CN114371299A - 一种检测牛乳过敏原酪蛋白的sers免疫层析试纸条及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条及其应用，该试纸条依次包括底板、样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫，NC膜上设有检测线和控制线，检测线上固定有捕获抗体酪蛋白鼠单抗，控制线上固定有羊抗兔二抗，结合垫上喷有由银包金纳米粒子、拉曼信标分子和检测抗体酪蛋白兔多抗偶联结合的SERS探针。本发明中SERS探针含有拉曼信标分子，到达检测线时被捕获抗体捕获发生反应形成双抗体夹心结构，检测线显色，多余的SERS探针随缓冲液层析与控制线上的羊抗兔二抗结合，控制线显色，通过比色法和拉曼法结合可以提高牛乳过敏原酪蛋白的检测灵敏度，有利于准确评估过敏风险。

Description

一种检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条及其应用
技术领域
本发明涉及一种SERS免疫层析试纸条，具体涉及一种检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条及其应用，属于食品安全检测技术领域。
背景技术
牛奶是维生素(维生素A、维生素B6)和矿物质(钙)的摄入来源，是幼儿生长发育所必需的营养物质，对人体骨骼、头发、皮肤和牙齿起着关键作用，是婴儿最先食用的食物之一。然而，牛奶也是儿童早期食物过敏第一个也是最常出现的原因之一。过敏原引起的过敏性疾病有两个显著特点：一是始于婴幼儿期，且对食物的过敏终生不变；二是致敏剂量存在极大的人群差异。因此，有些牛乳过敏患者会因潜在的极少量牛奶而出现过敏反应。食物中的过敏原大都是蛋白质类物质，每100毫升牛乳约含有3克蛋白质，至少包含25种不同的蛋白质，所有这些蛋白质都有可能为过敏原，目前认为酪蛋白是牛乳主要过敏原之一。
用于检测牛乳过敏原的方法主要包括免疫分析技术、液相色谱技术生物质谱技术、实时PCR、电喷雾电离质谱等，这些方法虽然灵敏度高，但需要较长的检测时间或者昂贵的仪器设备。
表面增强拉曼散射(SERS)是以金属纳米结构介导的信号增强效应，相比普通拉曼光谱具有更高的分辨率和灵敏度，可实现高达10～14倍的单分子拉曼信号增强，且SERS的特征拉曼光谱谱带窄，能够在复杂体系的多种干扰下为分析物提供丰富的结构信息。侧向层析免疫技术是一种抗原抗体在层析过程中发生高特异性、高亲和性的免疫反应，通过胶体金等可目测的标记物实现样品检测的技术。胶体金免疫层析技术已经被广泛应用到致病菌、蛋白质、农兽药残留等物质的检测。但是，胶体金试纸条主要通过肉眼观察结果，检测灵敏度不高，以定性和半定量检测为主。
因此，可考虑将SERS与免疫层析技术结合起来，既具有免疫层析技术检测的即时、快速、简便、高特异性的优点，又克服胶体金需要大量聚集才能显色的缺点，提高检测灵敏度，同时建立检测物浓度与拉曼特征峰强度对应的线性关系，实现目标物酪蛋白的快速高效和精确定量检测。
发明内容
本发明针对传统胶体金试纸条检测灵敏度低、不能精确定量的问题，公开了一种基于SERS的免疫层析试纸条以及检测食品中牛乳酪蛋白的用途，利用SERS免疫层析技术实现对酪蛋白的高灵敏度检测。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条，所述SERS试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水垫，所述NC膜上设有检测线(T线)和控制线(C线)，T线设置于靠近结合垫的一端，C线设置于靠近吸附垫的一端；
所述T线固定有捕获鼠单克隆抗体3B5，所述C线固定有羊抗兔二抗；
进一步，在所述T线和C线上划膜后，干燥；
所述结合垫喷有SERS探针；
进一步，所述SERS探针由拉曼信标分子和纳米粒子以共价方式偶联，再偶联到抗体上，封闭后离心，加入海藻糖所得；
将所述SERS探针用缓冲液重悬后包被于结合垫上；
处理过的结合垫需要尽可能快速并且彻底地干燥。
