恒温油浴反应的温度可为60～65℃，恒温油浴反应的时间可为6～8h。
4)壳层内模板分子的洗脱；
在步骤4)中，所述壳层内模板分子的洗脱的具体方法可为：将步骤3)制得的核壳纳米粒子用甲醇和乙酸混合液在转速6000～7000r/min下离心5～7min，再清洗至不含黄曲霉素B1。
所述甲醇和乙酸混合液中的甲醇与乙酸的体积比可为9︰1；所述再清洗至不含黄曲霉素B1，是将核壳纳米粒子在拉曼检测时不出现黄曲霉素B1在1129cm-1、1179cm-1、1308cm-1和1591cm-1的特征峰。
5)黄曲霉素B1的SERS定量分析检测。
在步骤5)中，所述黄曲霉素B1的SERS定量分析检测的具体方法可为：将步骤4)得到的纳米粒子与黄曲霉素B1溶液进行混合，静置吸附后，取混合液滴在硅片上，待其自然干燥后在拉曼光谱仪上进行SERS定量分析检测，表面增强拉曼光谱检测的激发光源波长可为500～800nm，激光光斑可为1～2μm；所述静置吸附的时间可为1～2h；所述SERS定量分析检测是以固体黄曲霉素B1的1129cm-1、1179cm-1、1308cm-1和1591cm-1的四处特征峰为判断依据，定性分析黄曲霉素B1是否存在，该特征峰判断依据是对比固体黄曲霉素B1的拉曼谱图与含有黄曲霉素B1的核壳纳米粒子的拉曼谱图后，在核壳纳米粒子谱图上出现的黄曲霉素B1特征峰，且经过洗脱的核壳纳米粒子和不含黄曲霉素的核壳纳米粒子都没有。
所述SERS定量分析检测可以黄曲霉素B1浓度的负对数值为横坐标，以上述特征峰的强度为纵坐标，制作标准回归曲线。SERS定量分析的线性范围为10-11～10-4mol/L，线性相关系数R2达到0.99以上，回收率在89.84％～101.12％，检测限低至10-12mol/L。
本发明提出一种黄曲霉素B1的表面增强拉曼的分析检测方法，在水相中合成金纳米粒子，通过印迹黄曲霉素B1分子的聚合物壳层修饰金纳米粒子，得到以金纳米为核，分子印迹聚合物为壳的核壳结构纳米粒子，以此用作SERS基底。分子印迹聚合物壳层内的空穴可以特异性地捕获黄曲霉素B1分子，使其靠近金纳米粒子表面，进入金纳米粒子等离子体共振磁场的有效范围内，从而实现黄曲霉素B1表面增强拉曼分析检测。由于分子印迹壳层空穴以黄曲霉素B1为模板，经过印迹后洗脱制得，所以该核壳粒子对黄曲霉素B1具有高度特异性，用作SERS基底可以实现黄曲霉素B1的定量检测。
金纳米粒子周围包覆黄曲霉素B1分子印迹聚合物，将壳层的分子印迹聚合物中的模板分子黄曲霉素B1分子洗脱后，分子印迹聚合物内的空穴可以特异性地捕获黄曲霉素B1分子，而实现黄曲霉素B1分子的表面增强拉曼分析检测。
本发明通过在金纳米球表面合成一层分子印迹聚合物壳层，获得拥有高特异性，可以对黄曲霉素B1吸附聚集的核壳结构纳米粒子，实现对黄曲霉素B1的SERS检测。
附图说明
图1为步骤1)中合成金纳米的扫描电子显微镜图。
图2为步骤3)中制备核壳结构纳米粒子(Au@MIP)的透射电子显微镜图。
图3为步骤2)中采用不同单体制备得到的不同核壳粒子的透射电子显微镜图。在图3中，a为单体甲基丙烯酸(本发明)，b为丙烯酸，c为甲基丙烯酸甲酯。
图4为步骤3)中制备核壳纳米粒子拉曼谱图(Au@MIP)和黄曲霉素B1固体拉曼谱图
图5为步骤3)中制备的核壳纳米粒子(Au@MIP)拉曼谱图和步骤4)洗脱后的核壳纳米粒子拉曼谱图以及不含黄曲霉素B1的核壳纳米粒子(Au@NIP)拉曼谱图。
图6为步骤5)中利用分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子对不同浓度黄曲霉素B1检测的SERS谱图。
图7为分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的不同位置检测不同浓度黄曲霉素B1的标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
1)合成粒径为55±10nm的金纳米粒子：
取200mL质量分数为0.01％的氯金酸水溶液于250mL圆底烧瓶中，在磁力搅拌下回流加热至沸腾，然后迅速加入1.4mL质量分数为1％的柠檬酸钠水溶液。圆底烧瓶中的溶液于半分钟内从澄清的浅金色变为深蓝色，继续保持沸腾，溶液颜色从深蓝色逐渐变为酒红色直至稳定。保持沸腾状态40min，使其完全反应后自然冷却至室温，即可得到粒径为55±10nm的金纳米粒子溶胶(参见图1)。
2)合成核壳结构纳米粒子：
采用离心的方法将1)中合成的金溶胶进行浓缩(离心条件为6000r/min，5min)。取等体积浓度为3×10-4mol/L的黄曲霉素B1溶液与浓度为1.2×10-3mol/L的甲基丙烯酸溶液混合后，于4℃下冷藏4h制得预聚合溶液。取浓缩金纳米1mL分散在40mL乙腈中，加入50μL预聚合溶液，50μL浓度为1.1×10-3mol/L的乙二醇二甲基丙烯酸酯溶液，400μL质量分数为1％的聚乙烯吡咯烷酮溶液和20mg偶氮二异丁腈固体，充分搅拌10min。向上述混合溶液中通入氮气10min后，胶塞密封，于60℃油浴中反应7h即可获得核壳粒子。核壳纳米粒子用甲醇-乙酸(v/v＝9:1)在转速6000～7000r/min，离心时间5～7min的条件下清洗，除去上清液，再重复清洗两次后，核壳的壳层分子聚合物中不含黄曲霉素B1；
