CN113176243A - 一种食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法，属于微生物检测技术领域。该检测方法包括以下步骤：利用金黄色葡萄球菌适配体互补链和辣根过氧化物酶对水溶性上转换纳米材料进行修饰，得到显色探针；利用金黄色葡萄球菌适配体修饰氨基功能化磁性纳米颗粒，得到适配体修饰的磁性纳米颗粒，作为捕获探针；将所述显色探针和所述捕获探针混合孵育，得到双信号分子‑磁纳米颗粒复合物体系，即为特异性检测体系。本发明建立的特异性双信号检测体系具有较宽的线性检测范围，荧光强度和吸光度信号检测限LOD分别为22CFU/mL和20CFU/mL，灵敏度高，并且能特异性检测食品中金黄色葡萄球菌。

Description

一种食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，特别是涉及一种食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌作为一种食源性病原体，可在食品生产到消费过程的任何阶段导致食品污染引起食品中毒。金黄色葡萄球菌占中国食源性细菌暴发的12.5％，是仅次于副溶血性弧菌和沙门氏菌的第三大常见食源性致病菌。它可以引起许多疾病，从轻微的皮肤和软组织感染到危及生命的疾病，如皮炎、胃肠道感染、菌血症和感染性心内膜炎等。我国国标中也明确规定猪肉中金黄色葡萄球菌的检测量在100CFU/g-1000CFU/g。但是，传统检测方法，如平板计数法，聚合酶链式反应等，不仅检测周期长、步骤繁琐，更为重要的是结果可能出现假阳性，不能实现对金黄色葡萄球菌的快速检测。另外，目前用于减少金黄色葡萄球菌检测时间的先进方法主要包括实时多重聚合酶链反应、酶联免疫法和环介导等温扩增等。虽然这些技术具有较高的灵敏度和有效性，但也存在一些固有的缺陷，如昂贵的实验室设施、复杂的预处理程序和对训练有素的工作人员的需求，不利于开展现场检测和在实际应用中推广。因此，基于现有技术检测金黄色葡萄球菌的方法存在的缺陷，亟需一种特异性强、灵敏度高的用于快速简便的检测金黄色葡萄球菌的方法，以克服传统方法的不足，提高金黄色葡萄球菌检测的灵敏度和准确性。

发明内容

本发明的目的是提供一种食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过构建特异性双信号检测体系，实现了对金黄色葡萄球菌快速、高灵敏度、特异性的检测。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法，包括以下步骤：

利用金黄色葡萄球菌适配体互补链和辣根过氧化物酶对水溶性上转换纳米材料进行修饰，得到显色探针；

利用金黄色葡萄球菌适配体对氨基功能化磁性纳米颗粒进行修饰，得到适配体修饰的磁性纳米颗粒，作为捕获探针；

将所述显色探针和所述捕获探针混合孵育，得到双信号分子-磁纳米颗粒复合物体系，即为特异性检测体系。

优选的是，所述显色探针和所述捕捉探针的体积比为10：1-11，孵育时间为5-30min。

优选的是，所述显色探针的浓度为1-3mg/mL，所述捕捉探针的浓度为1-3mg/mL。

优选的是，所述水溶性上转换纳米材料、金黄色葡萄球菌适配体互补链和辣根过氧化物酶的用量比为(8-15)mg:(2-8)nmol:(2-8)mg，孵育时间为7-8h。

优选的是，所述水溶性上转换纳米材料的制备方法包括以下步骤：

步骤1：将稀土氯化物与油酸以及1-十八烯混合，磁力搅拌下加热，然后冷却，再将冷却液与含有氟化铵和氢氧化钠的甲醇溶液反应，得到油性上转换纳米材料；

步骤2：将步骤1所得油性上转换纳米材料加入盐酸溶液中，超声处理，得到游离的上转换纳米材料；

步骤3：将步骤2所得的上转换纳米材料与氨水、正硅酸四乙脂和3-氨丙基三乙氧基硅烷进行反应，得到水溶性上转换纳米材料。

优选的是，所述油酸和1-十八烯的体积比为3:5-10；

所述氟化铵和所述氢氧化钠的质量比为70-75:50；

所述氨水、正硅酸四乙脂和3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为(1-3):(0.01-0.05):(0.1-0.5)。

优选的是，还包括以下步骤：

制备不同浓度金黄色葡萄球菌的标准液，并加入特异性检测体系中，经过孵育后，通过磁分离得到上层清液；然后测定特异性检测体系的上转换荧光强度和紫外吸光度两种信号，建立金黄色葡萄球菌双信号检测标准曲线；

