CN114324863A - 一种基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针及其免疫传感器和检测方法 - Google Patents

一种基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针及其免疫传感器和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针及其免疫传感器和检测方法，属于生物免疫传感技术领域。本发明提供的生物探针包括金黄色葡萄球菌毒素特异性抗体和与所述特异性抗体结合的AuPt/Fe‑N‑C复合材料。在本发明中，AuPt纳米粒子可以作为锚定生物识别物质特异性抗体的位点，与金黄色葡萄球菌毒素特异性抗体结合后，能够基于光/电双信号模式对金黄色葡萄球菌毒素检测。在本发明中，一方面，AuPt/Fe‑N‑C能够催化亚甲基蓝降解，能够用于构建基于标记触发亚甲蓝降解的电化学免疫传感器；另一方面，AuPt/Fe‑N‑C对TMB具有显色反应，能够用于TMB显色的酶联免疫吸附剂测定。

Description

一种基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物 探针及其免疫传感器和检测方法
技术领域
本发明涉及生物传感技术领域，特别涉及一种基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针及其免疫传感器和检测方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌是一种世界上最常见的细菌性疾病病原体之一，金黄色葡萄球菌可分泌胞外蛋白、超抗原，产生各种毒素介导的疾病，如脓疱病、食物中毒、烫伤皮肤综合征和中毒性休克综合征。统计数据显示，金黄色葡萄球菌毒素(S.aureus毒素)感染导致的死亡人数甚至比艾滋病、肺结核和病毒性肝炎的总和还要多。金黄色葡萄球菌毒素污染是威胁人类健康和安全的细菌性食物中毒的常见原因。
研究表明，血流感染和脓毒症早期抗菌治疗效果更好，而对于类似感染性休克的疾病，抗生素治疗每延迟6小时，存活率至少降低7％。因此，面对病原微生物的检测，有必要构建高灵敏度、特异的金黄色葡萄球菌毒素检测方法，避免误检造成的延误，保障食品安全和人体健康。
目前常用的金黄色葡萄球菌毒素检测方法包括传统培养、仪器检测和分子生物学检测。金黄色葡萄球菌毒素的传统检测依赖细菌培养，结果可靠稳定，但通常需要2～3天才能出结果。使用仪器(如HPLC和MS)检测金黄色葡萄球菌毒素快速灵敏，但这些设备通常价格昂贵且需要专业操作。分子生物学检测可以快速获得结果，但容易出现假阳性结果，检测稳定性差。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针及其免疫传感器和检测方法。本发明提供的检测方法检测速度快、稳定性高、成本低廉。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针，包括金黄色葡萄球菌毒素特异性抗体和与所述金黄色葡萄球菌毒素特异性抗体结合的AuPt纳米粒子/多面体结构Fe-N-C复合材料；
所述AuPt纳米粒子/多面体结构Fe-N-C复合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将可溶性锌源、氯化血红素、2-甲基咪唑和醇溶剂混合，进行晶化反应，得到血红素/ZIF-8复合物；
(2)对所述血红素/ZIF-8复合物进行热处理，得到具有多面体结构的Fe-N-C；
(3)将所述具有多面体结构的Fe-N-C、HAuCl4、H2PtCl6、还原剂与水混合，进行还原反应，得到AuPt纳米粒子/多面体结构Fe-N-C复合材料。
本发明提供了一种金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器，包括上述基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针。
本发明提供了上述金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将负载有固定剂的电极置于亚甲基蓝溶液中进行浸泡，得到表面固定有亚甲基蓝的电极；所述固定剂为金属框架材料/硼烯复合物，所述金属框架材料负载有金纳米粒子；
(2)将金黄色葡萄球菌毒素抗体溶液、非特异性蛋白、金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液、金黄色葡萄球菌毒素检测用生物探针、表面固定有亚甲基蓝的电极进行孵育，得到金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器。
优选的，所述金属框架材料/硼烯复合物的制备方法，包括以下步骤：
(i)将柠檬酸三钠、聚乙二醇、HAuCl4、NH2-MOF、还原剂与水混合，进行还原反应，得到Au/NH2-MOF分散液；
(ii)将所述负载金纳米粒子的NH2-MOF分散液与巯基-β-环糊精混合，得到巯基修饰的Au/NH2-MOF分散液；
(iii)将羧基活化的硼烯与巯基修饰的Au/NH2-MOF分散液搅拌混合，得到金属框架材料/硼烯复合物。
优选的，所述步骤(2)中的孵育包括：
将金黄色葡萄球菌毒素抗体溶液在孵育器中进行第一孵育，洗去未结合物质后得到第一孵育产物；
向所述第一孵育产物中加入非特异性蛋白，进行第二孵育，洗去未结合物质后得到第二孵育产物；
向所述第二孵育产物中加入金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液，进行第三孵育，洗去未结合物质后得到第三孵育产物；
向所述第三孵育产物中加入金黄色葡萄球菌毒素检测用生物探针，进行第四孵育，洗去未结合物质后得到第四孵育产物；
向所述第四孵育产物中加入表面固定有亚甲基蓝的电极，进行第五孵育，得到金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器。
本发明提供了一种基于电信号模式检测金黄色葡萄球菌毒素的方法，包括以下步骤：
以待测样品替换金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液，按照权利要求3～5任意一项所述制备方法制备金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器；
以金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器作为工作电极，以磷酸盐缓冲液作为电解液，以三电极体系采用方波伏安法进行检测，获得待测样品的电流峰值；
根据预定的第一标准曲线和待测样品的电流峰值得到待测样品中金黄色葡萄球菌毒素浓度；所述第一标准曲线为金黄色葡萄球菌毒素浓度对数与电流峰值的线性关系曲线。
优选的，所述方波伏安法进行检测的参数包括：扫描电压为-0.1～0.5V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s。
本发明提供了一种金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器，包括上述基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针。
本发明提供了上述金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
将金黄色葡萄球菌毒素抗体溶液、非特异性蛋白、金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液、金黄色葡萄球菌毒素检测用生物探针进行孵育，得到金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器。
本发明提供了上述基于光信号模式检测金黄色葡萄球菌毒素的方法，包括以下步骤：
以待测样品作为金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液，按照权利要求9所述制备方法制备金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器；
将TMB溶液、H2O2溶液与金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器混合，获得待测样品在652nm处的吸光度值；
根据预定的第二标准曲线和待测样品的吸光度值得到待测样品中金黄色葡萄球菌毒素浓度；所述第二标准曲线为金黄色葡萄球菌毒素浓度对数与吸光度值的线性关系曲线。
本发明提供了一种基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针，包括金黄色葡萄球菌毒素特异性抗体和与所述金黄色葡萄球菌毒素特异性抗体结合的AuPt纳米粒子/多面体结构Fe-N-C复合材料(简称AuPt/Fe-N-C)。在本发明中，AuPt纳米粒子可以作为锚定生物识别物质特异性抗体的位点，与金黄色葡萄球菌毒素特异性抗体结合。在本发明中，一方面，AuPt/Fe-N-C能够催化亚甲基蓝(MB)降解，能够用于构建基于标记触发亚甲蓝降解的电化学免疫传感器；另一方面，AuPt/Fe-N-C对TMB具有显色反应，能够用于TMB显色的酶联免疫吸附剂测定(ELISA)，从而构建ELISA生物免疫传感器。因此，本发明提供的生物探针能够基于光/电双信号模式对金黄色葡萄球菌毒素检测。本发明采用免疫传感器法进行金黄色葡萄球菌毒素的检测，具有廉价、快速、灵敏、稳定的优势，其中电化学免疫传感器的检测范围为0.0002～10ng·mL-1，检出限(LOD)为0.067fg/mL(S/N＝3)；ELISA生物免疫传感器的检测范围为0.0002～10ng·mL-1，检出限(LOD)为0.067fg/mL(S/N＝3)。
附图说明
图1为实施例1中NH2-MOF、NH2-MOF/Bene、Au/SH-CD/NH2-MOF/Bene、N-C、Fe-N-C和AuPt/Fe-N-C的透射电镜图；
图2为实施例1中N-C和Fe-N-C的拉曼光谱图；
图3为实施例1中N-C、Fe-N-C和AuPt/Fe-N-C的EDS图；
图4为不同浓度的S.aureus毒素的电化学免疫传感器的电测试结果；
图5为不同浓度的S.aureus毒素的ELISA生物免疫传感器的光测试结果。