3)用碳膜铜网捞取2)中制得的核壳粒子，通过透射电子显微镜观察核壳粒子形貌(参见图2)。
图1为第一步中制备金纳米粒子的扫描电子显微镜图。在图1中，标尺为100nm。从图中可以看到由该方法制备的金纳米粒子粒径均一，粒子直径约为55±10nm，形状呈规则球形。
图2为第二步中制得的核壳粒子的透射电子显微镜图。图2标尺为50nm。从图中可以看到纳米粒子的核壳结构。黑色内核为金纳米粒子，粒径约为55nm，金纳米核外层均匀包裹着一层半透明壳层，其厚度约为10nm。
实施例2
1)合成粒径为55±10nm的金纳米粒子：
取200mL质量分数为0.01％的氯金酸水溶液于250mL圆底烧瓶中，在磁力搅拌下回流加热至沸腾，然后迅速加入1.4mL质量分数为1％的柠檬酸钠水溶液。圆底烧瓶中的溶液于半分钟内从澄清的浅金色变为深蓝色，继续保持沸腾，溶液颜色从深蓝色逐渐变为酒红色直至稳定。保持沸腾状态40min，使其完全反应后自然冷却至室温，即可得到粒径为55±10nm的金纳米粒子溶胶。
2)合成核壳结构纳米粒子：
采用离心的方法将1)中合成的金溶胶进行浓缩(离心条件为6000r/min，5min)。取等体积浓度为3×10-4mol/L的黄曲霉素B1溶液分别与浓度同为1.2×10-3mol/L的甲基丙烯酸溶液，丙烯酸溶液和甲基丙烯酸甲酯溶液混合后，于4℃下冷藏4h制得三份不同的预聚合溶液。取浓缩金纳米1mL分散在40mL乙腈中，加入50μL预聚合溶液，50μL浓度为1.1×10- 3mol/L的乙二醇二甲基丙烯酸酯溶液，400μL质量分数为1％的聚乙烯吡咯烷酮溶液和20mg偶氮二异丁腈固体，充分搅拌10min。向上述混合溶液中通入氮气10min后，胶塞密封，于60℃油浴中反应7h即可获得三种由不同功能单体合成的核壳粒子。核壳纳米粒子用甲醇-乙酸(v/v＝9:1)在转速6000～7000r/min，离心5～7min的条件下清洗，除去上清液，再重复清洗两次后，核壳的壳层分子聚合物中不含黄曲霉素B1；
3)用碳膜铜网捞取2)中制得的核壳粒子，通过透射电子显微镜观察核壳粒子形貌(参见图3)。
图3为第二步中制得的三种核壳粒子的透射电子显微镜图。图中标尺为50nm。a)采用甲基丙烯酸单体合成的Au@MIP b)采用丙烯酸单体合成的Au@MIP c)采用甲基丙烯酸甲酯单体合成的Au@MIP。从图中可以看出以甲基丙烯酸为单体同等合成条件下得到的Au@MIP具有完整的壳层且可以实现单个金纳米的包裹，而以丙烯酸为单体和以甲基丙烯酸甲酯为单体合成的Au@MIP壳层不完整且分散不均匀。本专利中是用采用甲基丙烯酸单体合成单个金纳米包裹的壳层完整Au@MIP作为SERS基底检测黄曲霉素B1分子。
实施例3
1)合成粒径为55±10nm的金纳米粒子：
取200mL质量分数为0.01％的氯金酸水溶液于250mL圆底烧瓶中，在磁力搅拌下回流加热至沸腾，然后迅速加入1.4mL质量分数为1％的柠檬酸钠水溶液。圆底烧瓶中的溶液于半分钟内从澄清的浅金色变为深蓝色，继续保持沸腾，溶液颜色从深蓝色逐渐变为酒红色直至稳定。保持沸腾状态40min，使其完全反应后自然冷却至室温，即可得到粒径为55±10nm的金纳米粒子溶胶。
2)合成核壳结构纳米粒子(Au@MIP)：
采用离心的方法将1)中合成的金溶胶进行浓缩(离心条件为6000r/min，5min)。取等体积浓度为3×10-4mol/L的黄曲霉素B1溶液与浓度为1.2×10-3mol/L的甲基丙烯酸溶液混合后，于4℃下冷藏4h制得预聚合溶液。取浓缩金纳米1mL分散在40mL乙腈中，加入50μL预聚合溶液，50μL浓度为1.1×10-3mol/L的乙二醇二甲基丙烯酸酯溶液，400μL质量分数为1％的聚乙烯吡咯烷酮溶液和20mg偶氮二异丁腈固体，充分搅拌10min。向上述混合溶液中通入氮气10min后，胶塞密封，于60℃油浴中反应7h即可获得核壳粒子。核壳纳米粒子用甲醇-乙酸(v/v＝9:1)在转速6000～7000r/min，离心5～7min的条件下进行清洗，除去上清液，再重复清洗两次后，核壳的壳层分子聚合物中不含黄曲霉素B1；
3)合成壳层不含黄曲霉素B1的核壳粒子(Au@NIP)：
采用离心的方法将1)中合成的金溶胶进行浓缩(离心条件为6000r/min，5min)。取浓缩金纳米1mL分散在40mL乙腈中，加入50μL浓度为1.2×10-3mol/L甲基丙烯酸溶液，50μL浓度为1.1×10-3mol/L的乙二醇二甲基丙烯酸酯溶液，400μL质量分数为1％的聚乙烯吡咯烷酮溶液和20mg偶氮二异丁腈固体，充分搅拌10min。向上述混合溶液中通入氮气10min后，胶塞密封，于60℃油浴中反应7h即可获得壳层不含黄曲霉素B1的核壳粒子。