本发明还提供一种用于酪蛋白检测的SERS免疫层析试纸条的制备方法，包括下述步骤：
(1)将所述样品垫用样品处理液处理后，烘干；
(2)将拉曼信标分子和纳米粒子以共价方式偶联，再偶联到抗体上，得到SERS探针，将SERS探针用缓冲液重悬后包被于结合垫上；
(3)使用磷酸盐、硼酸盐、Tris、碳酸盐缓冲液中的一种将捕获单抗3B5、羊抗兔二抗分别包被到T线和C线上；
(4)将样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次层叠贴在所述底板上，切片组装后，即制得SERS免疫层析试纸条。
本发明还提供一种酪蛋白的检测方法，步骤包括：将样品滴加到试纸条样品垫，随着层析与结合垫上的SERS探针结合，依次流经T线和C线，通过定量仪扫描测试线和激光共聚焦拉曼仪器对T线上的点进行光谱扫描即可对酪蛋白进行检测。
在检测时，将待测酪蛋白样品用样品缓冲液稀释滴加到样品垫上，与结合垫上的SERS探针上的抗体结合，到达T线时被捕获抗体捕获发生反应形成双抗体夹心结构，多余的SERS探针会随缓冲液层析与C线上的羊抗兔二抗结合；在25℃的条件下，5～10min内可肉眼观察到T线和C线的颜色变化，反应有以下两种情况：
a、当T线显色，C线显色，表明检测结果为阳性，说明检测样品中含有酪蛋白；
b、当T线不显色，C线显色，表明检测结果为阴性，说明检测样品中未含有酪蛋白；
用共聚焦显微拉曼仪扫描T线上785nm处的SERS信号，通过拉曼信标分子4-MBA特征峰处的拉曼信号强度即可对酪蛋白进行定量分析。
有益效果：本发明以SERS技术进行定量分析，SERS信号强，指纹信息丰富且稳定，经1～3次累积后，平滑降噪，可以检测出较高的灵敏度，制备的SERS免疫层析试纸条，操作简便、高效，价格低廉。
附图说明
图1是本发明中一种检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条的技术原理图。
图2是一实施例中滴加不同浓度的酪蛋白标品时SERS免疫层析试纸条的实物图(A)、T线处的拉曼扫描图谱(B)以及在1611cm-1处拉曼强度标准曲线图(C)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和有点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者生产厂家建议的条件进行。
酪蛋白是牛乳蛋白的重要组成部分，约占80％，酪蛋白主要以5种形式存在：αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-酪蛋白和γ-蛋白(由β-酪蛋白水解产生)。酪蛋白中80％以αs1-酪蛋白的形式存在，目前普遍认为酪蛋白过敏者一般会对αs1-酪蛋白产生过敏反应。αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白和β-酪蛋白的结构都三级结构且十分松散，胃肠道中的蛋白酶能够将这些酪蛋白分解为小分子活性肽，起到调节体内消化、吸收的作用，但对于牛乳过敏者来说，酪蛋白是主要的过敏原。
用于检测牛乳过敏原的方法主要包括免疫分析技术、液相色谱技术生物质谱技术、实时PCR、电喷雾电离质谱等，这些方法虽然灵敏度高，但需要较长的检测时间或者昂贵的仪器设备。
将SERS与免疫层析技术结合起来，既具有免疫层析技术检测的即时、快速、简便、高特异性的优点，可以在5～10min内显色；又能结合便携拉曼仪器，建立检测物浓度与拉曼特征峰强度对应的线性关系，提高检测灵敏度，可实现目标物酪蛋白的快速高效和精确定量检测。
本发明的设计原理是将待测酪蛋白样品滴加到样品垫上，会与结合垫上的SERS探针上的抗体结合，SERS探针中含有拉曼信标分子，到达T线时被捕获抗体捕获发生反应形成双抗体夹心结构，T线显色，多余的SERS探针会随缓冲液层析与C线上的羊抗兔二抗结合，C线显色，结果通过比色法和拉曼法来获得。比色法检测是利用定量仪扫描测试线和C线的显色程度，拉曼法检测是利用激光共聚焦拉曼仪器对T线进行拉曼光谱扫描，通过分析拉曼信标分子4-MBA特征峰处的峰高，建立检测物浓度与拉曼特征峰强度对应的线性关系，即可分析实际样品。
如下将对该技术方案、其实施过程及原理作进一步的解释说明。
本发明实施例的一个方面提供的一种基于SERS的酪蛋白银包金纳米粒子标记的免疫层析试纸条的制备方法，其包括：
(1)制备可增强拉曼信号的银包金纳米粒子；
(2)检测抗体酪蛋白兔多抗与纳米粒子、拉曼信标分子等结合后形成SERS探针，喷于结合垫上；
(3)捕获抗体酪蛋白鼠单抗划膜于硝酸纤维素膜上的T线处；羊抗兔二抗划膜于硝酸纤维素膜上的C线处；
(4)样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次叠加，获得可检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条。
在一些实施例中，所述制备方法包括：采用还原法制备银包金纳米粒子。
进一步，所述加入10mM硝酸银溶液的添加量为1mL～5mL；
进一步，所述10mM硝酸银溶液的滴加速度为0.1～0.3mL/min。
在一些实施例中，所述制备方法包括：将银包金纳米粒子与1mM的4-MBA混匀后，于玻璃瓶内磁力搅拌8～12h，于6000～8000g下离心10～20min后去上清，重悬于水中，形成拉曼探针，加入酪蛋白的兔多抗，室温振荡反应2～4h，加入BSA，室温振荡8～12h，即得到SERS探针。
进一步，所述拉曼探针中银包金纳米粒子与4-MBA的体积比为1000～2000:1；
进一步，所述SERS探针中所述兔多抗的添加量为20～60μg/mL拉曼探针溶液；
进一步，所述SERS探针中BSA的添加量为50～150μg/mL拉曼探针溶液；
进一步，所述制备方法还包括：在拉曼探针与兔多抗结合之后，将所述体系于6000～8000g下离心后去上清，用PBS缓冲液重悬进一步，所述PBS缓冲液中BSA含量为1～3％。
在一些优选的实施方案中，所述SERS探针的制备方法具体包括：将纳米粒子与拉曼信标分子混合后，离心重悬，并调节pH值为7.0～9.0，将拉曼探针与兔多抗结合后，调节pH值至8.0～9.0，将所述SERS探针于离心10～20min后弃上清，之后用含BSA的PBS缓冲液重悬。
在一些实施例中，所述制备方法包括：将海藻糖加入所述的重悬后的SERS探针，喷于经处理液处理后的结合垫上。
进一步，所述海藻糖的添加量为20～40％；
进一步，所述喷金量为2～8μL/cm；
进一步，结合垫处理液为含0.5～2％BSA和0.5～2％PVP的PBS缓冲液；
进一步，在所述处理液处理结合垫之后，甩干，并于37℃干燥0.5～2h。
在一些实施例中，所述制备方法包括：将捕获抗体酪蛋白鼠单抗划膜于硝酸纤维素膜的T线处，羊抗兔二抗划膜于硝酸纤维素膜上的C线处。
进一步，所述鼠单抗的浓度为1～4mg/mL；
进一步，所述羊抗兔二抗的浓度为1～4mg/mL。
进一步，在一些更为优选的实施方案中，所述划膜后的处理方法具体包括：将划膜后的硝酸纤维素膜于37℃干燥2～5h。
在一些实施例中，所述制备方法包括：在底板上将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次连接，完成酪蛋白的SERS免疫层析试纸条的组装。
进一步，样品垫叠加于结合垫上1～2mm处；
进一步，结合垫叠加于硝酸纤维素膜上1～2mm处；
进一步，吸水垫垫叠加于硝酸纤维素膜上1～2mm处，切片组装、得到酪蛋白SERS免疫层析试纸条。其中，本发明中制得的目标酪蛋白SERS免疫层析试纸条宽度为3～4mm，于5-10min内完成酪蛋白标品和样品的比色法和拉曼法的检测。
作为本发明优选的实施例之一，制备具体包括以下步骤：
1)银包金纳米粒子的制备
向250mL三角瓶中加入100mL 0.01％的氯金酸溶液，恒定搅拌加热至沸，反应温度控制在100～110℃；等溶液沸5min后迅速加入1％柠檬酸三钠溶液2mL，继续煮10min，等溶液颜色相对透明后停止反应，冷却至室温，用超纯水补足至100mL；向三角瓶中再次加入100mL超纯水，加热至沸腾，加入3mL 1％柠檬酸钠溶液，用注射泵以0.2mL/min的速度滴加2mL浓度为10mM的AgNO3溶液，继续加热搅拌60min，停止加热，冷却至室温，用超纯水定容至200mL，将制得的溶液以8000rpm的速度离心15min后去上清，再用超纯水复溶，保存于4℃。
2)SERS探针的制备
取1mL银包金纳米粒子与10μL浓度为1mM的拉曼信标分子4-MBA混匀后，调节pH值为7.0～9.0，于玻璃瓶内磁力搅拌12h，于6900g下离心10min后去上清，重悬于水中，形成拉曼探针，加入20μg酪蛋白兔多抗，室温振荡反应2h，调节pH值至8.0～9.0，加入BSA，室温振荡12h，即得到SERS探针，于8000g下离心后去上清，用含1％BSA的PBS缓冲液重悬。
3)喷金
用含0.5％BSA和0.5％PVP的PBS缓冲液作为结合垫处理液浸泡结合垫，甩干，烘干。在重悬后的SERS探针中加入20～40％的海藻糖，将此溶液喷于处理后的结合垫上，喷金量为4μL/cm，并于37℃干燥30min。
4)划膜
将捕获抗体酪蛋白鼠单抗用T线稀释液稀释至浓度2mg/mL，划膜于硝酸纤维素膜的T线处，划膜量为1μL/cm，其中T线稀释液为含3％海藻糖的PBS缓冲液；将羊抗兔二抗用C线稀释液稀释至浓度2mg/mL，划膜于硝酸纤维素膜上的C线处，其中C线稀释液为含3％海藻糖的PBS缓冲液，将划膜后的硝酸纤维素膜于37℃干燥2h。
5)组装
在PVC底板上将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次叠加，样品垫叠加于结合垫上1～2mm处，结合垫叠加于硝酸纤维素膜上1～2mm处，吸水垫叠加于硝酸纤维素膜上1～2mm处，用切片机将其切成宽度为3mm的试纸条，用卡壳组装后完成酪蛋白的SERS免疫层析试纸条的制备。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的银包金纳米粒子。
进一步，所述银包金纳米粒子粒径在20～40nm之间，对拉曼信号的增强效果不同。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的酪蛋白SERS试纸条于标准品、实际样品等的检测。
综上所述，本发明评估了不同硝酸银溶液添加量制备的银包金纳米粒子的拉曼增强效果，通过透射电镜和紫外光谱扫描对纳米粒子进行表征。本发明评估了酪蛋白SERS试纸条在肉眼、比色法、拉曼法三种检测方法下的检测限，以及与β-乳球蛋白、酪蛋白、BSA、卵清蛋白和大豆蛋白的交叉反应情况。同时，所制备的酪蛋白SERS试纸条在纯牛奶、椰汁、果冻爽、脱敏奶粉等实际样品中具有良好的实用性。
以下通过若干实施例及附图并进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。
实施例1
(1)银包金纳米粒子的制备
向250mL三角瓶中加入100mL 0.01％的HAuCl4溶液，恒定搅拌加热至沸，反应温度控制在100～110℃；等溶液沸5min后迅速加入1％柠檬酸三钠溶液2mL，继续煮10min，等溶液颜色相对透明后停止反应，冷却至室温，用超纯水补足至100mL；向三角瓶中再次加入100mL超纯水，加热至沸腾，加入3mL 1％柠檬酸钠溶液，用注射泵以0.1mL/min的速度滴加2mL浓度为10mM的AgNO3溶液，继续加热搅拌60min，停止加热，冷却至室温，用超纯水定容至200mL，将制得的溶液以8000rpm的速度离心15min后去上清，再用超纯水复溶，保存于4℃。
(2)SERS探针的制备
取1mL银包金纳米粒子与15μL浓度为1mM的拉曼信标分子4-MBA混匀后，调节pH值为9.0，于玻璃瓶内磁力搅拌10h，于8000g下离心15min后去上清，重悬于水中，形成拉曼探针，加入40μg酪蛋白兔多抗，调节pH值至8.5，室温振荡反应4h，加入BSA，室温振荡8h即得到SERS探针，于7000g下离心后去上清，用含2.5％BSA的PBS缓冲液重悬。
(3)喷金
用2％BSA和2％PVP的PBS缓冲液作为结合垫处理液浸泡结合垫，甩干，烘干。在重悬后的SERS探针中加入30％的海藻糖，将此溶液喷于处理后的结合垫上，喷金量为4μL/cm，并于37℃干燥2h。
(4)划膜
将捕获抗体酪蛋白鼠单抗用T线稀释液稀释至浓度4mg/mL，划膜于硝酸纤维素膜的T线处，划膜量为2μL/cm，其中T线稀释液为含2％海藻糖的PBS缓冲液；将羊抗兔二抗用C线稀释液稀释至浓度2mg/mL，划膜于硝酸纤维素膜上的C线处，其中C线稀释液为含2％海藻糖的PBS缓冲液，将划膜后的硝酸纤维素膜于37℃干燥4h。
(5)组装
在PVC底板上将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次叠加，样品垫叠加于结合垫上1～2mm处，结合垫叠加于硝酸纤维素膜上1～2mm处，吸水垫叠加于硝酸纤维素膜上1～2mm处，用切片机将其切成宽度为3mm的试纸条，用卡壳组装后完成酪蛋白的SERS免疫层析试纸条的制备。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于SERS探针的制备方法，按以下步骤进行：
取1mL银包金纳米粒子与20μL浓度为1mM的拉曼信标分子4-MBA混匀后，调节pH值为8.0，于玻璃瓶内磁力搅拌12h，于7500g下离心20min后去上清，重悬于水中，形成拉曼探针，加入45μg酪蛋白兔多抗，调节pH值至9.0，室温振荡反应3h，加入BSA封闭，室温振荡10h，即得到SERS探针，于8000g下离心后去上清，用含2％BSA的PBS缓冲液重悬。
结合垫处理液为2％BSA和1％PVP的PBS缓冲液，重悬后的SERS探针中加入海藻糖的量为35％，喷金后干燥时间为2h，T线上包被捕获抗体酪蛋白鼠单抗的浓度为3mg/mL，划膜后的硝酸纤维素膜于37℃干燥4h。
实施例3
实施例3所述的用于制备SERS探针的方法，按以下步骤进行：
取1mL银包金纳米粒子与10μL浓度为1mM的拉曼信标分子4-MBA混匀后，调节pH值为7.5，于玻璃瓶内磁力搅拌9h，于7500g下离心10min后去上清，重悬于水中，形成拉曼探针，加入40μg酪蛋白兔多抗，室温振荡反应4h，加入BSA封闭液，室温振荡12h，即得到SERS探针，于8000g下离心后去上清，用含2％BSA的PBS缓冲液重悬。
结合垫处理液为2％BSA和2％PVP的PBS缓冲液，重悬后的SERS探针中加入海藻糖的量为35％，喷金量为6μL/cm，C线上包被检测抗体羊抗兔二抗的浓度为4mg/mL，划膜后的硝酸纤维素膜于37℃干燥3h。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (11)

1.一种检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条，其特征在于，依次包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水垫，所述NC膜上设有检测线(T线)和控制线(C线)，其中：
所述T线设置于靠近结合垫一端，其上固定有捕获抗体酪蛋白鼠单抗；
所述C线设置于靠近吸附垫一端，其上固定有羊抗兔二抗；
所述结合垫上喷有SERS探针，所述SERS探针由银包金纳米粒子、拉曼信标分子和检测抗体酪蛋白兔多抗偶联结合得到。
2.根据权利要求1所述检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条，其特征在于，所述银包金纳米粒子的粒径为20～40nm，形状为球形，选自不同银壳层厚度的银包金纳米粒子中的一种，和/或所述拉曼信标分子为拉曼信标分子4-巯基苯甲酸(4-MBA)，和/或所述检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条的宽度为3～4mm。
3.根据权利要求1所述检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条，其特征在于，所述拉曼信标分子与银包金纳米粒子先以共价方式偶联，再偶联到所述检测抗体酪蛋白兔多抗上，封闭后离心，加入海藻糖得到SERS探针。
4.权利要求1至3任一项所述检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备银包金纳米粒子；
(2)检测抗体酪蛋白兔多抗与银包金纳米粒子、拉曼信标分子结合形成SERS探针，喷于结合垫上；
(3)捕获抗体酪蛋白鼠单抗划膜于NC膜上的T线处，羊抗兔二抗划膜于NC膜上的C线处；
(4)样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次层叠贴在所述底板上，切片组装，即得。
5.根据权利要求4所述检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述银包金纳米粒子通过10mM硝酸银溶液还原制备得到，其中所述10mM硝酸银溶液的添加量为1～5mL，和/或所述10mM硝酸银溶液的滴加速度为0.1～0.3mL/min。
6.根据权利要求4所述检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述SERS探针的制备方法包括：将银包金纳米粒子与1mM的拉曼信标分子4-MBA混匀后，调节pH值为7.0～9.0，于玻璃瓶内磁力搅拌8～12h，于6000～8000g下离心10～20min后去上清，重悬于水中，形成拉曼探针，然后加入检测抗体酪蛋白兔多抗，室温振荡反应2～4h，调节pH值为8.0～9.0，加入牛血清白蛋白(BSA)，室温振荡8～12h，得到SERS探针；其中：
所述拉曼探针中银包金纳米粒子与4-MBA的体积比为2000～1000:1；
和/或所述SERS探针中所述检测抗体酪蛋白兔多抗的添加量为20～60μg/mL拉曼探针溶液；
和/或所述SERS探针中BSA的添加量为50～150μg/mL拉曼探针溶液；
和/或还包括所述拉曼探针与所述检测抗体酪蛋白兔多抗结合形成SERS探针后，于6000～8000g下离心10～20min后去上清，用PBS缓冲液重悬，所述PBS缓冲液中BSA的含量为1～3％。
7.根据权利要求6所述检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，海藻糖加入PBS缓冲液重悬后的SERS探针，喷于经处理液处理后的结合垫上，其中所述海藻糖的添加量为20～40％；
和/或所述喷金量为2～8μL/cm；
和/或所述处理液为含0.5～2％BSA和0.5～2％PVP的PBS缓冲液；
和/或还包括所述处理液处理结合垫后甩干，于37℃干燥0.5～2h。
8.根据权利要求4所述检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述捕获抗体酪蛋白鼠单抗的浓度为1～4mg/mL，和/或所述羊抗兔二抗的浓度为1～4mg/mL，和/或划膜后的NC膜于37℃干燥2～5h。
9.根据权利要求4所述检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述样品垫层叠于结合垫1～2mm处，和/或所述结合垫层叠于NC膜1～2mm处，和/或所述吸水垫层叠于NC膜1～2mm处。
10.权利要求1至3任一项所述检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条在牛乳过敏原酪蛋白于5～10min内定性检测和高灵敏度定量检测中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，牛乳过敏原酪蛋白的检测方法包括：将待测酪蛋白样品用样品缓冲液稀释滴加到所述检测牛乳过敏原酪蛋白的SERS免疫层析试纸条的样品垫上，随着层析与结合垫上的SERS探针结合，依次流经T线和C线，通过定量仪扫描测试线和激光共聚焦拉曼仪对T线上的点进行光谱扫描进行酪蛋白检测；其中：
(1)定性检测：5～10min内肉眼观察T线和C线的颜色变化：当T线显色且C线显色，检测结果为阳性，说明待测酪蛋白样品中含有酪蛋白；当T线不显色且C线显色，检测结果为阴性，说明待测酪蛋白样品中不含有酪蛋白；
(2)高灵敏度定量检测：用共聚焦显微拉曼仪扫描T线上785nm处的SERS信号，通过拉曼信标分子4-MBA特征峰处的拉曼信号强度对酪蛋白进行定量分析。
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