具体实施方式
本发明提供了一种基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针，包括金黄色葡萄球菌毒素特异性抗体和与所述金黄色葡萄球菌毒素特异性抗体结合的AuPt纳米粒子/多面体结构Fe-N-C复合材料。
在本发明中，所述金黄色葡萄球菌毒素特异性抗体为本领域技术人员熟知的金黄色葡萄球菌毒素特异性抗体，具体为金黄色葡萄球菌肠毒素B特异性抗体。
在本发明中，所述AuPt纳米粒子/多面体结构Fe-N-C复合材料的制备方法，优选包括以下步骤：
(1)将可溶性锌源、氯化血红素、2-甲基咪唑、醇溶剂混合，进行晶化反应，得到血红素/ZIF-8复合物；
(2)对所述血红素/ZIF-8复合物进行热处理，得到具有多面体结构的Fe-N-C；
(3)将所述具有多面体结构的Fe-N-C、HAuCl4、H2PtCl6、还原剂与水混合，进行还原反应，得到AuPt/Fe-N-C纳米复合材料。
本发明将可溶性锌源、氯化血红素、2-甲基咪唑、醇溶剂混合，进行晶化反应，得到血红素/ZIF-8复合物。在本发明中，所述可溶性锌源优选为硝酸锌。在本发明中，所述醇溶剂优选为甲醇。
在本发明中，所述可溶性锌源、氯化血红素、2-甲基咪唑的质量比优选为(11～19)：(0.6～1)：(24～43)，更优选为(13～16)：(0.7～0.9)：(30～40)。
在本发明中，所述晶化反应优选在搅拌的条件下进行。所述晶化反应的温度优选为室温，时间优选为3～36h，更优选为10～20h。
所述晶化反应后，本发明优选对所得晶化反应液进行离心，对离心后所得固体进行洗涤和干燥，得到血红素/ZIF-8复合物纯品。本发明对所述离心的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的离心方式即可。在本发明中，所述洗涤用洗涤剂优选为甲醇。在本发明中，所述干燥的方式优选为真空干燥，所述干燥的温度优选为70℃，时间优选为8～12h。
得到所述血红素/ZIF-8复合物后，本发明对所述血红素/ZIF-8复合物进行热处理，得到具有多面体结构的Fe-N-C。在本发明中，所述热处理的温度优选为400～900℃，更优选为600～800℃；保温时间优选为0.5～3h，更优选为1～2h；升温至所述热处理温度的升温速率优选为5℃/min。本发明优选在N2氛围下进行热处理。
本发明通过所述热处理，能够材料改变内部结构，从而得到多面体结构Fe-N-C。
得到所述多面体结构Fe-N-C后，本发明将所述具有多面体结构的Fe-N-C、HAuCl4、H2PtCl6、还原剂与水混合，进行还原反应，得到AuPt/Fe-N-C纳米复合材料。在本发明中，所述还原剂优选为柠檬酸钠。在本发明中，所述具有多面体结构的Fe-N-C、HAuCl4、H2PtCl6、还原剂的质量比优选为1：(20～200)：(10～100)：(50～258)，更优选为1：(50～150)：(30～80)：(100～200)。在本发明中，所述混合后所得混合与中具有多面体结构的Fe-N-C的质量浓度优选为1mg/mL。
在本发明中，所述混合优选为：先将具有多面体结构的Fe-N-C、HAuCl4、H2PtCl6与水混合，进行搅拌，再加入还原剂。在本发明中，所述搅拌优选在室温的条件下进行，所述搅拌的时间优选为0.5～3h，更优选为1～2h。
在本发明中，所述还原反应的温度优选为室温，时间优选为10～60min，更优选为20～40min。在还原反应的过程中，Au离子、Pt离子被还原剂还原为AuPt纳米颗粒负载在多面体结构Fe-N-C复合材料表面。
所述还原反应后，本发明优选对所得还原反应液依次进行离心、洗涤和干燥，得到AuPt/Fe-N-C纳米复合材料固体。
本发明提供了一种金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器，包括权利要求1所述的基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针。
本发明提供了上述金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将负载有固定剂的电极置于亚甲基蓝溶液中进行浸泡，得到表面固定有亚甲基蓝的电极；所述固定剂为金属框架材料/硼烯复合物，所述金属框架材料负载有金纳米粒子；
(2)将金黄色葡萄球菌毒素抗体溶液、非特异性蛋白、金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液、金黄色葡萄球菌毒素检测用生物探针、表面固定有亚甲基蓝的玻碳电极进行孵育，得到金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器。
本发明将负载有固定剂的电极置于亚甲基蓝溶液中进行浸泡置于亚甲基蓝溶液中进行浸泡，得到表面固定有亚甲基蓝的电极。
在本发明中，所述电极优选为玻碳电极。本发明优选对所述电极进行前处理。在本发明中，所述前处理优选包括：
对电极依次进行抛光、洗涤和干燥。
在本发明中，所述抛光包括：依次使用0.3和0.05μm的三氧化二铝粉进行抛光。在本发明中，本发明对所述抛光的具体操作方式没有特殊的要求，使用本领域熟知的抛光方式即可。
在本发明中，所述洗涤用洗涤剂优选依次为50％乙醇溶液、50％硝酸溶液和去离子水；所述洗涤的方式优选为超声清洗。
在本发明中，所述干燥的方式优选为N2吹干。
在本发明中，所述玻碳电极负载固定剂的方法优选为：将固定剂水分散液滴加到电极表面，干燥后得到负载有固定剂的电极。在本发明中，所述固定剂水分散液的浓度优选为0.2～1.2mg·mL-1，更优选为0.5～1mg·mL-1。
在本发明中，所述固定剂为金属框架材料/硼烯复合物，所述金属框架材料负载有金纳米粒子。在本发明中，所述金属框架材料/硼烯复合物的制备方法，优选包括以下步骤：
(i)将柠檬酸三钠、聚乙二醇、HAuCl4、NH2-MOF、还原剂与水混合，进行还原反应，得到Au/NH2-MOF分散液；
(ii)将所述负载金纳米粒子的NH2-MOF分散液与巯基-β-环糊精混合，得到巯基修饰的Au/NH2-MOF分散液；
(iii)将羧基活化的硼烯与巯基修饰的Au/NH2-MOF分散液搅拌混合，得到金属框架材料/硼烯复合物。
本发明将柠檬酸三钠、聚乙二醇、HAuCl4、NH2-MOF、还原剂与水混合，进行还原反应，得到Au/NH2-MOF分散液。在本发明中，所述还原剂优选为抗坏血酸。在本发明中，所述NH2-MOF为氨基修饰的金属有机框架材料。本发明对所述NH2-MOF的来源没有特殊的要求，使用本领域常规市售的NH2-MOF或自行制备均可。作为本发明的一个具体实施例，所述NH2-MOF的制备方法为通过溶剂热法制备，具体参见文献[1]Lin,Y.C.,Kong,C.L.,Chen,L.,Directsynthesis of amine-functionalized MIL-101(Cr)nanoparticles and applicationfor CO2 capture,RSC Adv.,2012,2,6417-6419。
在本发明中，所述聚乙二醇优选为聚乙二醇400。在本发明中，所述柠檬酸三钠、聚乙二醇、HAuCl4、NH2-MOF、抗坏血酸的质量比优选为(1～10)：(0.1～1)：(0.1～1)：(5～50)：(1～10)。
在本发明中，所述还原反应的温度优选为室温，时间优选为30～180min，更优选为60～120min。在还原反应过程中，金离子被还原为金纳米颗粒负载于NH2-MOF表面和孔隙中。
得到所述Au/NH2-MOF分散液后，本发明将所述负载金纳米粒子的NH2-MOF分散液与巯基-β-环糊精混合，得到巯基修饰的Au/NH2-MOF分散液。在本发明中，所述混合优选为搅拌混合，所述混合的温度优选为室温，时间优选为0.5～3h，更优选为1～2h。
本发明将羧基活化的硼烯与巯基修饰的Au/NH2-MOF分散液搅拌混合，得到金属框架材料/硼烯复合物(Au/SH-CD/MOF/Bene)。在本发明中，所述羧基活化的硼烯的制备方法，优选包括以下步骤：
将硼烯与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺混合，进行活化，得到羧基活化的硼烯。在本发明中，所述硼烯的粒径优选为100～200nm。本发明对所述硼烯的来源没有特殊要求，使用本领域常规市售的硼烯或自行制备均可。
在本发明中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺为EDC/NHS溶液，所述EDC/NHS溶液优选为1～6mmol/L，更优选为2～4mmol/L。
在本发明中，所述活化的温度优选为室温，时间优选为0.5～3h，更优选为1～2h。
在本发明中，所述羧基活化的硼烯与巯基修饰的Au/NH2-MOF分散液搅拌混合的时间优选为1～6h，更优选为2～4h。
所述搅拌混合后，本发明优选对所得混合液依次进行离心、洗涤和冻干，得到金属框架材料/硼烯复合物固体。
在本发明中，所述亚甲基蓝溶液的浓度优选为2～12mmol/L，更优选为5～10mmol/L。在本发明中，所述负载有固定剂的电极在亚甲基蓝溶液中的浸泡时间优选为10～45min，更优选为20～40min。所述浸泡后，本发明取出表面固定有亚甲基蓝的电极，并用水和pH＝7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗电极表面。
得到表面固定有亚甲基蓝的电极后，本发明将金黄色葡萄球菌毒素抗体溶液、非特异性蛋白、金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液、金黄色葡萄球菌毒素检测用生物探针、表面固定有亚甲基蓝的玻碳电极进行孵育，得到金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器。在本发明中，所述非特异蛋白优选为牛血清蛋白。
在本发明中，所述孵育包括：
将金黄色葡萄球菌毒素抗体溶液在酶标板中进行第一孵育，洗去未结合物质后得到第一孵育产物；
向所述第一孵育产物中加入非特异性蛋白，进行第二孵育，洗去未结合物质后得到第二孵育产物；
向所述第二孵育产物中加入金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液，进行第三孵育，洗去未结合物质后得到第三孵育产物；
向所述第三孵育产物中加入金黄色葡萄球菌毒素检测用生物探针，进行第四孵育，洗去未结合物质后得到第四孵育产物；