4)Au@MIP、洗脱后的Au@MIP及Au@NIP的拉曼表征
使用XploRA拉曼光谱仪，采谱条件：激光波长为785nm，50倍物镜，激光功率约为1mW，光栅为1200T，小孔直径300μm，狭缝宽度100μm，曝光时间5s，每个谱图采谱三次后取平均值。
图4为制备核壳结构纳米粒子拉曼谱图和黄曲霉素B1固体拉曼谱对比图。对比黄曲霉素B1标准拉曼谱峰可知，核壳结构纳米粒子出现黄曲霉素B1的特征峰，比较明显1129cm-1、1179cm-1、1308cm-1、1591cm-1四处特征峰,其余均为分子印迹聚合物的谱峰。其中，861cm-1处的谱峰为C-O-N伸缩振动峰，1007cm-1处为聚合物烃链伸缩振动峰。1240cm-1左右的峰是C-H的弯曲振动代表C＝C双键的断裂。1380cm-1处的则为单体-CH3上的C-H弯曲振动。对比图说明在壳层中成功印迹了黄曲霉素B1分子，多处黄曲霉素B1的特征峰在核壳粒子的拉曼图上均有所体现(相同出峰位置用直线和红色字标识)，同时分子聚合物的拉曼特征峰也证明了聚合反应的发生，且聚合物壳层的拉曼峰与黄曲霉素B1特征峰互不干扰，证明聚合物壳层不影响黄曲霉素B1的SERS检测。
图5为第二步中制备的核壳结构纳米粒子(Au@MIP)拉曼谱图和洗脱后的纳米粒子拉曼谱图以及第三步合成的不含黄曲霉素B1的核壳纳米粒子(Au@NIP)拉曼谱图。对比洗脱前后核壳纳米粒子的拉曼谱图以及不含模板分子黄曲霉素B1的拉曼谱图可知，洗脱后的核壳纳米粒子和不含黄曲霉素B1的核壳纳米粒子，没有黄曲霉素B1的特征峰即1129cm-1、1179cm-1、1308cm-1、1591cm-1处的峰，谱图中出现的峰均为分子印迹聚合物的谱峰，说明洗脱比较彻底，洗脱后核壳纳米纳米粒子不再含有黄曲霉素B1分子。
实施例4
1)合成粒径为55±10nm的金纳米粒子：
取200mL质量分数为0.01％的氯金酸水溶液于250mL圆底烧瓶中，在磁力搅拌下回流加热至沸腾，然后迅速加入1.4mL质量分数为1％的柠檬酸钠水溶液。圆底烧瓶中的溶液于半分钟内从澄清的浅金色变为深蓝色，继续保持沸腾，溶液颜色从深蓝色逐渐变为酒红色直至稳定。保持沸腾状态40min，使其完全反应后自然冷却至室温，即可得到粒径为55±10nm的金纳米粒子溶胶。
2)合成核壳结构纳米粒子：
采用离心的方法将1)中合成的金溶胶进行浓缩(离心条件为6000r/min，5min)。取等体积浓度为3×10-4mol/L的黄曲霉素B1溶液与浓度为1.2×10-3mol/L的甲基丙烯酸溶液混合后，于4℃下冷藏4h制得预聚合溶液。取浓缩金纳米1mL分散在40mL乙腈中，加入50μL预聚合溶液，50μL浓度为1.1×10-3mol/L的乙二醇二甲基丙烯酸酯溶液，400μL质量分数为1％的聚乙烯吡咯烷酮溶液和20mg偶氮二异丁腈固体，充分搅拌10min。向上述混合溶液中通入氮气10min后，胶塞密封，于60℃油浴中反应7h即可获得核壳粒子。核壳纳米粒子用甲醇-乙酸(v/v＝9:1)在转速6000～7000r/min，离心5～7min的条件下清洗，除去上清液，再重复清洗两次后，核壳的壳层分子聚合物中不含黄曲霉素B1；
3)黄曲霉素B1的定量SERS检测：
将上一步骤经过洗脱的纳米粒子离心浓缩后与不同浓度的黄曲霉素B1溶液混合，静置吸附30min后，取少量滴在干净的硅片上，自然干燥后在拉曼光谱仪下进行SERS检测。
拉曼谱图通过XploRA拉曼光谱仪得到，采谱条件：激光波长为785nm，50倍物镜，激光功率约为1mW，光栅为1200T，小孔直径300μm，狭缝宽度100μm，曝光时间5s，每个谱图采谱三次后取平均值。
图6为第二步中制备的核壳结构纳米粒子吸附不同浓度黄曲霉素B1后测得的SERS谱图，a～i代表黄曲霉素B1的浓度为10-4mol/L～10-12mol/L。从图中可以看到，1129cm-1、1179cm-1、1308cm-1、1591cm-1处黄曲霉素B1的峰强度随着黄曲霉素B1浓度下降而降低，这些特征峰出现可以作为黄曲霉素B1定性分析的依据，判断样品中是否含有黄曲霉素B1。
图7为第二步中制备的核壳结构纳米粒子吸附不同浓度黄曲霉素B1后，取同浓度的样品上不同的6处分别进行SERS检测，以黄曲霉素B1浓度的负对数为横坐标，1591cm-1处特征峰峰强度为纵坐标，做出特征峰强度随黄曲霉素B1浓度变化的拟合曲线。曲线相关系数R2在0.99以上，显示出良好的线性关系。
以图7中标准曲线为工作曲线，分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子检测五种不同浓度黄曲霉素B1的回收率如表1所示。
表1
由表1可知，黄曲霉素B1回收率在89.84％～101.12％之间，说明图7中的标准曲线是可行而且稳定的，相对标准偏差在3.51％～15.44％之间，在可接受范围内。

Claims (10)

