CN105319190A - 基于上转换荧光标记和磁分离技术的氯霉素检测新方法 - Google Patents

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Abstract

基于上转换荧光标记和磁分离技术的氯霉素检测新方法。包括如下步骤：溶剂热法制备上转换纳米材料，采用反相微乳法对其进行氨基修饰，与氨基修饰的氯霉素适配子互补链偶联得到荧光信号探针。合成氨基化的磁性纳米材料，亲和素修饰后与生物素修饰的氯霉素适配子偶联得到捕获探针。两段互补链的杂交互补配对原则，两个探针形成一个可以用来检测氯霉素的纳米复合物。加入不同浓度的氯霉素后，氯霉素竞争性地与适配子结合，导致部分上转换纳米材料标记的互补链解离，在优化的实验条件下，氯霉素浓度和荧光强度分别在0.01-1ng/mL和1-10ng/mL范围内呈良好的线性关系，最低检测限可以达到0.01ng/mL。对牛奶的加标回收实验中，回收率在93.67%-101.41%范围内。

Description

基于上转换荧光标记和磁分离技术的氯霉素检测新方法
技术领域
本发明涉及一种上转换荧光标记和磁分离技术的氯霉素检测新方法。
背景技术
氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一种酰胺醇类光谱抗生素，曾广泛用于人体和各种动物疾病的预防和治疗，但被证实在动物性食品中的残留会给人类带来很大的毒副作用，导致视神经炎，视力障碍，胃肠道不适，也会抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血症和粒状白细胞缺乏等疾病，现已禁止了氯霉素的使用。但是由于氯霉素具有良好的抗菌效果且价格低廉，如今在动物性食品中仍有氯霉素的非法添加。目前对氯霉素的检测主要有40微生物学方法，气相色谱法，免疫层析法，电化学法等[3-8]，但这些方法各有其优缺点，部分存在高耗费、操作复杂、耗时、稳定性不足等问题。因此寻找一种更加简便、稳定、灵敏度高的检测方法就显得十分必要。
上转换荧光纳米材料是一种可通过多光子机制吸收长波辐射发射出比激发光波长短的荧光的反stoke移位现象的纳米颗粒，即这种材料颗粒可通过红外激发发射出可见光。常见的荧光染料，如有机染料，量子点通过短波长光激发可能会破坏生物组织导致自体荧光，降低检测的灵敏性。上转换材料由于自身的特殊机理，有着显著优点：光学稳定，斯托克斯移位大，无自体荧光。而磁性纳米粒子可利用功能化的表面给体与受体间特异性结合，实现对目标物质的快速分离和富集，两者连用可提高检测的灵敏性。
发明内容
本发明就是针对上述问题，弥补现有技术的不足，提供了一种上转换材料的优良性能，将其作为可供检测的荧光标记物，结合适配子对目标物的特异性识别，构建了一种简便、稳定、高灵敏的氯霉素检测新方法。
为实现上述目的，本发明的检测方法概述如下。
一种上转换荧光标记和磁分离技术的氯霉素检测新方法，包括如下步骤：
（1）一步法制备氨基修饰的纳米材料Fe3O4：分别向圆底烧瓶中加入6.5g1,6-己二胺，30mL乙二醇，1.0g六水合三氯化铁和2.0g无水醋酸钠，在油浴锅中50℃加热条件下搅拌形成均匀的胶体溶液。
（2）将所得溶液转移到100mL带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，198℃条件下反应6h。反应结束后让反应釜自然冷却至室温，弃釜内上层液体，底部的黑色固体用去离子水冲洗至烧杯中，超声分散，然后磁分离收集。按照这个方式水洗2次，乙醇洗2次，所得黑色固体在50℃条件下干燥。得到的即为氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒固体粉末，储存备用。
（3）分别将Y(NO3)3·6H2O，Yb(NO3)3·6H2O，Er(NO3)3·6H2O配置成0.5M，0.2M，0.2M的浓度保存备用。
（4）称取1.2gNaOH溶于9mL水中，然后加入10mL乙醇，20mL油酸，搅拌形成均质透明溶液，在磁力搅拌下向体系中面加入摩尔总量为0.6mmol的稀土元素（摩尔比Y:Yb:Er=78:20:2），随后向体系中逐滴加入NaF溶液（1.0M，4mL），搅拌约15min，转移到50mL容量带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，180℃的烘箱中反应8h。
（5）称量1.6g表面活性剂CO-520溶于20mL环己烷，搅拌一段时间后在磁力搅拌下加入已溶于环己烷（2mL）中的上装换纳米材料，继续搅拌形成透明的反相微乳体系。然后向体系中加入200μL的100NH3·H2O，搅拌一段时间后加入100μL的TEOS，20μL的APTES，在室温下搅拌24h。