向所述第四孵育产物中加入表面固定有亚甲基蓝的电极，进行第五孵育，得到金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器。
在本发明中，所述酶标板优选为96孔酶标板。
在本发明中，所述金黄色葡萄球菌毒素抗体溶液(Ab1)的浓度优选为0.2～1.2μg·mL-1，更优先为0.5～1μg·mL-1，加入量优选为40～100μL，更优选为50μL；在本发明中，所述第一孵育的温度优选为4℃，时间优选为8～12h。在本发明中，所述洗去未结合物质的方式优选为磷酸盐缓冲液洗涤，所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为7.2。
在本发明中，所述非特异性蛋白优选为牛血清蛋白。在本发明中，所述非特异蛋白的浓度优选为0.5～3wt％，更优选为1～2wt％。在本发明中，所述非特异蛋白的加入量优选为40～100μL，更优选为50μL。在本发明中，所述第二孵育的温度优选为25℃，时间优选为20～120min，更优选为60～90min。在本发明中，所述洗去未结合物质的方式优选为磷酸盐缓冲液洗涤，所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为7.2。
在本发明中，所述金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液的加入量优选为40～100μL，更优选为50μL。在本发明中，所述第三孵育的温度优选为25℃，时间优选为30～180min，更优选为60～90min。在本发明中，所述洗去未结合物质的方式优选为磷酸盐缓冲液洗涤，所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为7.2。
在本发明中，所述金黄色葡萄球菌毒素检测用生物探针的浓度优选为0.2～1.2mg·mL-1，,更优选为0.5～1mg·mL-1。在本发明中，所述金黄色葡萄球菌毒素检测用生物探针的加入量优选为40～100μL，更优选为50μL。在本发明中，所述第四孵育的温度优选为25℃，时间优选为30～180min，更优选为60～90min。在本发明中，所述洗去未结合物质的方式优选为磷酸盐缓冲液洗涤，所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为7.2。
在本发明中，所述第五孵育的温度优选为25℃，时间优选为10～60min，更优选为20～40min。
本发明提供了一种基于电信号模式对金黄色葡萄球菌毒素的检测方法，包括以下步骤：
以待测样品作为金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液，按照上述制备方法制备金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器；
以金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器作为工作电极，以磷酸盐缓冲液作为电解液，组成三电极体系，采用方波伏安法进行检测，获得待测样品的电流峰值；
根据预定的第一标准曲线和待测样品的电流峰值得到待测样品中金黄色葡萄球菌毒素浓度；所述第一标准曲线为金黄色葡萄球菌毒素浓度对数与电流峰值的线性关系曲线。
在本发明中，所述待测样品优选为液态。本发明对所述待测样品的种类没有特殊的要求，任何需要检测金黄色葡萄球菌毒素的食品、饮料、物品均能使用本发明提供的方法进行检测。
在本发明中，所述三电极体系的对电极优选为铂电极，参比电极优选为饱和甘汞电极。在本发明中，所述磷酸盐缓冲液pH值优选为7.2，浓度优选为0.1mol/L。
本发明优选使用电化学工作站进行检测。在本发明中，所述方波伏安法进行检测时，扫描电压优选为-0.1～0.5V，脉冲振幅优选为0.05V，脉冲宽度优选为0.05s。
在本发明中，所述第一标准曲线为为金黄色葡萄球菌毒素浓度对数与电流峰值的线性关系曲线。
作为本发明的一个具体实施例，所述第一标准曲线的绘制方法包括：
提供梯度浓度的金黄色葡萄球菌毒素的标准品溶液，所述梯度浓度包括0.0002、0.001、0.002、0.01、0.01、0.1、0.2、1、2、10ng/mL；
以梯度浓度的标准品溶液分别制备金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器，获得梯度浓度标准品溶液对应的电流峰值，以标准品溶液浓度的对数为横坐标，以电流峰值为纵坐标绘图，得到金黄色葡萄球菌毒素浓度对数与电流峰值的线性关系曲线，具体数据见表1。
表1标准溶液浓度、电流峰值以及标准曲线
Figure BDA0003455774590000091
本发明提供了一种金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器，包括上述基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针。
本发明提供了上述金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
将金黄色葡萄球菌毒素抗体溶液、非特异性蛋白、金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液、金黄色葡萄球菌毒素检测用生物探针进行孵育，得到金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器。
在本发明中，所述孵育的过程与制备金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器的孵育过程相同，在此不再赘述。
本发明提供了一种基于光信号模式对金黄色葡萄球菌毒素进行检测方法，包括以下步骤：
以待测样品作为金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液，按照上述制备方法制备金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器；
将TMB溶液、H2O2溶液与金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器混合，获得待测样品在652nm处的吸光度值；
根据预定的第二标准曲线和待测样品的吸光度值得到待测样品中金黄色葡萄球菌毒素浓度；所述第二标准曲线为金黄色葡萄球菌毒素浓度对数与吸光度值的线性关系曲线。
在本发明中，所述TMB溶液的浓度优选为5～30mmol/L，更优选为10～20mmol/L；所述TMB溶液的加入量优选为50μL。在本发明中，所述H2O2溶液的浓度优选为20～120mmol/L，更优选为50～100mmol/L；所述H2O2溶液的加入量优选为50μL。
本发明优选使用酶标仪测试吸光度值。
作为本发明的一个具体实施例，所述
在本发明中，所述第二标准曲线的绘制方法包括：
提供梯度浓度的金黄色葡萄球菌毒素的标准品溶液，所述梯度浓度包括0.0002、0.001、0.002、0.01、0.1、2、5、10ng/mL；
以梯度浓度的标准品溶液分别制备金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器，获得梯度浓度标准品溶液对应的652nm处吸光度值，以标准品溶液浓度的对数为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘图，得到金黄色葡萄球菌毒素浓度对数与吸光度值的线性关系曲线，具体数据见表2。
表2标准溶液浓度、吸光度值以及标准曲线
Figure BDA0003455774590000101
下面结合实施例对本发明提供的基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针及其免疫传感器和检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(一)制备Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料
(1)Hemin/ZIF-8的制备：将1.07g Zn(NO3)2·6H2O溶解在40mL甲醇中以形成均匀的溶液，并将溶液快速注入40mL含有55mg氯化血红素和2.35g 2-甲基咪唑(MeIM)的甲醇中，在室温下剧烈搅拌9h后，离心收集灰色产物并用甲醇冲洗三次，然后在70℃下真空干燥过夜获得Hemin/ZIF-8。
(2)Fe-N-C的制备：将合成的Hemin/ZIF-8粉末转移到热电偶位置，在N2气氛下以5℃/min的升温速率从室温加热至600℃，并保持1.5h。然后将所得材料自然冷却，得到Fe-N-C。
(3)AuPt/Fe-N-C的制备：称取6mg Fe-N-C分散于6mL的去离子水中，依次加入120μL浓度为50mM的HAuCl4溶液和H2PtCl6溶液，室温搅拌1.5h。缓慢加入0.1mL浓度为100mM的柠檬酸钠溶液搅拌30min。用去离子水离心洗涤干燥获得AuPt/Fe-N-C。
(4)Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针的制备：将100μL 0.1mg·mL-1的S.aureus毒素特异性抗体加入到1mL 0.6mg·mL-1的AuPt/Fe-N-C分散液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的抗体后，加入1％BSA 100μL反应6h将所得溶液离心分离并将沉淀分散在0.6mL的PBS中以获得0.6mg·mL-1的Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，将其储存在4℃备用。
(二)制备金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器
(1)将玻碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝粉抛光，并分别用乙醇溶液(50％)、硝酸溶液(50％)和去离子水(DW)分别超声清洗，用N2干燥备用；
(2)将10μL 0.6mg·mL-1的金纳米粒子负载的金属框架材料包覆的硼烯复合物(Au/SH-CD/MOF/Bene)分散液滴在步骤(1)中处理好的电极上上并干燥；其中，金纳米粒子负载的金属框架材料包覆的硼烯复合物的制备方法包括：
(i)Au/NH2-MOF的制备：在搅拌下，依次将3mL浓度为0.015M的柠檬酸三钠、0.3mL聚乙二醇400和0.26mL浓度为0.015M的HAuCl4溶液加入到10mL浓度为0.6mg·mL-1的NH2-MOF溶液中反应90min，逐滴加入2mL浓度为0.05M的抗坏血酸继续搅拌90min，离心清洗，冷冻干燥得到Au/NH2-MOF待用；
(ii)SH-β-CD/Au/NH2-MOF的制备：称取7.5mg步骤(1)制备好的Au/NH2-MOF并分散在6mL去离子水中，超声分散均匀。然后，向混合物中添加15mg的巯基-β-环糊精(SH-β-CD)并在室温搅拌1.5h得到溶液SH-β-CD/Au/NH2-MOF。
(iii)SH-β-CD/Au/NH2-MOF/Bene的制备：称取7.5mg的Bene溶解于5mL浓度为3mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)，室温下搅拌1.5h，活化羧基。然后与步骤(2)制备得到的溶液混合，继续搅拌3h。用DW离心洗涤三次冷冻干燥得到SH-β-CD/Au/NH2-MOF/Bene。
(3)将步骤(2)处理好的电极浸入6mmol·L-1的亚甲基蓝(MB)溶液中饱和吸收，并用水和pH＝7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗电极表面；
(4)将50μL的0.6μg·mL-1Ab1加入到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜，然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(5)将50μL 1.5％的牛血清蛋白添加到步骤(4)处理好的96孔板中，在25℃下孵育60min。孵育结束后，将板用PBS洗涤并干燥。
(6)在步骤(5)处理好的板中加入50μL不同浓度的S.aureus毒素，在25℃下孵育90min，然后用PBS洗涤并干燥。
(7)在步骤(6)处理好的板中加入50μL的0.6mg·mL-1Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，并在相同条件下孵育90min，并将未结合的物质用PBS去除。
(8)将步骤(2)处理好的电极置于步骤(7)中孵育30min，孵育完成后用pH＝7.2的PBS清洗电极表面，晾干，得到检测不同浓度的S.aureus毒素的夹心型电化学免疫传感器。
(三)基于电信号模式对金黄色葡萄球菌毒素的检测方法，包括以下步骤：
(1)使用电化学工作站，在三电极体系中，以所制备的特异性抗体的夹心型检测S.aureus毒素的电化学免疫传感器为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1M的pH＝7.2的磷酸盐缓冲液中进行测试；
(2)利用方波伏安法(SWV)对目标物进行检测，扫描电压为-0.1～0.5V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，记录电流峰值；
(3)记录不同浓度下的S.aureus毒素对应的电流峰值；
(4)利用工作曲线法，检测不同浓度的S.aureus毒素溶液，结果表明检测范围0.0002-10ng·mL-1，检出限(LOD)达到了0.067fg·mL-1(S/N＝3)。
(5)该免疫传感器测定牛奶样本中的S.aureus毒素，得到的回收率为98.7％，表明该免疫传感器在牛奶样本中的分析精确性和可靠性是可以接受的。
(四)基于光信号模式对金黄色葡萄球菌毒素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将50μL的0.6μg·mL-1Ab1加入到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜，然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(2)将50μL 1.5％的牛血清蛋白添加到步骤(1)处理好的96孔板中，在25℃下孵育60min。孵育结束后，将板用PBS洗涤并干燥。
(3)在步骤(2)处理好的板中加入50μL不同浓度的S.aureus毒素，在25℃下孵育90min，然后用PBS洗涤并干燥。
(4)在步骤(3)处理好的板中加入50μL的0.6mg·mL-1Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，并在相同条件下孵育90min，并将未结合的物质用PBS去除。
(5)将50μL 25mΜ(5，10，15，20，25，30)的TMB和相同体积60mΜ的H2O2快速添加到步骤(4)处理好的板中，用微量酶标仪测量其在652nm处的吸光度值。
(6)利用工作曲线法，检测不同浓度的S.aureus毒素溶液，结果表明检测范围为0.0002～10ng·mL-1，LOD值为0.067fg·mL-1(S/N＝3)。
本实施例中NH2-MOF、NH2-MOF/Bene、Au/SH-CD/NH2-MOF/Bene、N-C、Fe-N-C和AuPt/Fe-N-C的透射电镜图如图1所示。图1中，(A)为NH2-MOF的透射电镜图，(B)为NH2-MOF/Bene的透射电镜图，(C)为Au/SH-CD/NH2-MOF/Bene的透射电镜图，(D)为N-C的透射电镜图，(E)为Fe-N-C的透射电镜图，(F)为AuPt/Fe-N-C的透射电镜图。
由图1中(A)可以看出，NH2-MOF具有刚性沸石型立方结构；由图1中(B)可以看出，与Bene负载之后，NH2-MOF出现了一层很明显的纳米片；由图1中(C)可以看出，AuNPs均匀地分布在NH2-MOF/Bene的表面。
由图1中(D)可以看出，N-C具有十二面体结构；由图1中(E)可以看出，热解后，Fe-N-C仍然保持十二面体结构，即使发生了一些收缩并且表面变得更粗糙；由图1中(F)可以看出，AuNPs均匀地分布在Fe-N-C的表面；这些结果也说明AuPt/Fe-N-C复合材料的成功制备。
图2为N-C和Fe-N-C的拉曼光谱图。图2显示出了分别在1331cm-1和1576cm-1处出现了G带和D带。N-C和Fe-N-C的D与G带峰强度比(ID/IG)分别为1.01和0.9，主要是多孔结构的缺陷形成。Fe-N-C较低ID/IG值可能归因于热解过程中Fe催化的石墨化机制。
图3为N-C、Fe-N-C和AuPt/Fe-N-C的EDS图，对于N-C来说，只存在N、C两种元素，经过高温煅烧后，元素增加为Fe、N、C，表明Fe-N-C煅烧成功。当AuPt与Fe-N-C复合之后，可清楚地观察到Au、Pt、Fe、N、C共存于AuPt/Fe-N-C中，表明AuPt/Fe-N-C复合成功。
对所得检测不同浓度的S.aureus毒素的夹心型电化学免疫传感器进行SWV(电位范围-0.1～0.5V)测试，所得结果见图4。图4中(A)为S.aureus毒素浓度与电流响应值的关系，由图4中(A)可以看出，在0.0002～10ng·mL-1的浓度范围内，随着S.aureus毒素浓度的增加，电流响应的值也增加，这归因于在更高浓度的S.aureus毒素溶液下，在电极上固定的Ab2的生物共轭物也越多。
图4中(B)为电流强度(I)与logCS.aureus之间的线性关系，根据3σ准则，LOD为0.067fg·mL-1(S/N＝3)；相关系数(R2)为0.9949。
由图4可以看出，基于AuPt/Fe-N-C对MB降解具有卓越催化效率的标签，以改善电化学信号的产生，制备的生物传感器具有更强的分析性能、更低的检出限、更高的灵敏度和更宽的线性范围。
其中通过电化学方波伏安法检测得出电化学免疫传感器的检测范围为0.0002～10ng·mL-1。
所得检测不同浓度的S.aureus毒素的夹心型电化学免疫传感器测定牛奶和自来水样中S.aureus毒素，所得结果见表3。由表3可以看出，得到的回收率在93％到104.9％之间，表明该免疫传感器在牛奶样本中的分析精确性和可靠性是可以接受的。
表3基于免疫传感器的牛奶和自来水中S.aureus毒素的检测结果(加标回收法)
Figure BDA0003455774590000141
基于光信号模式对金黄色葡萄球菌毒素时，将所构建的ELISA使用酶标仪在652nm条件下来对不同浓度的S.aureus毒素进行检测，所得结果见图5。
图5中(A)为S.aureus毒素浓度与吸光度值的变化关系，由图5中(A)可以看出，随着S.aureus毒素浓度的增加，吸光度值逐渐增加。图5中(B)为吸光度与S.aureus毒素浓度的对数的线性关系，由图5中(B)可以看出，吸光度与S.aureus毒素浓度的对数具有良好的线性关系，相关系数(R2)为0.9724，LOD为0.067fg·mL-1(S/N＝3)，显示出了良好的线性和较低的LOD值。
通过酶联免疫检测得出ELISA生物免疫传感器的检测范围为0.0002～10ng·mL-1。
实施例2
(一)制备Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料
(1)Hemin/ZIF-8的制备：将1.07g Zn(NO3)2·6H2O溶解在40mL甲醇中以形成均匀的溶液，并将溶液快速注入40mL含有55mg氯化血红素和2.35g 2-甲基咪唑(MeIM)的甲醇中，在室温下剧烈搅拌3h后，离心收集灰色产物并用甲醇冲洗三次，然后在70℃下真空干燥过夜获得Hemin/ZIF-8。
(2)Fe-N-C的制备：将合成的Hemin/ZIF-8粉末转移到热电偶位置，在N2气氛下以5℃/min的升温速率从室温加热至400℃，并保持0.5h，然后将所得材料自然冷却，得到多面体结构的Fe-N-C。
(3)AuPt/Fe-N-C的制备：称取2mgFe-N-C分散于2mL的去离子水中，依次加入120μL浓度为50mM的HAuCl4溶液和H2PtCl6溶液，室温搅拌0.5h。缓慢加入0.1mL浓度为100mM的柠檬酸钠溶液搅拌10min。用去离子水离心洗涤干燥获得AuPt/Fe-N-C。
(4)Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针的制备：将100μL 0.1mg·mL-1的S.aureus毒素特异性抗体加入到1mL 0.2mg·mL-1的AuPt/Fe-N-C分散液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的抗体后，加入1％BSA 100μL反应2h，将所得溶液离心分离并将沉淀分散在0.2mL的PBS中以获得0.2mg·mL-1的Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，将其储存在4℃备用。
(二)制备金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器
(1)将玻碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝粉抛光，并分别用乙醇溶液(50％)、硝酸溶液(50％)和去离子水(DW)分别超声清洗，用N2干燥备用；
(2)将10μL 0.2mg·mL-1的金纳米粒子负载的金属框架材料包覆的硼烯复合物(Au/SH-CD/MOF/Bene)分散液滴在步骤(1)中处理好的电极上上并干燥；
其中，金纳米粒子负载的金属框架材料包覆的硼烯复合物的制备方法包括：
(i)Au/NH2-MOF的制备：在搅拌下，依次将1mL浓度为0.005M的柠檬酸三钠、0.3mL聚乙二醇400和0.26mL浓度为0.005M的HAuCl4溶液加入到10mL浓度为0.2mg·mL-1的NH2-MOF溶液中反应30min，逐滴加入2mL浓度为0.05M的抗坏血酸继续搅拌30min，离心清洗，冷冻干燥得到Au/NH2-MOF待用；
(ii)SH-β-CD/Au/NH2-MOF的制备：称取2.5mg步骤(i)制备好的Au/NH2-MOF并分散在2mL去离子水中，超声分散均匀。然后，向混合物中添加5mg的巯基-β-环糊精(SH-β-CD)并在室温搅拌0.5h得到溶液SH-β-CD/Au/NH2-MOF。
(iii)SH-β-CD/Au/NH2-MOF/Bene的制备：称取2.5mg的Bene溶解于5mL浓度为1mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)，室温下搅拌0.5h，活化羧基。然后与步骤(ii)制备得到的溶液混合，继续搅拌1h。用DW离心洗涤三次冷冻干燥得到SH-β-CD/Au/NH2-MOF/Bene。
(3)将步骤(2)处理好的电极浸入2mmol·L-1的亚甲基蓝(MB)溶液中饱和吸收，并用水和pH＝7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗电极表面；
(4)将50μL的0.2μg·mL-1Ab1加入到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜，然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(5)将50μL 0.5％的牛血清蛋白添加到步骤(4)处理好的96孔板中，在25℃下孵育20min。孵育结束后，将板用PBS洗涤并干燥。
(6)在步骤(5)处理好的板中加入50μL不同浓度的S.aureus毒素，在25℃下孵育30min，然后用PBS洗涤并干燥。
(7)在步骤(6)处理好的板中加入50μL的0.2mg·mL-1Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，并在相同条件下孵育30min，并将未结合的物质用PBS去除。
(8)将步骤(2)处理好的电极置于步骤(7)中孵育10min，孵育完成后用pH＝7.2的PBS清洗电极表面，晾干，得到检测不同浓度的S.aureus毒素的夹心型电化学免疫传感器。
(三)基于电信号模式对金黄色葡萄球菌毒素的检测方法，包括以下步骤：
(1)使用电化学工作站，在三电极体系中，以所制备的特异性抗体的夹心型检测S.aureus毒素的电化学免疫传感器为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1M的pH＝7.2的磷酸盐缓冲液中进行测试；
(2)利用方波伏安法(SWV)对目标物进行检测，扫描电压为-0.1～0.5V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，记录电流峰值；
(3)记录不同浓度下的S.aureus毒素对应的电流峰值；
(4)利用工作曲线法，检测不同浓度的S.aureus毒素溶液，结果表明检测范围0.0002～10ng·mL-1，检出限(LOD)达到了0.067fg·mL-1(S/N＝3)；
(5)该免疫传感器测定牛奶样本中的S.aureus毒素，得到的回收率为93.0％，表明该免疫传感器在牛奶样本中的分析精确性和可靠性是可以接受的。
(四)基于光信号模式对金黄色葡萄球菌毒素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将50μL的0.2μg·mL-1Ab1加入到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜，然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(2)将50μL 0.5％的牛血清蛋白添加到步骤(1)处理好的96孔板中，在25℃下孵育20min。孵育结束后，将板用PBS洗涤并干燥。
(3)在步骤(2)处理好的板中加入50μL不同浓度的S.aureus毒素，在25℃下孵育30min，然后用PBS洗涤并干燥。
(4)在步骤(3)处理好的板中加入50μL的0.2mg·mL-1Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，并在相同条件下孵育30min，并将未结合的物质用PBS去除。
(5)将50μL的5mΜ的TMB和相同体积的20mΜ的H2O2快速添加到步骤(4)处理好的板中，用微量酶标仪测量其在652nm处的吸光度值。
(6)利用工作曲线法，检测不同浓度的S.aureus毒素溶液，结果表明检测范围为0.0002～10ng·mL-1，LOD值为0.067fg·mL-1(S/N＝3)。
实施例3
(一)制备Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料
(1)Hemin/ZIF-8的制备：将1.07g Zn(NO3)2·6H2O溶解在40mL甲醇中以形成均匀的溶液，并将溶液快速注入40mL含有55mg氯化血红素和2.35g 2-甲基咪唑(MeIM)的甲醇中，在室温下剧烈搅拌6h后，离心收集灰色产物并用甲醇冲洗三次，然后在70℃下真空干燥过夜获得Hemin/ZIF-8。
(2)Fe-N-C的制备：将合成的Hemin/ZIF-8粉末转移到热电偶位置，在N2气氛下以5℃/min的升温速率从室温加热至500℃，并保持1h。然后将所得材料自然冷却，得到Fe-N-C。
(3)AuPt/Fe-N-C的制备：称取4mgFe-N-C分散于4mL的去离子水中，依次加入120μL浓度为50mM的HAuCl4溶液和H2PtCl6溶液，室温搅拌1h。缓慢加入0.1mL浓度为100mM的柠檬酸钠溶液搅拌20min。用去离子水离心洗涤干燥获得AuPt/Fe-N-C。
(4)Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针的制备：将100μL 0.1mg·mL-1的S.aureus毒素特异性抗体加入到1mL 0.4mg·mL-1的AuPt/Fe-N-C分散液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的抗体后，加入1％BSA 100μL反应4h将所得溶液离心分离并将沉淀分散在0.4mL的PBS中以获得0.4mg·mL-1的Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，将其储存在4℃备用。
(二)制备金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器
(1)将玻碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝粉抛光，并分别用乙醇溶液(50％)、硝酸溶液(50％)和去离子水(DW)分别超声清洗，用N2干燥备用；
(2)将10μL 0.4mg·mL-1的金纳米粒子负载的金属框架材料包覆的硼烯复合物(Au/SH-CD/MOF/Bene)分散液滴在步骤(1)中处理好的电极上上并干燥；
其中，金纳米粒子负载的金属框架材料包覆的硼烯复合物的制备方法包括：
(i)Au/NH2-MOF的制备：在搅拌下，依次将2mL浓度为0.01M的柠檬酸三钠、0.2mL聚乙二醇400和0.26mL浓度为0.01M的HAuCl4溶液加入到10mL浓度为0.4mg·mL-1的NH2-MOF溶液中反应60min，逐滴加入2mL浓度为0.05M的抗坏血酸继续搅拌60min，离心清洗，冷冻干燥得到Au/NH2-MOF待用；
(ii)SH-β-CD/Au/NH2-MOF的制备：称取5mg步骤(i)制备好的Au/NH2-MOF并分散在4mL去离子水中，超声分散均匀。然后，向混合物中添加10mg的巯基-β-环糊精(SH-β-CD)并在室温搅拌1h得到溶液SH-β-CD/Au/NH2-MOF。
(iii)SH-β-CD/Au/NH2-MOF/Bene的制备：称取5mg的Bene溶解于5mL浓度为2mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)，室温下搅拌1h，活化羧基。然后与步骤(ii)制备得到的溶液混合，继续搅拌2h。用DW离心洗涤三次冷冻干燥得到SH-β-CD/Au/NH2-MOF/Bene。
(3)将步骤(2)处理好的电极浸入4mmol·L-1的亚甲基蓝(MB)溶液中饱和吸收，并用水和pH＝7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗电极表面；
(4)将50μL的0.4μg·mL-1Ab1加入到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜，然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(5)将50μL 1％的牛血清蛋白添加到步骤(4)处理好的96孔板中，在25℃下孵育40min。孵育结束后，将板用PBS洗涤并干燥。
(6)在步骤(5)处理好的板中加入50μL不同浓度的S.aureus毒素，在25℃下孵育60min，然后用PBS洗涤并干燥。
(7)在步骤(6)处理好的板中加入50μL的0.4mg·mL-1Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，并在相同条件下孵育60min，并将未结合的物质用PBS去除。
(8)将步骤(2)处理好的电极置于步骤(7)中孵育20min，孵育完成后用pH＝7.2的PBS清洗电极表面，晾干，得到检测不同浓度的S.aureus毒素的夹心型电化学免疫传感器。
(三)基于电信号模式对金黄色葡萄球菌毒素的检测方法，包括以下步骤：
(1)使用电化学工作站，在三电极体系中，以所制备的特异性抗体的夹心型检测S.aureus毒素的电化学免疫传感器为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1M的pH＝7.2的磷酸盐缓冲液中进行测试；
(2)利用方波伏安法(SWV)对目标物进行检测，扫描电压为-0.1～0.5V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，记录电流峰值；
(3)记录不同浓度下的S.aureus毒素对应的电流峰值；
(4)利用工作曲线法，检测不同浓度的S.aureus毒素溶液，结果表明检测范围0.0002～10ng·mL-1，检出限(LOD)达到了0.067fg·mL-1(S/N＝3)。
(5)该免疫传感器测定牛奶样本中的S.aureus毒素，得到的回收率为104.5％，表明该免疫传感器在牛奶样本中的分析精确性和可靠性是可以接受的。
(四)基于光信号模式对金黄色葡萄球菌毒素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将50μL的0.4μg·mL-1Ab1加入到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜，然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(2)将50μL 1％的牛血清蛋白添加到步骤(1)处理好的96孔板中，在25℃下孵育40min。孵育结束后，将板用PBS洗涤并干燥。
(3)在步骤(2)处理好的板中加入50μL不同浓度的S.aureus毒素，在25℃下孵育60min，然后用PBS洗涤并干燥。
(4)在步骤(3)处理好的板中加入50μL的0.4mg·mL-1Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，并在相同条件下孵育60min，并将未结合的物质用PBS去除。
(5)将50μL的10mΜ的TMB和相同体积的40mΜ的H2O2快速添加到步骤(4)处理好的板中，用微量酶标仪测量其在652nm处的吸光度值。
(6)利用工作曲线法，检测不同浓度的S.aureus毒素溶液，结果表明检测范围为0.0002～10ng·mL-1，LOD值为0.067fg·mL-1(S/N＝3)。
实施例4
(一)制备Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料
(1)Hemin/ZIF-8的制备：将1.07g Zn(NO3)2·6H2O溶解在40mL甲醇中以形成均匀的溶液，并将溶液快速注入40mL含有55mg氯化血红素和2.35g 2-甲基咪唑(MeIM)的甲醇中，在室温下剧烈搅拌12h后，离心收集灰色产物并用甲醇冲洗三次，然后在70℃下真空干燥过夜获得Hemin/ZIF-8。
(2)Fe-N-C的制备：将合成的Hemin/ZIF-8粉末转移到热电偶位置，在N2气氛下以5℃/min的升温速率从室温加热至700℃，并保持2h。然后将所得材料自然冷却，得到Fe-N-C。
(3)AuPt/Fe-N-C的制备：称取8mg Fe-N-C分散于8mL的去离子水中，依次加入120μL浓度为50mM的HAuCl4溶液和H2PtCl6溶液，室温搅拌2h。缓慢加入0.1mL浓度为100mM的柠檬酸钠溶液搅拌40min。用去离子水离心洗涤干燥获得AuPt/Fe-N-C。
(4)Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针的制备：将100μL 0.1mg·mL-1的S.aureus毒素特异性抗体加入到1mL 0.8mg·mL-1的AuPt/Fe-N-C分散液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的抗体后，加入1％BSA 100μL反应8h将所得溶液离心分离并将沉淀分散在0.8mL的PBS中以获得0.8mg·mL-1的Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，将其储存在4℃备用。
(二)制备金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器
(1)将玻碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝粉抛光，并分别用乙醇溶液(50％)、硝酸溶液(50％)和去离子水(DW)分别超声清洗，用N2干燥备用；
(2)将10μL 0.8mg·mL-1的金纳米粒子负载的金属框架材料包覆的硼烯复合物(Au/SH-CD/MOF/Bene)分散液滴在步骤(1)中处理好的电极上上并干燥；其中，金纳米粒子负载的金属框架材料包覆的硼烯复合物的制备方法包括：
(i)Au/NH2-MOF的制备：在搅拌下，依次将4mL浓度为0.02M的柠檬酸三钠、0.4mL聚乙二醇400和0.26mL浓度为0.02M的HAuCl4溶液加入到10mL浓度为0.8mg·mL-1的NH2-MOF溶液中反应120min，逐滴加入2mL浓度为0.05M的抗坏血酸继续搅拌120min，离心清洗，冷冻干燥得到Au/NH2-MOF待用；
(ii)SH-β-CD/Au/NH2-MOF的制备：称取15mg步骤(1)制备好的Au/NH2-MOF并分散在8mL去离子水中，超声分散均匀。然后，向混合物中添加20mg的巯基-β-环糊精(SH-β-CD)并在室温搅拌2h得到溶液SH-β-CD/Au/NH2-MOF。
(iii)SH-β-CD/Au/NH2-MOF/Bene的制备：称取10mg的Bene溶解于5mL浓度为4mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)，室温下搅拌2h，活化羧基。然后与步骤(2)制备得到的溶液混合，继续搅拌4h。用DW离心洗涤三次冷冻干燥得到SH-β-CD/Au/NH2-MOF/Bene。
(3)将步骤(2)处理好的电极浸入8mmol·L-1的亚甲基蓝(MB)溶液中饱和吸收，并用水和pH＝7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗电极表面；
(4)将50μL的0.8μg·mL-1Ab1加入到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜,然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(5)将50μL 2％的牛血清蛋白添加到步骤(4)处理好的96孔板中，在25℃下孵育80min。孵育结束后，将板用PBS洗涤并干燥。
(6)在步骤(5)处理好的板中加入50μL不同浓度的S.aureus毒素，在25℃下孵育120min，然后用PBS洗涤并干燥。
(7)在步骤(6)处理好的板中加入50μL的0.8mg·mL-1Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，并在相同条件下孵育120min，并将未结合的物质用PBS去除。
(8)将步骤(2)处理好的电极置于步骤(7)中孵育40min，孵育完成后用pH＝7.2的PBS清洗电极表面，晾干，得到检测不同浓度的S.aureus毒素的夹心型电化学免疫传感器。
(三)基于电信号模式对金黄色葡萄球菌毒素的检测方法，包括以下步骤：
(1)使用电化学工作站，在三电极体系中，以所制备的特异性抗体的夹心型检测S.aureus毒素的电化学免疫传感器为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1M的pH＝7.2的磷酸盐缓冲液中进行测试；
(2)利用方波伏安法(SWV)对目标物进行检测，扫描电压为-0.1-0.5V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，记录电流峰值；
(3)记录不同浓度下的S.aureus毒素对应的电流峰值；
(4)利用工作曲线法，检测不同浓度的S.aureus毒素溶液，结果表明检测范围0.0002～10ng·mL-1，检出限(LOD)达到了0.067fg·mL-1(S/N＝3)。
(5)使用酶标仪在652nm处测量检测S.aureus毒素的ELISA分析液，结果表明检测范围为0.0002～10ng·mL-1，LOD值为0.067fg·mL-1(S/N＝3)。
(6)该免疫传感器测定牛奶样本中的S.aureus毒素，得到的回收率为102％，表明该免疫传感器在牛奶样本中的分析精确性和可靠性是可以接受的。
(四)基于光信号模式对金黄色葡萄球菌毒素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将50μL的0.8μg·mL-1Ab1加入到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜,然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(2)将50μL 2％的牛血清蛋白添加到步骤(1)处理好的96孔板中，在25℃下孵育80min。孵育结束后，将板用PBS洗涤并干燥。
(3)在步骤(2)处理好的板中加入50μL不同浓度的S.aureus毒素，在25℃下孵育120min，然后用PBS洗涤并干燥。
(4)在步骤(3)处理好的板中加入50μL的0.8mg·mL-1Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，并在相同条件下孵育120min，并将未结合的物质用PBS去除。
(5)将50μL 25mΜ(5，10，15，20，25，30)的TMB和相同体积80mΜ的H2O2快速添加到步骤(4)处理好的板中，用微量酶标仪测量其在652nm处的吸光度值。
(6)利用工作曲线法，检测不同浓度的S.aureus毒素溶液，结果表明检测范围为0.0002～10ng·mL-1，LOD值为0.067fg·mL-1(S/N＝3)。
实施例5
(一)制备Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料
(1)Hemin/ZIF-8的制备：将1.07g Zn(NO3)2·6H2O溶解在40mL甲醇中以形成均匀的溶液，并将溶液快速注入40mL含有55mg氯化血红素和2.35g 2-甲基咪唑(MeIM)的甲醇中，在室温下剧烈搅拌24h后，离心收集灰色产物并用甲醇冲洗三次，然后在70℃下真空干燥过夜获得Hemin/ZIF-8。
(2)Fe-N-C的制备：将合成的Hemin/ZIF-8粉末转移到热电偶位置，在N2气氛下以5℃/min的升温速率从室温加热至800℃，并保持2.5h。然后将所得材料自然冷却，得到Fe-N-C。
(3)AuPt/Fe-N-C的制备：称取10mg Fe-N-C分散于10mL的去离子水中，依次加入120μL浓度为50mM的HAuCl4溶液和H2PtCl6溶液，室温搅拌2.5h。缓慢加入0.1mL浓度为100mM的柠檬酸钠溶液搅拌50min。用去离子水离心洗涤干燥获得AuPt/Fe-N-C。
(4)Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针的制备：将100μL 0.1mg·mL-1的S.aureus毒素特异性抗体加入到1mL 1mg·mL-1的AuPt/Fe-N-C分散液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的抗体后，加入1％BSA 100μL反应10h将所得溶液离心分离并将沉淀分散在1.0mL的PBS中以获得1mg·mL-1的Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，将其储存在4℃备用。
(二)制备金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器
(1)将玻碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝粉抛光，并分别用乙醇溶液(50％)、硝酸溶液(50％)和去离子水(DW)分别超声清洗，用N2干燥备用；
(2)将10μL 1.0mg·mL-1的金纳米粒子负载的金属框架材料包覆的硼烯复合物(Au/SH-CD/MOF/Bene)分散液滴在步骤(1)中处理好的电极上上并干燥；
其中，金纳米粒子负载的金属框架材料包覆的硼烯复合物的制备方法包括：
(i)Au/NH2-MOF的制备：在搅拌下，依次将5mL浓度为0.025M的柠檬酸三钠、0.5mL聚乙二醇400和0.26mL浓度为0.025M的HAuCl4溶液加入到10mL浓度为1mg·mL-1的NH2-MOF溶液中反应150min，逐滴加入2mL浓度为0.05M的抗坏血酸继续搅拌2h150 min，离心清洗，冷冻干燥得到Au/NH2-MOF待用；
(ii)SH-β-CD/Au/NH2-MOF的制备：称取15mg步骤(i)制备好的Au/NH2-MOF并分散在10mL去离子水中，超声分散均匀。然后，向混合物中添加25mg的巯基-β-环糊精(SH-β-CD)并在室温搅拌2.5h得到溶液SH-β-CD/Au/NH2-MOF。
(iii)SH-β-CD/Au/NH2-MOF/Bene的制备：称取15mg的Bene溶解于5mL浓度为5mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)，室温下搅拌2.5h，活化羧基。然后与步骤(ii)制备得到的溶液混合，继续搅拌5h。用DW离心洗涤三次冷冻干燥得到SH-β-CD/Au/NH2-MOF/Bene。
(3)将步骤(2)处理好的电极浸入10mmol·L-1的亚甲基蓝(MB)溶液中饱和吸收，并用水和pH＝7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗电极表面；
(4)将50μL的1.0μg·mL-1Ab1加入到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜,然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(5)将50μL 2.5％的牛血清蛋白添加到步骤(4)处理好的96孔板中，在25℃下孵育100min。孵育结束后，将板用PBS洗涤并干燥。
(6)在步骤(5)处理好的板中加入50μL不同浓度的S.aureus毒素，在25℃下孵育150min，然后用PBS洗涤并干燥。
(7)在步骤(6)处理好的板中加入50μL的1mg·mL-1Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，并在相同条件下孵育150min，并将未结合的物质用PBS去除。
(8)将步骤(2)处理好的电极置于步骤(7)中孵育50min，孵育完成后用pH＝7.2的PBS清洗电极表面，晾干，得到检测不同浓度的S.aureus毒素的夹心型电化学免疫传感器。
(三)基于电信号模式对金黄色葡萄球菌毒素的检测方法，包括以下步骤：
(1)使用电化学工作站，在三电极体系中，以所制备的特异性抗体的夹心型检测S.aureus毒素的电化学免疫传感器为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1M的pH＝7.2的磷酸盐缓冲液中进行测试；
(2)利用方波伏安法(SWV)对目标物进行检测，扫描电压为-0.1～0.5V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，记录电流峰值；
(3)记录不同浓度下的S.aureus毒素对应的电流峰值；
(4)利用工作曲线法，检测不同浓度的S.aureus毒素溶液，结果表明检测范围0.0002～10ng·mL-1，检出限(LOD)达到了0.067fg·mL-1(S/N＝3)。
(5)该免疫传感器测定牛奶样本中的S.aureus毒素，得到的回收率为95.1％，表明该免疫传感器在牛奶样本中的分析精确性和可靠性是可以接受的。
(四)基于光信号模式对金黄色葡萄球菌毒素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将50μL的1.0μg·mL-1Ab1加入到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜，然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(2)将50μL 2.5％的牛血清蛋白添加到步骤(4)处理好的96孔板中，在25℃下孵育100min。孵育结束后，将板用PBS洗涤并干燥。
(3)在步骤(5)处理好的板中加入50μL不同浓度的S.aureus毒素，在25℃下孵育150min，然后用PBS洗涤并干燥。
(4)在步骤(6)处理好的板中加入50μL的1mg·mL-1Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，并在相同条件下孵育150min，并将未结合的物质用PBS去除。
(5)将50μL的5mΜ的TMB和相同体积的100mΜ的H2O2快速添加到步骤(4)处理好的板中，用微量酶标仪测量其在652nm处的吸光度值。
(6)利用工作曲线法，检测不同浓度的S.aureus毒素溶液，结果表明检测范围为0.0002～10ng·mL-1，LOD值为0.067fg·mL-1(S/N＝3)。
实施例6
(一)制备Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料
(1)Hemin/ZIF-8的制备：将1.07g Zn(NO3)2·6H2O溶解在40mL甲醇中以形成均匀的溶液，并将溶液快速注入40mL含有55mg氯化血红素和2.35g 2-甲基咪唑(MeIM)的甲醇中，在室温下剧烈搅拌36h后，离心收集灰色产物并用甲醇冲洗三次，然后在70℃下真空干燥过夜获得Hemin/ZIF-8。
(2)Fe-N-C的制备：将合成的Hemin/ZIF-8粉末转移到热电偶位置，在N2气氛下以5℃/min的升温速率从室温加热至900℃，并保持3h。然后将所得材料自然冷却，得到Fe-N-C。
(3)AuPt/Fe-N-C的制备：称取12mgFe-N-C分散于12mL的去离子水中，依次加入120μL浓度为50mM的HAuCl4溶液和H2PtCl6溶液，室温搅拌3h。缓慢加入0.1mL浓度为100mM的柠檬酸钠溶液搅拌60min。用去离子水离心洗涤干燥获得AuPt/Fe-N-C。
(4)Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针的制备：将100μL 0.1mg·mL-1的S.aureus毒素特异性抗体加入到1mL 1.2mg·mL-1的AuPt/Fe-N-C分散液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的抗体后，加入1％BSA 100μL反应12h将所得溶液离心分离并将沉淀分散在1.2mL的PBS中以获得1.2mg·mL-1的Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，将其储存在4℃备用。
(二)制备金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器
(1)将玻碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝(Al2O3)粉抛光，并分别用乙醇溶液(50％)、硝酸溶液(50％)和去离子水(DW)分别超声清洗，用N2干燥备用；
(2)将10μL 1.2mg·mL-1的金纳米粒子负载的金属框架材料包覆的硼烯复合物(Au/SH-CD/MOF/Bene)分散液滴在步骤(1)中处理好的电极上上并干燥；其中，金纳米粒子负载的金属框架材料包覆的硼烯复合物的制备方法包括：
(i)Au/NH2-MOF的制备：在搅拌下，依次将6mL浓度为0.03M的柠檬酸三钠、0.1～0.6mL聚乙二醇400和0.26mL浓度为0.03M的HAuCl4溶液加入到10mL浓度为1.2mg·mL-1的NH2-MOF溶液中反应180min，逐滴加入2mL浓度为0.05M的抗坏血酸继续搅拌180min，离心清洗，冷冻干燥得到Au/NH2-MOF待用；