1.基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素B1分子SERS检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1)合成金纳米粒子；
2)配制预聚合溶液；
3)合成核壳纳米粒子；
4)壳层内模板分子的洗脱；
5)黄曲霉素B1的SERS定量分析检测。
2.如权利要求1所述基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素B1分子SERS检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述合成金纳米粒子的具体方法为：取氯金酸水溶液于容器中，回流加热至沸腾，再加入柠檬酸钠水溶液，保持沸腾状态继续搅拌，加入柠檬酸钠后，溶液颜色首先由淡黄色迅速变成深蓝色，然后逐渐变成酒红色并保持稳定40min后，即可制得金纳米粒子。
3.如权利要求2所述基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素B1分子SERS检测方法，其特征在于所述氯金酸水溶液与柠檬酸钠水溶液的体积比为(100～200)︰(1～2)，所述氯金酸水溶液采用质量分数为0.01％的氯金酸水溶液，所述柠檬酸钠水溶液采用质量分数为1％的柠檬酸钠水溶液。
4.如权利要求2所述基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素B1分子SERS检测方法，其特征在于所述回流加热至沸腾是在磁力搅拌下回流加热至沸腾；所述金纳米粒子为球形或椭圆形金纳米粒子，粒径为40～80nm；氯金酸浓度为0.1～0.3mmol/L，柠檬酸钠浓度为30～40mmol/L；所述回流加热的时间可为30～50min。
5.如权利要求1所述基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素B1分子SERS检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述配制预聚合溶液的具体方法为：配制甲基丙烯酸溶液，加入黄曲霉素B1溶液，混匀后冷藏静置，即得预聚合溶液。
6.如权利要求5所述基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素B1分子SERS检测方法，其特征在于所述甲基丙烯酸溶液的摩尔浓度为(1.1～1.3)×10-3mol/L；所述黄曲霉素B1溶液与甲基丙烯酸的浓度比可为1︰(4～5)；所述冷藏的温度可为3～5℃，静置的时间可为4～6h。
7.如权利要求1所述基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素B1分子SERS检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述合成核壳纳米粒子的具体方法为：将金溶胶浓缩，重新分散在装有乙腈的容器中，加入步骤2)得到的预聚合溶液，再加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯溶液和聚乙烯吡咯烷酮溶液，然后加入自由基反应的引发剂偶氮二异丁腈，搅拌混匀，通氮气排除体系内空气后密封，恒温油浴反应，即得以金纳米粒子为核，黄曲霉素B1分子印迹聚合物为壳层的核壳纳米粒子。
8.如权利要求7所述基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素B1分子SERS检测方法，其特征在于所述将金溶胶浓缩是将40mL金溶胶浓缩至1mL；所述乙腈的加入量可为40～60mL；所述乙二醇二甲基丙烯酸酯溶液的摩尔浓度可为(1.1～1.3)×10-3mol/L，所述聚乙烯吡咯烷酮溶液的质量分数可为1％～1.5％；所述偶氮二异丁腈的加入量可为20～50mg；所述恒温油浴反应的温度可为60～65℃，恒温油浴反应的时间可为6～8h。
9.如权利要求1所述基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素B1分子SERS检测方法，其特征在于在步骤4)中，所述壳层内模板分子的洗脱的具体方法为：将步骤3)制得的核壳纳米粒子用甲醇和乙酸混合液在转速6000～7000r/min下离心5～7min，再清洗至不含黄曲霉素B1。
所述甲醇和乙酸混合液中的甲醇与乙酸的体积比可为9︰1；所述再清洗至不含黄曲霉素B1，是将核壳纳米粒子在拉曼检测时不出现黄曲霉素B1在1129cm-1、1179cm-1、1308cm-1和1591cm-1的特征峰。