制备待测样品的检测体系，并加入所述特异性检测体系中，测定所述特异性检测体系的荧光强度和吸光度，利用所述标准曲线求出待测样品中的金黄色葡萄球菌浓度。

优选的是，所述金黄色葡萄球菌的标准液和所述特异性检测体系的孵育时间为0.5-1h。

本发明还提供根据所述的食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法在检测食品中金黄色葡萄球菌中的应用。

优选的是，所述食品包括鲜肉和牛奶。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明公开一种食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法，基于上转换纳米可控制备的双信号分子和磁性纳米颗粒捕捉信号分子复合物，构建稳态特异性金黄色葡萄球菌检测体系(构建原理图如图1所示)。

(2)本发明构建的特异性混合检测体系，具体优化设计的双信号分子与磁性纳米颗粒捕捉信号分子的复合物体系，对金黄色葡萄球菌具有强双信号响应性，可有效消除背景荧光及其他离子的干扰，对金黄色葡萄球菌的检测具有高特异性，能够实现对金黄色葡萄球菌含量的高灵敏度检测，克服了传统方法的不足，对保障食品安全至关重要。

(3)本发明建立的金黄色葡萄球菌浓度与荧光强度信号特征值和吸光度信号特征值的线性浓度范围为56-5.6×10⁶CFU/mL，具有较宽的线性检测范围，检测限LOD分别为22CFU/mL和20CFU/mL，两者方法可以相互验证。与传统的平板计数法结果对比，没有显著性差异，并且比传统的平板计数检测更加快速，可以满足食品中金黄色葡萄球菌的高灵敏检测，具有很好的通用性。

(4)本发明通过构建稳定的特异性金黄色葡萄球菌检测体系，实现食品样品中金黄色葡萄球菌的高特异性、灵敏性检测，具有较宽的浓度检测范围和较低的检测限，从而使得该检测方法具有良好的实用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明基于磁分离结合上转换荧光和比色法的金黄色葡萄球菌检测原理图；

图2为实施例1制备的水溶性上转换纳米材料的透射电镜图；

图3为实施例1制备的氨基功能化磁性纳米颗粒的透射电镜图；

图4为实施例1不同金黄色葡萄球菌浓度下特异性检测体系的荧光信号(A)和吸光度信号(B)；

图5为实施例1不同金黄色葡萄球菌浓度下金黄色葡萄球菌荧光检测和比色检测标准曲线；A：荧光强度信号特征值Y1与金黄色葡萄球菌浓度关系的标准曲线图，B：吸光度信号特征值Y2与金黄色葡萄球菌浓度关系的标准曲线图；

图6为对比例1-3不同食源性致病菌的荧光强度信号(A)和吸光度信号(B)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例所用的适配体或其互补链由上海生物科技公司合成，购买得到。

实施例1猪肉中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法，具体步骤为：

步骤一，水溶性上转换纳米材料的制备：准确称取0.1183g六水氯化钇、0.0388g六水氯化镱以及0.0038g六水氯化铒，用10mL甲醇超声溶解10min，并将其转移至装有6mL油酸和10mL 1-十八烯(油酸:1-十八烯＝3:5)的250mL三口圆底烧瓶中；在氩气保护条件下，磁力搅拌并加热至160℃，保持40min形成透明溶液后，自然冷却至室温；随后，将溶解有50mg氢氧化钠(1.25mmol)和70mg氟化铵(2mmol)的10mL甲醇混合液逐滴滴加到上述烧瓶中，形成白色悬浊液，然后在封闭条件下，加热至45℃并保持半小时；然后，打开装置，加热至70℃持续搅拌50min以挥发混合液中的甲醇；接着，将混合液在氩气流下加热至100℃，停留10min排除装置中多余的甲醇及空气，继续升温(20℃/min)至300℃，反应1.5h后，关闭加热；待自然冷却至室温后，用乙醇和环己烷(2:1)混合溶液对反应产物进行清洗2-3次，60℃下真空干燥得到油溶性上转换纳米颗粒。称取50mg油溶性上转换材料加入1.5mL盐酸溶液，超声处理15min；用去离子水离心清洗后，转移到100mL圆底烧瓶中，然后将30mL乙醇溶液、10mL去离子水与1mL的氨水(氨水溶液质量分数为25％)依次加入上转换纳米颗粒溶液中，在65℃水浴中，磁力搅拌反应5min；接着65℃条件下逐滴加入10μL正硅酸四乙脂，搅拌反应6h；逐滴加入100μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌反应3h，冷却至室温；最后用乙醇和水的混合液(1：1)对反应产物清洗，真空干燥，得到水溶性上转换纳米材料(图2)。