(ii)SH-β-CD/Au/NH2-MOF的制备：称取20mg步骤(1)制备好的Au/NH2-MOF并分散在12mL去离子水中，超声分散均匀。然后，向混合物中添加30mg的巯基-β-环糊精(SH-β-CD)并在室温搅拌3h得到溶液SH-β-CD/Au/NH2-MOF。
(iii)SH-β-CD/Au/NH2-MOF/Bene的制备：称取20mg的Bene溶解于5mL浓度为6mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)，室温下搅拌3h，活化羧基。然后与步骤(2)制备得到的溶液混合，继续搅拌6h。用DW离心洗涤三次冷冻干燥得到SH-β-CD/Au/NH2-MOF/Bene。
(3)将步骤(2)处理好的电极浸入12mmol·L-1的亚甲基蓝(MB)溶液中饱和吸收，并用水和pH＝7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗电极表面；
(4)将50μL的1.2μg·mL-1Ab1加入到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜,然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(5)将50μL 3％的牛血清蛋白添加到步骤(4)处理好的96孔板中，在25℃下孵育120min。孵育结束后，将板用PBS洗涤并干燥。
(6)在步骤(5)处理好的板中加入50μL不同浓度的S.aureus毒素，在25℃下孵育180min，然后用PBS洗涤并干燥。
(7)在步骤(6)处理好的板中加入50μL的1.2mg·mL-1Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，并在相同条件下孵育180min，并将未结合的物质用PBS去除。
(8)将步骤(2)处理好的电极置于步骤(7)中孵育60min，孵育完成后用pH＝7.2的PBS清洗电极表面，晾干，得到检测不同浓度的S.aureus毒素的夹心型电化学免疫传感器。
(三)基于电信号模式对金黄色葡萄球菌毒素的检测方法，包括以下步骤：
(1)使用电化学工作站，在三电极体系中，以所制备的特异性抗体的夹心型检测S.aureus毒素的电化学免疫传感器为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在10mL浓度为0.1M的pH＝7.2的磷酸盐缓冲液中进行测试；
(2)利用方波伏安法(SWV)对目标物进行检测，扫描电压为-0.1～0.5V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，记录电流峰值；
(3)记录不同浓度下的S.aureus毒素对应的电流峰值；
(4)利用工作曲线法，检测不同浓度的S.aureus毒素溶液，结果表明检测范围0.0002-10ng·mL-1，检出限(LOD)达到了0.067fg·mL-1(S/N＝3)。
(5)该免疫传感器测定牛奶样本中的S.aureus毒素，得到的回收率为104.9％，表明该免疫传感器在牛奶样本中的分析精确性和可靠性是可以接受的。
(四)基于光信号模式对金黄色葡萄球菌毒素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将50μL的1.2μg·mL-1Ab1加入到96孔板中，并在冰箱中孵育过夜,然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
(2)将50μL 3％的牛血清蛋白添加到步骤(1)处理好的96孔板中，在25℃下孵育120min。孵育结束后，将板用PBS洗涤并干燥。
(3)在步骤(2)处理好的板中加入50μL不同浓度的S.aureus毒素，在25℃下孵育180min，然后用PBS洗涤并干燥。
(4)在步骤(3)处理好的板中加入50μL的1.2mg·mL-1Ab2/AuPt/Fe-N-C生物探针材料，并在相同条件下孵育180min，并将未结合的物质用PBS去除。
(5)将50μL的30mΜ的TMB和相同体积的120mΜ的H2O2快速添加到步骤(4)处理好的板中，用微量酶标仪测量其在652nm处的吸光度值。
(6)利用工作曲线法，检测不同浓度的S.aureus毒素溶液，结果表明检测范围为0.0002～10ng·mL-1，LOD值为0.067fg·mL-1(S/N＝3)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针，包括金黄色葡萄球菌毒素特异性抗体和与所述金黄色葡萄球菌毒素特异性抗体结合的AuPt纳米粒子/多面体结构Fe-N-C复合材料；
所述AuPt纳米粒子/多面体结构Fe-N-C复合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将可溶性锌源、氯化血红素、2-甲基咪唑和醇溶剂混合，进行晶化反应，得到血红素/ZIF-8复合物；
(2)对所述血红素/ZIF-8复合物进行热处理，得到具有多面体结构的Fe-N-C；
(3)将所述具有多面体结构的Fe-N-C、HAuCl4、H2PtCl6、还原剂与水混合，进行还原反应，得到AuPt纳米粒子/多面体结构Fe-N-C复合材料。
2.一种金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器，其特征在于，包括权利要求1所述的基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针。
3.权利要求2所述金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将负载有固定剂的电极置于亚甲基蓝溶液中进行浸泡，得到表面固定有亚甲基蓝的电极；所述固定剂为金属框架材料/硼烯复合物，所述金属框架材料负载有金纳米粒子；
(2)将金黄色葡萄球菌毒素抗体溶液、非特异性蛋白、金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液、金黄色葡萄球菌毒素检测用生物探针、表面固定有亚甲基蓝的电极进行孵育，得到金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述金属框架材料/硼烯复合物的制备方法，包括以下步骤：
(i)将柠檬酸三钠、聚乙二醇、HAuCl4、NH2-MOF、还原剂与水混合，进行还原反应，得到Au/NH2-MOF分散液；
(ii)将所述负载金纳米粒子的NH2-MOF分散液与巯基-β-环糊精混合，得到巯基修饰的Au/NH2-MOF分散液；
(iii)将羧基活化的硼烯与巯基修饰的Au/NH2-MOF分散液搅拌混合，得到金属框架材料/硼烯复合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的孵育包括：
将金黄色葡萄球菌毒素抗体溶液在孵育器中进行第一孵育，洗去未结合物质后得到第一孵育产物；
向所述第一孵育产物中加入非特异性蛋白，进行第二孵育，洗去未结合物质后得到第二孵育产物；
向所述第二孵育产物中加入金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液，进行第三孵育，洗去未结合物质后得到第三孵育产物；
向所述第三孵育产物中加入金黄色葡萄球菌毒素检测用生物探针，进行第四孵育，洗去未结合物质后得到第四孵育产物；
向所述第四孵育产物中加入表面固定有亚甲基蓝的电极，进行第五孵育，得到金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器。
6.一种基于电信号模式检测金黄色葡萄球菌毒素的方法，包括以下步骤：
以待测样品替换金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液，按照权利要求3～5任意一项所述制备方法制备金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器；
以金黄色葡萄球菌毒素检测电化学免疫传感器作为工作电极，以磷酸盐缓冲液作为电解液，以三电极体系采用方波伏安法进行检测，获得待测样品的电流峰值；
根据预定的第一标准曲线和待测样品的电流峰值得到待测样品中金黄色葡萄球菌毒素浓度；所述第一标准曲线为金黄色葡萄球菌毒素浓度对数与电流峰值的线性关系曲线。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方波伏安法进行检测的参数包括：扫描电压为-0.1～0.5V，脉冲振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s。
8.一种金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器，其特征在于，包括权利要求1所述的基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针。
9.权利要求8所述金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
将金黄色葡萄球菌毒素抗体溶液、非特异性蛋白、金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液、金黄色葡萄球菌毒素检测用生物探针进行孵育，得到金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器。
10.一种基于光信号模式检测金黄色葡萄球菌毒素的方法，包括以下步骤：
以待测样品作为金黄色葡萄球菌毒素抗原溶液，按照权利要求9所述制备方法制备金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器；
将TMB溶液、H2O2溶液与金黄色葡萄球菌毒素检测ELISA生物免疫传感器混合，获得待测样品在652nm处的吸光度值；
根据预定的第二标准曲线和待测样品的吸光度值得到待测样品中金黄色葡萄球菌毒素浓度；所述第二标准曲线为金黄色葡萄球菌毒素浓度对数与吸光度值的线性关系曲线。
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