10.如权利要求1所述基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素B1分子SERS检测方法，其特征在于在步骤5)中，所述黄曲霉素B1的SERS定量分析检测的具体方法为：将步骤4)得到的纳米粒子与黄曲霉素B1溶液进行混合，静置吸附后，取混合液滴在硅片上，待其自然干燥后在拉曼光谱仪上进行SERS定量分析检测，表面增强拉曼光谱检测的激发光源波长可为500～800nm，激光光斑可为1～2μm；所述静置吸附的时间可为1～2h；所述SERS定量分析检测是以固体黄曲霉素B1的1129cm-1、1179cm-1、1308cm-1和1591cm-1的四处特征峰为判断依据，定性分析黄曲霉素B1是否存在，该特征峰判断依据是对比固体黄曲霉素B1的拉曼谱图与含有黄曲霉素B1的核壳纳米粒子的拉曼谱图后，在核壳纳米粒子谱图上出现的黄曲霉素B1特征峰，且经过洗脱的核壳纳米粒子和不含黄曲霉素的核壳纳米粒子都没有。
CN201710153653.7A 2017-03-15 2017-03-15 基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素b1分子sers检测方法 Active CN106928397B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710153653.7A CN106928397B (zh) 2017-03-15 2017-03-15 基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素b1分子sers检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710153653.7A CN106928397B (zh) 2017-03-15 2017-03-15 基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素b1分子sers检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106928397A true CN106928397A (zh) 2017-07-07
CN106928397B CN106928397B (zh) 2019-03-05

Family

ID=59433800

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710153653.7A Active CN106928397B (zh) 2017-03-15 2017-03-15 基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素b1分子sers检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106928397B (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107462564A (zh) * 2017-07-13 2017-12-12 江苏大学 一种基于银超晶体的黄曲霉毒素b1快速免标记检测方法
CN107884385A (zh) * 2017-11-15 2018-04-06 东华大学 一种核壳增强拉曼光谱基底的制备及测试方法
CN108489963A (zh) * 2018-04-24 2018-09-04 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种对丙烯酰胺特异性识别和高敏分析的sers基底制备方法
CN110426383A (zh) * 2019-08-09 2019-11-08 国家城市供水水质监测网太原监测站 一种水体中抗生素的检测方法
CN112748098A (zh) * 2019-10-30 2021-05-04 天津大学 可重复使用的特异性表面增强拉曼传感器及其制备方法
CN113092442A (zh) * 2021-04-09 2021-07-09 上海海洋大学 一种快速检测组胺的方法
CN113402683A (zh) * 2021-06-30 2021-09-17 齐鲁工业大学 一种核壳结构金纳米粒子其制备方法和应用
CN113433314A (zh) * 2020-03-23 2021-09-24 中国农业大学 一种基于可视纳米金检测线的黄曲霉毒素标志物sers侧流免疫传感分析方法
CN114252428A (zh) * 2021-12-27 2022-03-29 江南大学 一种基于氧化亚铜纳米复合酶的催化反应对真菌毒素的表面增强拉曼检测法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102621209A (zh) * 2012-04-11 2012-08-01 无锡市金坤生物工程有限公司 一种检测黄曲霉毒素b1的印迹膜传感电极

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102621209A (zh) * 2012-04-11 2012-08-01 无锡市金坤生物工程有限公司 一种检测黄曲霉毒素b1的印迹膜传感电极

