CN114252428B - 一种基于氧化亚铜纳米复合酶的催化反应对真菌毒素的表面增强拉曼检测法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于氧化亚铜纳米复合酶的催化反应对真菌毒素的表面增强拉曼检测法。将Cu2O@Au‑cDNA与Au‑AgNPs‑ToxinApt通过碱基配对构建纳米组装体，并与含真菌毒素的待测液、3,3',5,5'‑四甲基联苯胺、过氧化氢混合孵育，检测混合孵育所得反应液的拉曼光谱信号强度，进行定性或定量的检测。本发明选择了氧化亚铜纳米立方体这种无毒的半导体材料作为基底，在表现出SERS性能的同时，有着优异的过氧化氢酶活性，利于后面的催化反应，相较于传统的贵金属基底，成本显著下降，并易于大量生产。
Description
技术领域
本发明纳米材料检测真菌毒素技术领域，尤其是指一种基于氧化亚铜纳米复合酶的催化反应对真菌毒素的表面增强拉曼检测法。
背景技术
真菌毒素是曲霉属、青霉属和镰刀菌属等真菌在生长繁殖过程中产生的次级代谢物，是具有热稳定性和高生物蓄积能力的天然毒性化合物。它们主要包括以T-2毒素为代表的A类(黄曲霉毒素-AFs、伏马菌素-FB、赭曲霉毒素和单端孢霉烯-TS)和以脱氧雪腐镰刀菌烯醇-DON和玉米赤霉烯酮-ZEN为代表的B类，并广泛存在于各种粮食谷物、油籽和水果中。据联合国粮食及农业组织估计，全球近25％的食品都极易受到污染。经食用后，易对人类造成致癌致畸和致突变的作用。所以大多数国家均规定了真菌毒素在各类食品中的最大限量值。
在过去几十年里，高效液相色谱(HPLC)、液相-质谱(LC/MS)和薄层色谱(TLC)等传统的仪器分析方法应用及其广泛，但需要大型仪器以及复杂的样品预处理，故不适用于快速的食品安全检测。目前，基于适配体对靶标的高亲和和高特异性，研究学者们设计了一系列新型的适配体传感器，包括荧光，电化学，光电化学、比色和表面增强拉曼光谱。这些传感器具有高选择、高灵敏和简单快速的特点，可成为检测真菌毒素的有效分析手段。
表面增强拉曼光谱是一种利用贵金属纳米材料的电磁场增强以及和吸附分子之间的化学增强使拉曼信号发生显著增强的光谱技术，可实现无损检测和单分子水平检测，并有着宽松的检测条件。目前，较简便的SERS指纹检测是通过SERS活性基底和分析物之间紧密结合来获得并增强其拉曼特征图谱，从而实现检测。AFB1、OTA、ZEN和DON等真菌毒素的指纹图谱已获得，但这种检测灵敏度较低，故无法满足需求。紧接着，基于拉曼信号分子的SERS标签(由金属纳米材料、拉曼信号分子、保护层和识别分子组成)被引入了检测传感器的设计中，实现了对毒素的灵敏检测。但这类型设计往往需要拉曼信号分子在传感器整个制备和检测阶段保持一定的稳定性才能实现准确灵敏检测。因此，基于纳米酶的催化反应来产生和放大拉曼信号的检测手段是重要的，可通过最后催化产物的输出拉曼信号来实现对真菌毒素更加准确灵敏的检测，从而实现对毒素污染的监控。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于氧化亚铜纳米复合酶的催化反应对真菌毒素的表面增强拉曼检测法。
一种基于氧化亚铜纳米复合酶的催化反应对真菌毒素的表面增强拉曼检测法，将纳米立方体Cu2O@Au-cDNA与纳米球中空Au-Ag NPs-ToxinApt通过碱基配对构建纳米组装体，并与含真菌毒素的待测液、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、过氧化氢混合孵育，检测混合孵育所得反应液的拉曼光谱信号强度，进行定性或定量的检测。
在本发明的一个实施例中，所述纳米立方体Cu2O@Au-cDNA通过以下方法制备得到：将巯基化的真菌毒素适配体的互补链溶液与磷酸三氯乙酯(TCEP)溶液混合孵育，并加入Cu2O@AuNCs溶液，孵育过后加入6-巯基-1-己醇(MCH)，孵育即得所述纳米立方体Cu2O@Au-cDNA，
所述巯基化的真菌毒素适配体的互补链序列为5’-CAGAGA GACAAC ACG TGC CCAAC-SH-3’或5’-CCT TTA CGC CAC CCA CAC CCG ATC-SH-3’。
在本发明的一个实施例中，所述巯基化的真菌毒素适配体的互补链溶液与磷酸三氯乙酯(TCEP)溶液的摩尔浓度的比为1:50-100。
在本发明的一个实施例中，所述6-巯基-1-己醇的浓度为1-2.5μM。
在本发明的一个实施例中，所述纳米球中空Au-Ag NPs-Apt通过以下方法制备得到：将巯基化的真菌毒素适配体溶液与磷酸三氯乙酯(TCEP)溶液混合孵育，并加入Au-AgNPs溶液，加入盐溶液老化，孵育即得所述纳米球中空Au-Ag NPs-Apt；
所述巯基化的真菌毒素适配体的序列为5’-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGTGTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CC-SH-3’或5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAAAGG GAGCAT CGGACA-SH-3’。
在本发明的一个实施例中，所述巯基化的真菌毒素适配体溶液与磷酸三氯乙酯(TCEP)溶液的摩尔浓度的比为1:50-100。
在本发明的一个实施例中，所述盐溶液为氯化钠溶液。
在本发明的一个实施例中，所述真菌毒素为黄曲霉毒素(AFB1)或赭曲霉毒素A。
在本发明的一个实施例中，检测拉曼信号条件：激发波长785nm。
在本发明的一个实施例中，含真菌毒素的待测液的质量浓度为0.001-100ng/mL。
在本发明的一个实施例中，进行定量检测时，标准曲线的制备方法如下：取等体积不同浓度的真菌毒素的标准溶液，与3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、过氧化氢与纳米组装体混合孵育，检测所得混合孵育的反应液在785nm激光激发下的拉曼光谱信号，以所述真菌毒素的标准溶液的浓度的对数值作为横坐标，以3,3',5,5'-四甲基联苯胺氧化后产物在1604cm-1的拉曼强度(I1604)为纵坐标，建立标准曲线。
在本发明的一个实施例中，所述真菌毒素的标准溶液的质量浓度为0.001-100ng/mL。
(1)本发明通过分别制备粒径约为260-320nm的高催化纳米立方体(Cu2O@Au-cDNA)和粒径约为42-53nm的高增强纳米球(中空Au-Ag NPs-ToxinApt)，利用毒素适配体和互补链之间的碱基互补配对实现了卫星结构的构建(Cu2O@Au-cDNA-ToxinApt-Au-AgNPs)。
(2)本发明利用纳米材料的催化和SERS增强性能，适配体对靶标的高亲和力先获取不同组装程度的纳米酶(纳米组装体)，再对TMB进行催化反应得到其氧化产物ox TMB，并利用中空Au-Ag NPs对产物的特征拉曼信号有着显著增强效应，实现了对真菌毒素的输出信号检测法。相较于传统的SERS标签传感器，更有利于准确的信号输出。
(3)本发明选择了氧化亚铜纳米立方体这种无毒的半导体材料作为基底，在表现出SERS性能的同时，有着优异的过氧化氢酶活性，利于后面的催化反应，相较于传统的贵金属基底，成本显著下降，并易于大量生产。
(4)本发明在氧化亚铜纳米立方体外自组装致密的金纳米球，通过复合纳米材料之间的协同作用增强了过氧化氢酶活性，并提高了材料的稳定性。
(5)本发明选用纳米酶，相较于天然酶，有着低成本、不易变性和易制备的优点。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明构建了一种基于金银铜纳米材料的过氧化氢酶活性和SERS性能来实现对真菌毒素的输出信号检测机制。首先分别通过简单的水热反应和电偶置换成功制备了高催化纳米立方体(Cu2O@Au-cDNA)和高增强纳米球(中空Au-Ag NPs-ToxinApt)，其次二者分别用真菌毒素适配体的互补链和其适配体进行了一定数量的功能化，紧接着利用二者的粒径差异和核酸自组装成功构建了“卫星”结构的组装体(Cu2O@Au-cDNA-ToxinApt-Au-AgNPs)，最后由于适配体对靶标的高亲和力，真菌毒素的出现会从组装体上竞争下纳米球，纯化后得到了具有不同程度SERS增强性能的纳米组装体，再通过在醋酸缓冲液中的催化反应使无色的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)生成了蓝色的氧化产物(ox TMB)，实现了拉曼信号的产生和放大，这种信号输出设计在一定程度上提高了检测的准确性。通过拉曼光谱仪采集检测基底在不同浓度真菌毒素下的拉曼信号，绘制真菌毒素检测的标准曲线，实现对真菌毒素高灵敏的定量检测目的，该方法适用于食品安全检测领域。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明实施例1中所得Cu2O NCs(A)和Cu2O@AuNCs(B)的扫描电镜表征图(SEM)。
图2是本发明实施例1中所得中空Au-AgNPs的透射电镜表征图(TEM)(A)；AgNPs和中空Au-AgNPs的紫外可见光谱图(B)。
图3是本发明实施例1中基于中空Au-Ag NPs，Cu2O@Au NCs，Cu2O@Au-Au-AgNPs纳米复合酶分别对TMB和H2O2的催化反应所生成氧化产物ox TMB的紫外可见光谱图(A)和表面增强拉曼光谱图(B)。
图4是本发明实施例1中组装体Cu2O@Au-Au-AgNPs在不同浓度黄曲霉毒素处理后的催化反应产物ox TMB的拉曼光谱图(A)；相应的标准曲线(B)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
步骤1)制备Cu2O@AuNCs-cDNA：
Cu2O NCs：将85.42mg氯化铜粉末加入装有50mL超纯水的烧瓶中搅拌至混合均匀，再用注射泵把10mL浓度为1M的氢氧化钠水溶液匀速滴加，颜色逐渐加深为蓝色，在溶液中通入氮气15min后，紧接着用注射泵把5mL浓度为0.6M的抗坏血酸水溶液匀速滴加完成，继续保持在室温下剧烈搅拌反应100min，溶液颜色逐渐由果绿色变为黄色最后变为橙红色，反应产物用乙醇和水反复离心洗涤，最后60℃下真空干燥10h保存。
Cu2O@AuNCs：取上述粉末溶于超纯水，经超声分散后制得浓度为12.5mg/mL的水溶液。取前者1mL与1mL柠檬酸钠水溶液(1wt％)超声混合15min，再迅速加入到50mL浓度为0.01wt％的氯金酸水溶液，溶液颜色迅速由淡黄色转变为了深绿色，继续在室温下剧烈搅拌反应15min，反应产物用乙醇和水反复洗涤多次，最后60℃下真空干燥10h后保存。
Cu2O@AuNCs-cDNA：巯基化的互补链溶液与磷酸三氯乙酯(TCEP)溶液以物质的量1:100混合，在室温下孵育1h。20μL浓度为50μM的SH-cDNA加入到200μL 0.25mg/mL Cu2O@AuNCs，逐步加盐老化至其终浓度为0.05M，37℃振荡孵育过夜，多次离心去除多余的核酸链，随后用2μM 6-巯基-1-己醇(MCH)在37℃下孵育1h，最后离心浓缩。
巯基修饰的AFB1适配体的互补链：5’-CAGAGA GAC AAC ACG TGC CCAAC-SH-3’
图1Cu2ONCs(A)和Cu2O@AuNCs(B)的扫描电镜表征图(SEM)。
步骤2)制备Au-AgNPs-AFB1Apt：
AgNPs：50mL浓度为0.1mM的硝酸银水溶液经油浴加热至沸腾，迅速加入1mL浓度为0.1M的柠檬酸钠水溶液，继续保持沸腾搅拌1h，溶液颜色由无色逐渐转变为淡黄色。
Au-AgNPs：将反应温度控制为90℃，匀速滴加1.5mL浓度为1mM的氯金酸水溶液，继续保持反应45min，颜色最终转变为淡紫色，放于-4℃保存用于后续反应。
Au-AgNPs-AFB1Apt：巯基化的适配体溶液与磷酸三氯乙酯(TCEP)溶液以物质的量1:100混合，在室温下孵育1h。10μL浓度为50μM的SH-AFB1apt加入到200μL浓缩五倍的中空Au-AgNPs中，用2MNaCl溶液逐步老化，至其终浓度为0.1M，继续37℃过夜孵育，随后离心浓缩。
巯基修饰的AFB1适配体链：5’-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGCCCTTCG CTAGGC CC-SH-3’。
图2中空Au-AgNPs的透射电镜表征图(TEM)(A)；Ag NPs和中空Au-AgNPs的紫外可见光谱图(B)。由图2可知，随着氯金酸溶液的增加，越来越多的银被置换，从而形成了纳米空腔结构，同时在560nm处出现了新的表面等离子共振峰。
步骤3)构建Cu2O@Au-cDNA-ToxinApt-Au-Ag NPs：
Cu2O@Au NCs-cDNA溶液和中空Au-Ag NPs-ToxinApt溶液以一定体积比1:1混合，37℃下轻微振荡孵育3h，经过静置和离心纯化后成功构建组装体，放于-4℃保存用于后续的检测反应。
图3基于中空Au-Ag NPs，Cu2O@Au NCs，Cu2O@Au-Au-Ag NPs纳米复合酶分别对TMB和H2O2的催化反应所生成氧化产物ox TMB的紫外可见光谱图(A)和表面增强拉曼光谱图(B)。由图3可知，通过Cu2O@AuNCs和Au-Ag NPs的催化反应可知，前者有优异的催化活性但SERS增强性能较弱，后者虽然催化活性很弱但SERS增强性能很好，所以在Cu2O@Au-Au-AgNPs纳米复合酶的催化反应中，可以利用组装前后SERS增强的变化从而实现对靶标的检测。
步骤4)建立检测AFB1的标准曲线：
将AFB1标准溶液以不同的终浓度(0.001、0.01、0.1、0、1、10、100ng/mL)分别加入组装体溶液中在37℃下轻微振荡孵育2h，经纯化后，不同组装程度的纳米复合物用于后续的催化反应。具体为，在227μL的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝4)中分别加入10μL的纳米酶、6.5μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，30mM)和6.5μL的过氧化氢(0.7M)，在37℃下孵育30分钟，最后取适量溶液在785nm的激发波长下获取拉曼光谱。将AFB1浓度的对数值作为横坐标，以其氧化产物(ox TMB)在1604cm-1的拉曼强度(I1604)为纵坐标确定标准曲线，实验结果见图4。由实验结果可知：Log10CAFB1和I1604呈现了一个良好的线性关系，对应的回归方程为Y＝11059.33-3602.40X(相关系数R2＝0.991)，验证了构建的SERS适配体传感器可实现对AFB1的灵敏检测。
图4组装体Cu2O@Au-Au-Ag NPs在不同浓度黄曲霉毒素处理后的催化反应产物oxTMB的拉曼光谱图(A)；相应的标准曲线(B)。由实验结果可知：Log10CAFB1和I1604呈现了一个良好的线性关系，对应的回归方程为Y＝11059.33-3602.40X(相关系数R2＝0.991)，验证了利用核酸互补自组装的SERS适配体传感器可实现对AFB1的灵敏检测。
实施例2
步骤1)制备Cu2O@AuNCs-cDNA：
Cu2O NCs：将85.42mg氯化铜粉末加入装有50mL超纯水的烧瓶中搅拌至混合均匀，再用注射泵把10mL浓度为1M的氢氧化钠水溶液匀速滴加，颜色逐渐加深为蓝色，在溶液中通入氮气15min后，紧接着用注射泵把5mL浓度为0.6M的抗坏血酸水溶液匀速滴加完成，继续保持在室温下剧烈搅拌反应100min，溶液颜色逐渐由果绿色变为黄色最后变为橙红色，反应产物用乙醇和水反复离心洗涤，最后60℃下真空干燥10h保存。
Cu2O@AuNCs：取上述粉末溶于超纯水，经超声分散后制得浓度为12.5mg/mL的水溶液。取前者1mL与1mL柠檬酸钠水溶液(1wt％)超声混合15min，再迅速加入到50mL浓度为0.01wt％的氯金酸水溶液，溶液颜色迅速由淡黄色转变为了深绿色，继续在室温下剧烈搅拌反应15min，反应产物用乙醇和水反复洗涤多次，最后60℃下真空干燥10h后保存。
Cu2O@AuNCs-cDNA：巯基化的互补链溶液与磷酸三氯乙酯(TCEP)溶液以物质的量1:100混合，在室温下孵育1h。20μL浓度为50μM的SH-cDNA加入到200μL 0.25mg/mL Cu2O@AuNCs，逐步加盐老化至其终浓度为0.05M，37℃振荡孵育过夜，多次离心去除多余的核酸链，随后用2μM 6-巯基-1-己醇(MCH)在37℃下孵育1h，最后离心浓缩。
巯基修饰的OTA适配体的互补链：5’-CCT TTACGC CAC CCA CAC CCG ATC-SH-3’。
步骤2)制备Au-Ag NPs-OTAApt：
Ag NPs：50mL浓度为0.1mM的硝酸银水溶液经油浴加热至沸腾，迅速加入1mL浓度为0.1M的柠檬酸钠水溶液，继续保持沸腾搅拌1h，溶液颜色由无色逐渐转变为淡黄色。
Au-Ag NPs：将反应温度控制为90℃，匀速滴加1.5mL浓度为1mM的氯金酸水溶液，继续保持反应45min，颜色最终转变为淡紫色，放于-4℃保存用于后续反应。
Au-Ag NPs-AFB1Apt：巯基化的适配体溶液与磷酸三氯乙酯(TCEP)溶液以物质的量1:100混合，在室温下孵育1h。10μL浓度为50μM的SH-AFB1apt加入到200μL浓缩五倍的中空Au-Ag NPs中，用2M NaCl溶液逐步老化，至其终浓度为0.1M，继续37℃过夜孵育，随后离心浓缩。
巯基修饰的OTA适配体链：5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAAAGG GAG CATCGGACA-SH-3’。
步骤3)构建Cu2O@Au-cDNA-OTAApt-Au-Ag NPs：
Cu2O@Au NCs-cDNA溶液和中空Au-Ag NPs-ToxinApt溶液以一定体积比1:1混合，37℃下轻微振荡孵育3h，经过静置和离心纯化后成功构建组装体，放于-4℃保存用于后续的检测反应。
步骤4)建立检测OTA的标准曲线：
将OTA标准溶液以不同的终浓度(0.001、0.01、0.1、0、1、10、100ng/mL)分别加入组装体溶液中在37℃下轻微振荡孵育2h，经纯化后，不同组装程度的纳米复合物用于后续的催化反应。具体为，在227μL的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝4)中分别加入10μL的纳米酶、6.5μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，30mM)和6.5μL的过氧化氢(0.7M)，在37℃下孵育30分钟，最后取适量溶液在785nm的激发波长下获取拉曼光谱。将OTA浓度的对数值作为横坐标，以其氧化产物(ox TMB)在1604cm-1的拉曼强度(I1604)为纵坐标确定标准曲线。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种基于氧化亚铜纳米复合酶的催化反应对真菌毒素的表面增强拉曼检测法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 1
cagagagaca acacgtgccc aacsh 25
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 2
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggacash 38
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 3
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccsh 49
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 4
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggacash 38
Claims (8)
1.一种基于氧化亚铜纳米复合酶的催化反应对真菌毒素的表面增强拉曼检测法，其特征在于，将纳米立方体Cu2O@Au-cDNA与纳米球中空Au-Ag NPs-Apt通过碱基配对构建纳米组装体，并与含真菌毒素的待测液、3,3',5,5'-四甲基联苯胺、过氧化氢混合孵育，检测混合孵育所得反应液的拉曼光谱信号强度，进行定性或定量的检测；
所述纳米立方体Cu2O@Au-cDNA通过以下方法制备得到：将巯基化的真菌毒素适配体的互补链溶液与磷酸三氯乙酯溶液混合孵育，并加入Cu2O@Au NCs溶液，孵育过后加入6-巯基-1-己醇，孵育即得所述纳米立方体Cu2O@Au-cDNA；
所述巯基化的真菌毒素适配体的互补链序列为5’-CAG AGA GAC AAC ACG TGC CCAAC-SH -3’或5’-CCT TTA CGC CAC CCA CAC CCG ATC-SH -3’；
所述Au-Ag NPs-Apt通过以下方法制备得到：将巯基化的真菌毒素适配体溶液与磷酸三氯乙酯溶液混合孵育，并加入Au-Ag NPs溶液，加入盐溶液老化，孵育即得所述纳米球中空Au-Ag NPs-Apt；
所述巯基化的真菌毒素适配体的序列为5’-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTCTCG TGC CCT TCG CTA GGC CC-SH-3’或5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CATCGG ACA-SH-3’。
2.根据权利要求1所述的表面增强拉曼检测法，其特征在于，所述巯基化的真菌毒素适配体的互补链溶液与磷酸三氯乙酯溶液的摩尔浓度的比为1:50-100。
3.根据权利要求1所述的表面增强拉曼检测法，其特征在于，所述6-巯基-1-己醇的浓度为1-2.5 μM。
4.根据权利要求1所述的表面增强拉曼检测法，其特征在于，所述巯基化的真菌毒素适配体溶液与磷酸三氯乙酯溶液的摩尔浓度的比为1:50-100。
5.根据权利要求1所述的表面增强拉曼检测法，其特征在于，所述真菌毒素为黄曲霉毒素或赭曲霉毒素A。
6.根据权利要求1所述的表面增强拉曼检测法，其特征在于，含真菌毒素的待测液的质量浓度为0.001-100 ng/mL。
7.根据权利要求1所述的表面增强拉曼检测法，其特征在于，进行定量检测时，标准曲线的制备方法如下：取等体积不同浓度的真菌毒素的标准溶液，与3,3',5,5'-四甲基联苯胺、过氧化氢与纳米组装体混合孵育，检测所得混合孵育的反应液在激光激发下的拉曼光谱信号，以所述真菌毒素的标准溶液的浓度的对数值作为横坐标，以3,3',5,5'-四甲基联苯胺氧化后产物在1604 cm-1的拉曼强度为纵坐标，建立标准曲线。
8.根据权利要求7所述的表面增强拉曼检测法，其特征在于，所述真菌毒素的标准溶液的质量浓度为0.001-100 ng/mL。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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