（6）将5mg的磁珠分散于5mL的10mMPBS中，超声分散，然后加入1.25mL25%的戊二醛溶液，将混合溶液在室温下孵育缓慢振荡2h。磁分离得到的磁性纳米材料用PBS清洗三次。
（7）再取1mL（1.0mg/mL的纳米材料）向里面加入100μL亲和素（1.0mg/mL），在室温下孵育缓慢振动12h。
（8）称取10mg上转换纳米材料分散于5mL10mM的PBS（pH7.4）中，超声15min让其充分分散，然后加入1.25mL25%的戊二醛溶液，将混合溶液在室温下摇床中孵育缓慢振荡2h。通过离心分离得到上转换纳米材料，用10mMPBS清洗三次。将得到的纳米材料重置于5mL10mMPBS中，取1mL（2.0mg/mL的纳米材料）加入30μL氨基修饰的氯霉素适配子互补链（10μM），在室温下孵育缓慢振动12h。反应结束之后离心，收集上清溶液，得到的固体用10mMPBS清洗，然后将偶联好的材料溶于1mL的STE缓冲液中，4℃条件下保存备用。
本发明的有益效果：本发明采用溶剂热法制备上转换纳米材料，采用反相微乳法对其进行氨基修饰，与氨基修饰的氯霉素适配子互补链偶联得到荧光信号探针。合成氨基化的磁性纳米材料，亲和素修饰后与生物素修饰的氯霉素适配子偶联得到捕获探针。
基于两段互补链的杂交互补配对原则，两个探针形成一个可以用来检测氯霉素的纳米复合物。加入不同浓度的氯霉素后，氯霉素竞争性地与适配子结合，导致部分上转换纳米材料标记的互补链解离，通过外加磁场分离得到的复合物的荧光强度也相应的发生变化。
在优化的实验条件下，氯霉素浓度和荧光强度分别在0.01-1ng/mL和1-10ng/mL范围内呈良好的线性关系，最低检测限可以达到0.01ng/mL。对牛奶的加标回收实验中，回收率在93.67%-101.41%范围内。
附图说明
图1是实施例1的上转换纳米颗粒红外光谱图（a）及氨基化修饰的二氧化硅包裹上转换纳米颗粒红外光谱图（b）。
具体实施方式
实施例1
一种上转换荧光标记和磁分离技术的氯霉素检测新方法，包括如下步骤：
（1）一步法制备氨基修饰的纳米材料Fe3O4：分别向圆底烧瓶中加入6.5g1,6-己二胺，30mL乙二醇，1.0g六水合三氯化铁和2.0g无水醋酸钠，在油浴锅中50℃加热条件下搅拌形成均匀的胶体溶液。
（2）将所得溶液转移到100mL带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，198℃条件下反应6h。反应结束后让反应釜自然冷却至室温，弃釜内上层液体，底部的黑色固体用去离子水冲洗至烧杯中，超声分散，然后磁分离收集。按照这个方式水洗2次，乙醇洗2次，所得黑色固体在50℃条件下干燥。得到的即为氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒固体粉末，储存备用。
（3）分别将Y(NO3)3·6H2O，Yb(NO3)3·6H2O，Er(NO3)3·6H2O配置成0.5M，0.2M，0.2M的浓度保存备用。
（4）称取1.2gNaOH溶于9mL水中，然后加入10mL乙醇，20mL油酸，搅拌形成均质透明溶液，在磁力搅拌下向体系中面加入摩尔总量为0.6mmol的稀土元素（摩尔比Y:Yb:Er=78:20:2），随后向体系中逐滴加入NaF溶液（1.0M，4mL），搅拌约15min，转移到50mL容量带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，180℃的烘箱中反应8h。
（5）称量1.6g表面活性剂CO-520溶于20mL环己烷，搅拌一段时间后在磁力搅拌下加入已溶于环己烷（2mL）中的上装换纳米材料，继续搅拌形成透明的反相微乳体系。然后向体系中加入200μL的100NH3·H2O，搅拌一段时间后加入100μL的TEOS，20μL的APTES，在室温下搅拌24h。
（6）将5mg的磁珠分散于5mL的10mMPBS中，超声分散，然后加入1.25mL25%的戊二醛溶液，将混合溶液在室温下孵育缓慢振荡2h。磁分离得到的磁性纳米材料用PBS清洗三次。
（7）再取1mL（1.0mg/mL的纳米材料）向里面加入100μL亲和素（1.0mg/mL），在室温下孵育缓慢振动12h。
（8）称取10mg上转换纳米材料分散于5mL10mM的PBS（pH7.4）中，超声15min让其充分分散，然后加入1.25mL25%的戊二醛溶液，将混合溶液在室温下摇床中孵育缓慢振荡2h。通过离心分离得到上转换纳米材料，用10mMPBS清洗三次。将得到的纳米材料重置于5mL10mMPBS中，取1mL（2.0mg/mL的纳米材料）加入30μL氨基修饰的氯霉素适配子互补链（10μM），在室温下孵育缓慢振动12h。反应结束之后离心，收集上清溶液，得到的固体用10mMPBS清洗，然后将偶联好的材料溶于1mL的STE缓冲液中，4℃条件下保存备用。

Claims (1)

1.基于上转换荧光标记和磁分离技术的氯霉素检测新方法，其特征在于包括如下步骤：
一步法制备氨基修饰的纳米材料Fe3O4：分别向圆底烧瓶中加入6.5g1,6-己二胺，30mL乙二醇，1.0g六水合三氯化铁和2.0g无水醋酸钠，在油浴锅中50℃加热条件下搅拌形成均匀的胶体溶液；
将所得溶液转移到100mL带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，198℃条件下反应6h；
反应结束后让反应釜自然冷却至室温，弃釜内上层液体，底部的黑色固体用去离子水冲洗至烧杯中，超声分散，然后磁分离收集；
按照这个方式水洗2次，乙醇洗2次，所得黑色固体在50℃条件下干燥；
得到的即为氨基化Fe3O4磁性纳米颗粒固体粉末，储存备用；
分别将Y(NO3)3·6H2O，Yb(NO3)3·6H2O，Er(NO3)3·6H2O配置成0.5M，0.2M，0.2M的浓度保存备用；
称取1.2gNaOH溶于9mL水中，然后加入10mL乙醇，20mL油酸，搅拌形成均质透明溶液，在磁力搅拌下向体系中面加入摩尔总量为0.6mmol的稀土元素（摩尔比Y:Yb:Er=78:20:2），随后向体系中逐滴加入NaF溶液（1.0M，4mL），搅拌约15min，转移到50mL容量带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，180℃的烘箱中反应8h；
称量1.6g表面活性剂CO-520溶于20mL环己烷，搅拌一段时间后在磁力搅拌下加入已溶于环己烷（2mL）中的上装换纳米材料，继续搅拌形成透明的反相微乳体系；
然后向体系中加入200μL的100NH3·H2O，搅拌一段时间后加入100μL的TEOS，20μL的APTES，在室温下搅拌24h；
将5mg的磁珠分散于5mL的10mMPBS中，超声分散，然后加入1.25mL25%的戊二醛溶液，将混合溶液在室温下孵育缓慢振荡2h；
磁分离得到的磁性纳米材料用PBS清洗三次；
再取1mL（1.0mg/mL的纳米材料）向里面加入100μL亲和素（1.0mg/mL），在室温下孵育缓慢振动12h；
称取10mg上转换纳米材料分散于5mL10mM的PBS（pH7.4）中，超声15min让其充分分散，然后加入1.25mL25%的戊二醛溶液，将混合溶液在室温下摇床中孵育缓慢振荡2h；
通过离心分离得到上转换纳米材料，用10mMPBS清洗三次；
将得到的纳米材料重置于5mL10mMPBS中，取1mL（2.0mg/mL的纳米材料）加入30μL氨基修饰的氯霉素适配子互补链（10μM），在室温下孵育缓慢振动12h；
反应结束之后离心，收集上清溶液，得到的固体用10mMPBS清洗，然后将偶联好的材料溶于1mL的STE缓冲液中，4℃条件下保存备用。
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