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TEHILA SHAHAR等: ""Nanosphere molecularly imprinted polymers doped with gold nanoparticles for high selectivity molecular sensors"", 《NANO RESEARCH》 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107462564B (zh) * 2017-07-13 2020-03-31 江苏大学 一种基于银超晶体的黄曲霉毒素b1快速免标记检测方法
CN107462564A (zh) * 2017-07-13 2017-12-12 江苏大学 一种基于银超晶体的黄曲霉毒素b1快速免标记检测方法
CN107884385A (zh) * 2017-11-15 2018-04-06 东华大学 一种核壳增强拉曼光谱基底的制备及测试方法
CN108489963A (zh) * 2018-04-24 2018-09-04 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种对丙烯酰胺特异性识别和高敏分析的sers基底制备方法
CN110426383A (zh) * 2019-08-09 2019-11-08 国家城市供水水质监测网太原监测站 一种水体中抗生素的检测方法
CN112748098A (zh) * 2019-10-30 2021-05-04 天津大学 可重复使用的特异性表面增强拉曼传感器及其制备方法
CN112748098B (zh) * 2019-10-30 2022-09-16 天津大学 可重复使用的特异性表面增强拉曼传感器及其制备方法
CN113433314B (zh) * 2020-03-23 2022-06-10 中国农业大学 一种基于可视纳米金检测线的黄曲霉毒素标志物sers侧流免疫传感分析方法
CN113433314A (zh) * 2020-03-23 2021-09-24 中国农业大学 一种基于可视纳米金检测线的黄曲霉毒素标志物sers侧流免疫传感分析方法
CN113092442A (zh) * 2021-04-09 2021-07-09 上海海洋大学 一种快速检测组胺的方法
CN113092442B (zh) * 2021-04-09 2023-12-22 上海海洋大学 一种快速检测组胺的方法
CN113402683B (zh) * 2021-06-30 2022-05-31 齐鲁工业大学 一种核壳结构金纳米粒子其制备方法和应用
CN113402683A (zh) * 2021-06-30 2021-09-17 齐鲁工业大学 一种核壳结构金纳米粒子其制备方法和应用
CN114252428A (zh) * 2021-12-27 2022-03-29 江南大学 一种基于氧化亚铜纳米复合酶的催化反应对真菌毒素的表面增强拉曼检测法
CN114252428B (zh) * 2021-12-27 2024-03-08 江南大学 一种基于氧化亚铜纳米复合酶的催化反应对真菌毒素的表面增强拉曼检测法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106928397B (zh) 2019-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106928397B (zh) 基于分子印迹聚合物包金核壳纳米粒子的黄曲霉素b1分子sers检测方法
Niu et al. Core-shell nanoparticles coated with molecularly imprinted polymers: a review
Li et al. Colorimetric sensor strips for lead (II) assay utilizing nanogold probes immobilized polyamide-6/nitrocellulose nano-fibers/nets
CN103837519B (zh) 表面增强拉曼光谱测量多种多氯联苯的方法
Liu et al. Ultrasensitive and facile detection of multiple trace antibiotics with magnetic nanoparticles and core-shell nanostar SERS nanotags
Zhang et al. A silica-based SERS chip for rapid and ultrasensitive detection of fluoride ions triggered by a cyclic boronate ester cleavage reaction