步骤二，水溶性上转换纳米材料同时连接适配体互补链和辣根过氧化物酶：称取8mg水溶性上转换纳米材料分散于5mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.4,10mM)和1.25mL的戊二醛溶液(戊二醛溶液质量分数为25％)于25℃恒温摇床培养箱活化氨基1.5h，反应结束后离心清洗三次；将表面活化的水溶性上转换纳米材料重新分散于5mL磷酸盐缓冲液中，加入20μL100μM的适配体互补链，37℃缓慢振荡10min，然后再加入1mL的辣根过氧化物酶(2mg/mL),4℃缓慢搅拌反应7h；孵育结束后用磷酸盐缓冲液清洗三次后重新分散在5mL磷酸盐缓冲液中，得到2mg/mL同时负载适配体互补链和辣根过氧化物酶的上转换纳米颗粒。上述适配体互补链(SEQ ID NO：1)的序列为：5'-NH₂-TTA GCA AAG TAG CGT GCA CTT TTG ACG TAGCTG TGG GAT GAC CAG CGA GCG CTA CTG AGA ACG TGC CGA GGA AGT ACC GTA CCA TTGC-3'。

步骤三，磁性纳米材料的制备：确称取3.5g 1,6-己二胺、1g无水醋酸钠和0.5g六水合三氯化铁于100mL单口圆底烧瓶中，再加入15mL乙二醇；然后，将烧瓶放置在50℃水浴锅中，磁力搅拌30min，得到均匀分散的酒红色溶液；接着，将其转移至50mL聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，并置于200℃的烘箱中高温反应5.5h；冷却至室温后，使用磁铁分离出反应液中的磁性纳米材料，分离后的黑色固体用超纯水和乙醇清洗三次，真空干燥，得到氨基功能化磁性纳米颗粒(图3)。

步骤四，磁性纳米材料的修饰：称取10mg磁性纳米材料分散于5mL磷酸盐缓冲液(pH 7.4,10mM)和1.25mL戊二醛溶液(戊二醛溶液质量分数为25％)于25℃恒温摇床培养箱活化氨基1.5h，离心清洗后；将表面活化的氨基功能化磁性纳米材料重新分散于5mL磷酸盐缓冲液中，加入60μL 100μM的适配体，37℃搅拌反应2h；孵育结束后用磷酸盐缓冲液清洗三次后重新分散在5mL磷酸盐缓冲液中，得到2mg/mL适配体修饰的磁性纳米颗粒。上述适配体的序列(SEQ ID NO：2)为：5'-NH₂-GCAATG GTA CGG TAC TTC CTC GGC ACG TTC TCA GTAGCG CTC GCT GGT CAT CCC ACA GCT ACG TCA AAA GTG CAC GCT ACT TTG CTA A-3'。

步骤五，特异性检测体系的构建：将步骤二得到的适配体互补链和辣根过氧化物酶的上转换纳米颗粒配制成2mg/mL溶液，作为显色探针溶液；将步骤四得到的适配体修饰的磁性纳米颗粒配置成浓度为2mg/mL溶液，作为捕捉探针溶液；将显色探针溶液与捕捉探针溶液等体积混合，得到特异性检测体系。

为了显色探针溶液全部与捕捉探针溶液结合，显色探针溶液与捕捉探针溶液的体积比例是通过检测信号优化确定的。具体为，配制2mg/mL的显色探针溶液和捕捉探针溶液，将0.1mL显色探针溶液与0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.11mL不同体积的捕捉探针溶液混合；反应30min后，采集混合体系磁分离后的上清液荧光光谱。当磁性纳米材料的体积为0.09mL时混合体系的上清液荧光最低。因此，0.09mL为最佳磁性纳米材料添加量，将2mg/mL显色探针溶液与2mg/mL的捕捉探针溶液按10:9比例混合，得到的特异性检测体系，对金黄色葡萄球菌检测具有高的特异性和灵敏性。

检测体系的时间优化。将2mg/mL显色探针溶液与2mg/mL的捕捉探针溶液按10:9比例混合，混合反应0、5、10、15、20、30min后，采集磁分离后的上清液荧光强度。结果表明，随着时间不断增加，混合溶液在655nm的荧光强度不断下降，而当时间达到20min以后，混合溶液在655nm的荧光强度趋于稳定。因此，最佳结合时间为20min。

步骤六，金黄色葡萄球菌检测标准曲线的建立：分别将不同浓度的金黄色葡萄球菌溶液(56、5.6×10²、5.6×10³、5.6×10⁴、5.6×10⁵、5.6×10⁶CFU/mL)加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值Y1和吸光度信号特征值Y2，建立金黄色葡萄球菌浓度c与荧光强度信号特征值Y1和吸光度信号特征值Y2的关系，即得到金黄色葡萄球菌检测标准曲线；具体为，图4为不同金黄色葡萄球菌浓度下特异性检测体系的荧光信号(左)和吸光度信号(右)，随着金黄色葡萄球菌浓度的增加，655nm的上转换荧光强度和670nm处的吸光度值不断上升。荧光强度信号特征值Y1与金黄色葡萄球菌浓度关系的标准曲线图如图5(左)。金黄色葡萄球菌浓度对数在56-5.6×10⁶CFU/mL范围内与荧光强度信号特征值Y1呈现出良好的线性关系，其线性关系为Y1＝997.51logc+770.86，决定系数R²＝0.9904，检测限LOD为22CFU/mL；吸光度信号特征值Y2与金黄色葡萄球菌浓度关系的标准曲线图如图5(右)。金黄色葡萄球菌浓度对数在56-5.6×10⁶CFU/mL范围内与吸光度信号特征值Y2呈现出良好的线性关系，其线性关系为Y2＝0.1592logc+0.4387，决定系数R²＝0.9936，检测限LOD为20CFU/mL。

步骤七，猪肉样品中金黄色葡萄球菌的检测：将25g新鲜的猪肉样品用无菌生理盐水清洗数次，然后将其置于生物安全柜中，使用30W的紫外灯辐照灭菌15min以消除样品本身可能潜在的致病菌干扰；接着将1mL浓度为1×10⁵CFU/mL的金黄色葡萄球菌加入到猪肉样品中，孵育10min以模仿金黄色葡萄球菌在样品中自然生长状态；接着，将上述加标后的样品加入到100mL的无菌生理盐水中，均质3min，用上述构建的检测体系测定荧光强度信号特征值和吸光度信号特征值；最后，通过所构建的金黄色葡萄球菌检测标准曲线，计算出猪肉样品的金黄色葡萄球菌含量分别为0.97×10⁵CFU/mL和0.98×10⁵CFU/mL。

实施例2牛肉中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法，具体步骤为：

步骤一，水溶性上转换纳米材料的制备：准确称取0.1183g六水氯化钇、0.0388g六水氯化镱以及0.0038g六水氯化铒，用10mL甲醇超声溶解10min，并将其转移至装有6mL油酸和14mL 1-十八烯(油酸:1-十八烯＝3:7)的250mL三口圆底烧瓶中；在氩气保护条件下，磁力搅拌并加热至160℃，保持40min形成透明溶液后，自然冷却至室温；随后，将溶解有50mg氢氧化钠(1.25mmol)和74.1mg氟化铵(2mmol)的10mL甲醇混合液逐滴滴加到上述烧瓶中，形成白色悬浊液，然后在封闭条件下，加热至45℃并保持半小时；然后，打开装置，加热至70℃持续搅拌50min以挥发混合液中的甲醇；接着，将混合液在氩气流下加热至100℃，停留10min排除装置中多余的甲醇及空气，继续升温(20℃/min)至300℃，反应1.5h后，关闭加热；待自然冷却至室温后，用乙醇和环己烷(2:1)混合溶液对反应产物进行清洗2-3次，60℃下真空干燥得到油溶性上转换纳米颗粒。称取50mg油溶性上转换材料加入1.5mL盐酸溶液，超声处理15min；用去离子水离心清洗后，转移到100mL圆底烧瓶中，然后将30mL乙醇溶液、10mL去离子水与2.5mL的氨水(氨水溶液质量分数为25％)依次加入上转换纳米颗粒溶液中，在65℃水浴中，磁力搅拌反应8min；接着65℃条件下逐滴加入45μL正硅酸四乙脂，搅拌反应7h；逐滴加入400μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌反应3h，冷却至室温；最后用乙醇和水的混合液(1：1)对反应产物清洗，真空干燥，得到水溶性上转换纳米材料。

步骤二，水溶性上转换纳米材料同时连接适配体互补链和辣根过氧化物酶：称取10mg水溶性上转换纳米材料分散于5mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.4,10mM)和1.25mL的戊二醛溶液(戊二醛溶液质量分数为25％)于25℃恒温摇床培养箱活化氨基2h，反应结束后离心清洗三次；将表面活化的水溶性上转换纳米材料重新分散于5mL磷酸盐缓冲液中，加入60μL 100μM的适配体互补链，37℃缓慢振荡10min，然后再加入1mL的辣根过氧化物酶(5mg/mL),4℃缓慢搅拌反应7.5h；孵育结束后用磷酸盐缓冲液清洗三次后重新分散在5mL磷酸盐缓冲液中，得到2mg/mL同时覆载适配体互补链和辣根过氧化物酶的上转换纳米颗粒。

步骤三，磁性纳米材料的制备：确称取3.5g 1,6-己二胺、1g无水醋酸钠和0.5g六水合三氯化铁于100mL单口圆底烧瓶中，再加入15mL乙二醇；然后，将烧瓶放置在50℃水浴锅中，磁力搅拌30min，得到均匀分散的酒红色溶液；接着，将其转移至50mL聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，并置于200℃的烘箱中高温反应6h；冷却至室温后，使用磁铁分离出反应液中的磁性纳米材料，分离后的黑色固体用超纯水和乙醇清洗三次，真空干燥，得到氨基功能化磁性纳米颗粒。

步骤四，磁性纳米材料的修饰：称取10mg磁性纳米材料分散于5mL磷酸盐缓冲液(pH 7.4,10mM)和1.25mL戊二醛溶液(戊二醛溶液质量分数为25％)于25℃恒温摇床培养箱活化氨基2h，离心清洗后；将表面活化的氨基功能化磁性纳米材料重新分散于5mL磷酸盐缓冲液中，加入60μL 100μM的适配体，37℃搅拌反应2.5h；孵育结束后用磷酸盐缓冲液清洗三次后重新分散在5mL磷酸盐缓冲液中，得到2mg/mL适配体修饰的磁性纳米颗粒。

步骤五，特异性检测体系的构建：将步骤二得到的适配体互补链和辣根过氧化物酶的上转换纳米颗粒配制成2mg/mL溶液，作为显色探针溶液；将步骤四得到的适配体修饰的磁性纳米颗粒配置成浓度为2mg/mL溶液，作为捕捉探针溶液；将显色探针溶液与捕捉探针溶液等体积混合，得到特异性检测体系。

为了显色探针溶液全部与捕捉探针溶液结合，显色探针溶液与捕捉探针溶液的体积比例是通过检测信号优化确定的。具体为，配制2mg/mL的显色探针溶液和捕捉探针溶液，将0.1mL显色探针溶液与0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.11mL不同体积的捕捉探针溶液混合；反应30min后，采集混合体系磁分离后的上清液荧光光谱。当磁性纳米材料的体积为0.09mL时混合体系的上清液荧光最低。因此，0.09mL为最佳磁性纳米材料添加量，将2mg/mL显色探针溶液与2mg/mL的捕捉探针溶液按10:9比例混合，得到的特异性检测体系，对金黄色葡萄球菌检测具有高的特异性和灵敏性。

检测体系的时间优化。将2mg/mL显色探针溶液与2mg/mL的捕捉探针溶液按10:9比例混合，混合反应0、5、10、15、20、30min后，采集磁分离后的上清液荧光强度。结果表明，随着时间不断增加，混合溶液在655nm的荧光强度不断下降，而当时间达到25min以后，混合溶液在655nm的荧光强度趋于稳定。因此，最佳结合时间为25min。

步骤六，金黄色葡萄球菌检测标准曲线的建立：分别将不同浓度的金黄色葡萄球菌溶液加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值Y1和吸光度信号特征值Y2，建立金黄色葡萄球菌浓度c与荧光强度信号特征值Y1和吸光度信号特征值Y2的关系，即得到金黄色葡萄球菌检测标准曲线；具体为，不同金黄色葡萄球菌浓度下特异性检测体系的荧光信号和吸光度信号，随着金黄色葡萄球菌浓度的增加，655nm的上转换荧光强度和670nm处的吸光度值不断上升。荧光强度信号特征值Y1与金黄色葡萄球菌浓度关系的标准曲线图。金黄色葡萄球菌浓度对数在56-5.6×10⁶CFU/mL范围内与荧光强度信号特征值Y1呈现出良好的线性关系，其线性关系为Y1＝997.51logc+770.86，决定系数R²＝0.9904，检测限LOD为22CFU/mL；吸光度信号特征值Y2与金黄色葡萄球菌浓度关系的标准曲线图。金黄色葡萄球菌浓度对数在56-5.6×10⁶CFU/mL范围内与吸光度信号特征值Y2呈现出良好的线性关系，其线性关系为Y2＝0.1592logc+0.4387，决定系数R²＝0.9936，检测限LOD为20CFU/mL。

步骤七，牛肉样品中金黄色葡萄球菌的检测：将25g新鲜的牛肉样品用无菌生理盐水清洗数次，然后将其置于生物安全柜中，使用30W的紫外灯辐照灭菌15min以消除样品本身可能潜在的致病菌干扰；接着将1mL浓度为1×10⁵CFU/mL的金黄色葡萄球菌加入到牛肉样品中，孵育10min以模仿金黄色葡萄球菌在样品中自然生长状态；接着，将上述加标后的样品加入到100mL的无菌生理盐水中，均质3min，利用上述构建的双信号检测体系进行检测；最后，通过所构建的金黄色葡萄球菌检测标准曲线，计算出牛肉样品的金黄色葡萄球菌含量分别为0.92×10⁵CFU/mL和0.95×10⁵CFU/mL。

实施例3牛奶中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法，具体步骤为：

步骤一，水溶性上转换纳米材料的制备：准确称取0.1183g六水氯化钇、0.0388g六水氯化镱以及0.0038g六水氯化铒，用10mL甲醇超声溶解10min，并将其转移至装有6mL油酸和20mL 1-十八烯(油酸:1-十八烯＝3:10)的250mL三口圆底烧瓶中；在氩气保护条件下，磁力搅拌并加热至160℃，保持40min形成透明溶液后，自然冷却至室温；随后，将溶解有50mg氢氧化钠(1.25mmol)和75mg氟化铵(2mmol)的10mL甲醇混合液逐滴滴加到上述烧瓶中，形成白色悬浊液，然后在封闭条件下，加热至45℃并保持半小时；然后，打开装置，加热至70℃持续搅拌50min以挥发混合液中的甲醇；接着，将混合液在氩气流下加热至100℃，停留10min排除装置中多余的甲醇及空气，继续升温(20℃/min)至300℃，反应1.5h后，关闭加热；待自然冷却至室温后，用乙醇和环己烷(2:1)混合溶液对反应产物进行清洗2-3次，60℃下真空干燥得到油溶性上转换纳米颗粒。称取50mg油溶性上转换材料加入1.5mL盐酸溶液，超声处理15min；用去离子水离心清洗后，转移到100mL圆底烧瓶中，然后将30mL乙醇溶液、10mL去离子水与3mL的氨水(氨水溶液质量分数为25％)依次加入上转换纳米颗粒溶液中，在65℃水浴中，磁力搅拌反应5-10min；接着65℃条件下逐滴加入50μL正硅酸四乙脂，搅拌反应7h；逐滴加入500μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌反应3h，冷却至室温；最后用乙醇和水的混合液(1：1)对反应产物清洗，真空干燥，得到水溶性上转换纳米材料。

步骤二，水溶性上转换纳米材料同时连接适配体互补链和辣根过氧化物酶：称取15mg水溶性上转换纳米材料分散于5mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.4,10mM)和1.25mL的戊二醛溶液(戊二醛溶液质量分数为25％)于25℃恒温摇床培养箱活化氨基2.5h，反应结束后离心清洗三次；将表面活化的水溶性上转换纳米材料重新分散于5mL磷酸盐缓冲液中，加入80μL100μM的适配体互补链，37℃缓慢振荡10min，然后再加入1mL的辣根过氧化物酶(8mg/mL),4℃缓慢搅拌反应8h；孵育结束后用磷酸盐缓冲液清洗三次后重新分散在5mL磷酸盐缓冲液中，得到2mg/mL同时覆载适配体互补链和辣根过氧化物酶的上转换纳米颗粒。

步骤三，磁性纳米材料的制备：确称取3.5g 1,6-己二胺、1g无水醋酸钠和0.5g六水合三氯化铁于100mL单口圆底烧瓶中，再加入15mL乙二醇；然后，将烧瓶放置在50℃水浴锅中，磁力搅拌30min，得到均匀分散的酒红色溶液；接着，将其转移至50mL聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，并置于200℃的烘箱中高温反应6.5h；冷却至室温后，使用磁铁分离出反应液中的磁性纳米材料，分离后的黑色固体用超纯水和乙醇清洗三次，真空干燥，得到氨基功能化磁性纳米颗粒。

步骤四，磁性纳米材料的修饰：称取10mg磁性纳米材料分散于5mL磷酸盐缓冲液(pH 7.4,10mM)和1.25mL戊二醛溶液(戊二醛溶液质量分数为25％)于25℃恒温摇床培养箱活化氨基2.5h，离心清洗后；将表面活化的氨基功能化磁性纳米材料重新分散于5mL磷酸盐缓冲液中，加入60μL 100μM的适配体，37℃搅拌反应3h；孵育结束后用磷酸盐缓冲液清洗三次后重新分散在5mL磷酸盐缓冲液中，得到2mg/mL适配体修饰的磁性纳米颗粒。

步骤五，特异性检测体系的构建：将步骤二得到的适配体互补链和辣根过氧化物酶的上转换纳米颗粒配制成2mg/mL溶液，作为显色探针溶液；将步骤四得到的适配体修饰的磁性纳米颗粒配置成浓度为2mg/mL溶液，作为捕捉探针溶液；将显色探针溶液与捕捉探针溶液等体积混合，得到特异性检测体系。

为了显色探针溶液全部与捕捉探针溶液结合，显色探针溶液与捕捉探针溶液的体积比例是通过检测信号优化确定的。具体为，配制2mg/mL的显色探针溶液和捕捉探针溶液，将0.1mL显色探针溶液与0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.11mL不同体积的捕捉探针溶液混合；反应30min后，采集混合体系磁分离后的上清液荧光光谱。当磁性纳米材料的体积为0.09mL时混合体系的上清液荧光最低。因此，0.09mL为最佳磁性纳米材料添加量，将2mg/mL显色探针溶液与2mg/mL的捕捉探针溶液按10:9比例混合，得到的特异性检测体系，对金黄色葡萄球菌检测具有高的特异性和灵敏性。

检测体系的时间优化。将2mg/mL显色探针溶液与2mg/mL的捕捉探针溶液按10:9比例混合，混合反应0、5、10、15、20、30min后，采集磁分离后的上清液荧光强度。结果表明，随着时间不断增加，混合溶液在655nm的荧光强度不断下降，而当时间达到30min以后，混合溶液在655nm的荧光强度趋于稳定。因此，最佳结合时间为30min。

步骤六，金黄色葡萄球菌检测标准曲线的建立：分别将不同浓度的金黄色葡萄球菌溶液加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值Y1和吸光度信号特征值Y2，建立金黄色葡萄球菌浓度c与荧光强度信号特征值Y1和吸光度信号特征值Y2的关系，即得到金黄色葡萄球菌检测标准曲线；具体为，不同金黄色葡萄球菌浓度下特异性检测体系的荧光信号和吸光度信号，随着金黄色葡萄球菌浓度的增加，655nm的上转换荧光强度和670nm处的吸光度值不断上升。荧光强度信号特征值Y1与金黄色葡萄球菌浓度关系的标准曲线图。金黄色葡萄球菌浓度对数在56-5.6×10⁶CFU/mL范围内与荧光强度信号特征值Y1呈现出良好的线性关系，其线性关系为Y1＝997.51logc+770.86，决定系数R²＝0.9904，检测限LOD为22CFU/mL；吸光度信号特征值Y2与金黄色葡萄球菌浓度关系的标准曲线图。金黄色葡萄球菌浓度对数在56-5.6×10⁶CFU/mL范围内与吸光度信号特征值Y2呈现出良好的线性关系，其线性关系为Y2＝0.1592logc+0.4387，决定系数R2＝0.9936，检测限LOD为20CFU/mL。

步骤七，牛奶样品中金黄色葡萄球菌的检测：将25g新鲜的牛奶样品-将其置于生物安全柜中，使用30W的紫外灯辐照灭菌15min以消除样品本身可能潜在的致病菌干扰；接着将1mL浓度为1×10⁵CFU/mL的金黄色葡萄球菌加入到牛奶样品中，孵育10min以模仿金黄色葡萄球菌在样品中自然生长状态；接着，将上述加标后的样品加入到100mL的无菌生理盐水中，均质3min，利用上述构建的双信号检测体系检测；最后，通过所构建的金黄色葡萄球菌检测标准曲线，计算出牛奶样品的金黄色葡萄球菌含量分别为0.96×10⁵CFU/mL和0.97×10⁵CFU/mL。

对比例1

与实施例1不同之处在于，检测对象为1×10⁵CFU/mL大肠杆菌。

对比例2

与实施例1不同之处在于，检测对象为1×10⁵CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌。

对比例3

与实施例1不同之处在于，检测对象为1×10⁵CFU/mL枯草芽孢杆菌。

以1×10⁵CFU/mL的金黄色葡萄球菌为参照，对比例1-3的荧光信号和吸光度信号见图6。

由图6可以看出，将所构建的检测方法用于其他食源性致病菌标准液的检测时：大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌的加入不会引起体系信号值的变化，只有在体系中加入金黄色葡萄球菌溶液时体系的信号值才会有明显的变化。并且在特异性检测体系中加入食源性致病菌(金黄色葡萄球菌和其中任意一种食源性致病菌)去测试该方法的抗干扰能力，结果表明混合食源性致病菌作用下，其他食源性致病菌不会影响金黄色葡萄球菌与特异性检测体系之间的反应。由此可见，构建的检测方法对金黄色葡萄球菌具有高特异性、高选择性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttagcaaagt agcgtgcact tttgacgtag ctgtgggatg accagcgagc gctactgaga 60

acgtgccgag gaagtaccgt accattgc 88

<210> 2

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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Claims (10)

1.一种食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用金黄色葡萄球菌适配体互补链和辣根过氧化物酶对水溶性上转换纳米材料进行修饰，得到显色探针；

利用金黄色葡萄球菌适配体对氨基功能化磁性纳米颗粒进行修饰，得到适配体修饰的磁性纳米颗粒，作为捕获探针；

将所述显色探针和所述捕获探针混合孵育，得到双信号分子-磁纳米颗粒复合物体系，即为特异性检测体系。

2.根据权利要求1所述的食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法，其特征在于，所述显色探针和所述捕捉探针的体积比为10：1-11，孵育时间为5-30min。

3.根据权利要求1所述的食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法，其特征在于，所述显色探针的浓度为1-3mg/mL，所述捕捉探针的浓度为1-3mg/mL。

4.根据权利要求1所述的食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法，其特征在于，所述水溶性上转换纳米材料、金黄色葡萄球菌适配体互补链和辣根过氧化物酶的用量比为(8-15)mg:(2-8)nmol:(2-8)mg，孵育时间为7-8h。

5.根据权利要求1所述的食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法，其特征在于，所述水溶性上转换纳米材料的制备方法包括以下步骤：

步骤1：将稀土氯化物与油酸以及1-十八烯混合，磁力搅拌下加热，然后冷却，再将冷却液与含有氟化铵和氢氧化钠的甲醇溶液反应，得到油性上转换纳米材料；

步骤2：将步骤1所得油性上转换纳米材料加入盐酸溶液中，超声处理，得到游离的上转换纳米材料；

步骤3：将步骤2所得的上转换纳米材料与氨水、正硅酸四乙脂和3-氨丙基三乙氧基硅烷进行反应，得到水溶性上转换纳米材料。

6.根据权利要求5所述的食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法，其特征在于，所述油酸和1-十八烯的体积比为3:5-10；

所述氟化铵和所述氢氧化钠的质量比为70-75:50；

所述氨水、正硅酸四乙脂和3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为(1-3):(0.01-0.05):(0.1-0.5)。

7.根据权利要求5所述的食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法，其特征在于，还包括以下步骤：

制备不同浓度金黄色葡萄球菌的标准液，并加入特异性检测体系中，经过孵育后，通过磁分离得到上层清液；然后测定特异性检测体系的上转换荧光强度和紫外吸光度两种信号，建立金黄色葡萄球菌双信号检测标准曲线；

制备待测样品的检测体系，并加入所述特异性检测体系中，测定所述特异性检测体系的荧光强度和吸光度，利用所述标准曲线求出待测样品中的金黄色葡萄球菌浓度。

8.根据权利要求7所述的食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌的标准液和所述特异性检测体系的孵育时间为0.5-1h。

9.根据权利要求1-8任一项所述的食品中金黄色葡萄球菌的双信号检测方法在检测食品中金黄色葡萄球菌中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述食品包括鲜肉和牛奶。

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