CN108318421B (zh) 一种磁性石墨烯分子印迹拉曼增强基底及制备方法、应用
Li et al. A high-performance SERS-imprinted sensor doped with silver particles of different surface morphologies for selective detection of pyrethroids in rivers
Huang et al. Visual and photometric determination of histamine using unmodified gold nanoparticles
CN102962472A (zh) 一种金银合金纳米粒子的制备方法
Jia et al. Synthesis and application of colloidal beta-cyclodextrin-decorated silver nanoparticles for rapid determination of malachite green in environmental water using surface-enhanced Raman spectroscopy
CN111220592B (zh) 基于表面增强拉曼光谱的羟基山椒素快速检测方法
CN106383110B (zh) 基于纳米金标记适体传感器的ota化学发光检测方法
Bi et al. Determination of 6-thioguanine based on localized surface plasmon resonance of gold nanoparticle
CN105136758B (zh) 一种对农残检测的Eu3+标记分子印记传感器制备方法
Liu et al. Resonance Rayleigh scattering spectral method for the determination of raloxifene using gold nanoparticle as a probe
Zhang et al. Rapid determination of illegal additives chrysoidin and malachite green by surface-enhanced Raman scattering with silanized support based substrate
Zhao et al. A sensitive fluorescent assay based on gold-nanoclusters coated on molecularly imprinted covalent organic frameworks and its application in malachite green detection
CN106645085B (zh) 基于超支化纳米结构的表面增强拉曼生物分子检测方法
Chen et al. A highly sensitive surface-enhanced Raman scattering sensor with MIL-100 (Fe)/Au composites for detection of malachite green in fish pond water
Ghann et al. Lipoic acid decorated gold nanoparticles and their application in the detection of lead ions
Hu et al. High-performance homogeneous carboxymethylcellulose-stabilized Au@ Ag NRs-CMC surface-enhanced Raman scattering chip for thiram detection in fruits
CN109781694A (zh) 一种葡萄酒中金属离子的快速检测方法
Wei et al. A three-dimensional gold nanoparticles spherical liquid array for SERS sensitive detection of pesticide residues in apple
Liu et al. A reproducible gold SERS substrate assisted by silver nanoparticles without using extra aggregation agents

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant