CN110286224A - 一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法 - Google Patents

一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于上转换‑金纳米‑磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，属于食品安全检测技术领域；首先制备得到上转换纳米材料；加入乙醇、氨水、正硅酸四乙酯、3‑氨丙基三乙氧基硅烷，得到氨基功能化上转换纳米材料，再制备适配体功能化上转换纳米材料；通过适配体互补链连接金纳米材料和磁性纳米材料，得到金纳米‑磁性纳米材料溶液，与适配体功能化上转换纳米材料溶液混合，得到特异性检测体系，加入铅离子溶液后测定荧光强度信号特征值，作为纵坐标，以铅离子浓度为横坐标建立铅含量检测标准曲线，实现待测茶叶中铅含量的测定；本发明通过构建稳态特异性铅离子荧光检测体系，实现茶叶中铅的高灵敏、特异性检测，具有较宽的线性检测范围和较低的检测限，应用前景好。

Description

一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含 量检测方法
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法。
背景技术
我国是产茶大国，茶叶是我国的传统出口农产品，加强对茶叶质量安全的控制是保障饮茶安全的重要举措，也有利于提高茶产品的国际市场竞争力。随着现代工业飞速发展，水体、空气、土壤都受到了不同程度的重金属污染。茶树在生长发育过程中能够吸收土壤中的重金属，从而导致茶叶中的重金属含量超标，如镉、汞、铅等重金属。铅及其化合物都是剧毒物质，人接触、口服或者吸入都可以导致肝和脑损伤，破坏人的中枢神经系统。长期饮用铅含量超标的茶叶会导致中毒，我国国家标准GB 2762-2017中规定，茶叶中的铅含量不能超过5mg/kg。传统检测方法，如原子吸收光谱法，仪器设备昂贵、检测成本高、步骤繁琐，不能满足铅含量的实时快速检测要求。本发明提出了一种快速准确的铅含量检测方法，克服传统方法的不足，提高铅离子检测的灵敏度和准确性。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，本发明旨在解决所述问题之一，提供了一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，具体通过纳米可控自组装制备上转换纳米材料、磁性纳米材料、金纳米材料，通过适配体构建基于上转换-磁性纳米-金纳米的稳态特异性铅离子检测体系，消除背景荧光、其他离子干扰及茶汤色泽的影响，实现茶叶中铅的低成本、高灵敏和特异性检测。
为了实现以上目的，本发明的具体步骤如下：
步骤一，上转换纳米材料的制备：将六水氯化钇、六水氯化镱、六水氯化钬以及六水氯化钆加入到甲醇A中超声溶解，转移到油酸和1-十八烯的混合溶液中；在氩气保护条件下，第一次加热搅拌反应，冷却至室温，得到冷却液；将氟化铵、氢氧化钠和甲醇B混合后，加入冷却液中，水浴反应两次，使甲醇完全挥发；在氩气保护条件下，第二次加热搅拌反应，冷却至室温，得到反应产物；用乙醇和二氯甲烷的混合液对反应产物清洗，真空干燥得到上转换纳米材料；
步骤二，上转换纳米材料的修饰：将步骤一得到的上转换纳米材料加入到乙醇中，超声分散，水浴反应得到混合液，加入去离子水与氨水，进行第一次搅拌反应；加入正硅酸四乙脂，进行第二次搅拌反应；加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，进行第三次搅拌反应，冷却至室温，得到反应产物；用乙醇和去离子水的混合液对反应产物清洗，真空干燥，得到氨基功能化上转换纳米材料；
步骤三，适配体功能化上转换纳米材料的制备：取步骤二得到的氨基化上转换纳米材料，超声分散于磷酸缓冲盐溶液A中；加入戊二醛溶液，在室温下第一次反应后，用磷酸缓冲盐溶液清洗，再分散于磷酸缓冲盐溶液B中；加入适配体溶液，在室温下第二次反应后，用磷酸缓冲盐溶液清洗，再分散于磷酸缓冲盐溶液C中，得到适配体功能化上转换纳米材料溶液；
步骤四，金纳米的制备：将四氯金酸溶液和去离子水混合，在一定温度条件下进行第一次反应；然后加入柠檬酸三钠溶液，进行第二次反应，冷却至室温，得到金纳米溶液；
步骤五，磁性纳米材料的制备：将六水三氯化铁、1,6-已二胺、无水醋酸钠、乙二醇混合，得到混合溶液；在一定温度条件下进行水浴反应，待混合溶液清澈透明，转移到聚四氟乙烯内衬中，然后放置反应釜中并在烘箱中反应，冷却至室温，利用磁铁分离磁性纳米材料，用去离子水清洗，真空干燥后得到磁性纳米材料；
步骤六，亲和素修饰的磁性纳米材料：将步骤五得到的磁性纳米材料超声分散在磷酸缓冲盐溶液D中，加入戊二醛溶液进行反应，反应后用磷酸缓冲盐溶液进行第一次清洗，加入亲和素溶液进行反应，反应后用磷酸缓冲盐溶液进行第二次清洗，真空干燥后得到亲和素修饰的磁性纳米材料；
步骤七，金纳米-磁性纳米材料的制备：将步骤六得到的亲和素修饰的磁性纳米材料分散到磷酸缓冲盐溶液E中，与生物素修饰的适配体互补链溶液进行第一次反应，然后加入步骤四得到的金纳米溶液进行第二次反应，通过磁铁分离得到金纳米-磁性纳米材料，再次分散到磷酸缓冲盐溶液F中，得到金纳米-磁性纳米材料溶液；
步骤八，特异性检测体系的构建：将步骤三得到的适配体功能化上转换纳米材料溶液和步骤七得到的金纳米-磁性纳米材料溶液分别用磷酸缓冲盐溶液稀释，得到稀释液后，再混合孵育，得到上转换-金纳米-磁性纳米材料，采用磁体分离，并重新分散到磷酸缓冲盐溶液G中，得到特异性检测体系；
步骤九，铅含量检测标准曲线的建立：分别将不同浓度的铅离子溶液加入到步骤八得到的特异性检测体系中反应，得到检测溶液，测定检测溶液的荧光强度信号特征值，以铅离子浓度为横坐标，荧光强度信号特征值为纵坐标，建立铅含量检测标准曲线；
步骤十，茶叶中铅含量的检测：将茶叶样本粉粹过筛，得到茶粉；然后将茶粉和浓硝酸混合进行微波消解，室温冷却；得到消解液，采用油浴使消解液中酸完全挥发，过滤，调节消解液pH，加入到步骤八得到的特异性检测体系中，得到检测溶液，测定检测溶液的荧光强度信号特征值，通过步骤九所构建的铅含量检测标准曲线，计算出茶叶样本中铅含量。
优选的，步骤一中，所述六水氯化钇、六水氯化镱、六水氯化钬、六水氯化钆、甲醇A的用量比为0.087g：0.047g：0.005g：0.066g：3mL；所述超声溶解的时间为5-10min；所述第一次加热搅拌反应，温度为150-170℃，时间为30min；所述第二次加热搅拌反应，温度为290-310℃，时间为1h；所述甲醇A、油酸和1-十八烯的体积比为3：4.5：10.5；
所述甲醇A、氟化铵、氢氧化钠、甲醇B的用量比为3mL：0.221g：0.45g：15mL；所述乙醇和二氯甲烷混合液，乙醇和二氯甲烷的体积比为1：2；所述水浴反应两次，第一次为45-55℃水浴反应30min，第二次为75-85℃水浴反应40min。
优选的，步骤二中，所述上转换纳米材料、乙醇、去离子水、氨水、正硅酸四乙脂和3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为10mg：6mL：2mL：0.25mL：4-8μL：8-12μL；所述氨水的质量浓度为25％；所述超声分散的时间为20-30min；
所述第一次搅拌反应，温度为35℃，时间为5-10min；所述第二次搅拌反应，温度为65℃，时间为8-10h；所述第三次搅拌反应，温度为65℃，时间为2-4h；所述乙醇和去离子水混合液中乙醇和去离子水的体积比为1：1。
优选的，步骤三中，所述氨基化上转换纳米材料、戊二醛、适配体溶液、磷酸缓冲盐溶液A的用量比为10mg：1.25mL：0.5mL：5mL；所述磷酸缓冲盐溶液A、磷酸缓冲盐溶液B和磷酸缓冲盐溶液C的用量比为1:1:1；所述戊二醛的质量浓度为25％；
所述适配体溶液浓度为200mM，溶剂为磷酸缓冲盐溶液，所述适配体链为5’-NH2-TGA GTG ATA AAG CTG GCC GAG CCT CTT CTC TAC-3’；所述第一次反应的时间为2-3h，所述第二次反应的时间为10-12h。
优选的，步骤四中，所述四氯金酸溶液的质量浓度为1％；所述柠檬酸三钠溶液的质量浓度为1％；所述四氯金酸溶液、去离子水、柠檬酸三钠溶液的用量比为5mL：95mL：10mL；所述第一次反应和第二次反应的温度为90-110℃，时间为8-12min。
优选的，步骤五中，所述六水三氯化铁、1,6-已二胺、无水醋酸钠、乙二醇的用量比为1.5g：9.7g：3g：45mL，所述水浴反应的温度为40-60℃；所述烘箱中反应的温度为195-205℃，反应时间为5-7h。
优选的，步骤六中，所述磁性纳米材料、磷酸缓冲盐溶液D、戊二醛溶液、亲和素溶液的用量比为10mg：5mL：1.25mL：2mL，所述超声分散的时间为20min；所述戊二醛溶液的质量浓度为25％；所述与戊二醛溶液反应的时间为2h；所述亲和素溶液，浓度为0.5mg/mL；所述加入亲和素溶液反应的时间为12h。
优选的，步骤七中，所述亲和素修饰的磁性纳米材料、磷酸缓冲盐溶液D、生物素修饰的适配体互补链、金纳米溶液的用量比为10mg：5mL：0.5mL：1mL；
所述生物素修饰的适配体互补链溶液浓度为200mM，所述生物素修饰的适配体互补链为5’-Biotin-CGA TCA CTA ACT ATr AGG AAG AGA TG-SH-3’；
所述第一次反应，时间为3h；所述第二次反应，时间为1h。
优选的，步骤八中，所述适配体功能化上转换纳米材料溶液稀释后的浓度为1.0mg/mL，所述金纳米-磁性纳米材料溶液稀释后的浓度为1.0mg/mL，所述适配体功能化上转换纳米材料溶液稀释液、金纳米-磁性纳米材料溶液的稀释液混合孵育时两者的体积比为1：1，所述孵育的时间为10min。
优选的，步骤九中，所述铅离子溶液的浓度范围25-1400nM，pH＝7.4；所述铅离子溶液与特异性检测体系的体积比为1：1；所述反应的时间为4min；所述测定检测溶液的荧光强度信号特征值为980nm激发光激发下547nm处的荧光强度值，记为I547。
优选的，步骤十中，所述筛网的目数为40目；所述茶粉和浓硝酸的用量比为1g：15mL；所述调节消解液pH是使用磷酸缓冲盐溶液调节为7.4；所述消解液和特异性检测体系的体积比为1：1。
本发明所使用的甲醇A、甲醇B均为甲醇，字母A、B仅为名称上的区别；磷酸缓冲盐溶液A、磷酸缓冲盐溶液B、磷酸缓冲盐溶液C、磷酸缓冲盐溶液D、磷酸缓冲盐溶液E、磷酸缓冲盐溶液F、磷酸缓冲盐溶液G均为磷酸缓冲盐溶液(pH＝7.4)，字母A、B、C、D、E、F、G仅为名称上的区别。
与现有检测技术相比，本发明的有益效果如下：
1.本发明公开一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，通过纳米可控自组装制备上转换纳米材料、金纳米材料、磁性纳米材料，通过适配体构建基于上转换-金纳米-磁性纳米的稳态特异性铅离子检测体系，消除背景荧光、其他离子干扰及茶汤色泽的影响，实现茶叶中铅的低成本、高灵敏和特异性检测。
2.本发明构建的特异性混合检测体系，具体优化设计的上转换-金纳米-磁性纳米检测体系，对铅离子具有强的荧光响应性，可有效消除背景荧光及其他离子的干扰，对铅离子的检测具有特异性。
3.本发明建立的铅离子浓度与荧光强度信号特征值的线性浓度范围为在25-1400nM，具有较宽的线性检测范围，检测限LOD为5.70nM，可以满足茶叶中铅含量的快速、高灵敏检测，具有很好的通用性，比传统方法的检测精度和灵敏度高。
附图说明
图1为实例1制备的氨基功能化上转换纳米材料的透射电镜图。
图2为实例1制备的金纳米材料的透射电镜图。
图3为实例1制备的磁性纳米材料的透射电镜图。
图4为实例1中不同铅离子浓度下检测溶液的荧光光谱。
图5为实例1中铅含量检测标准曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
实施例1：
本发明公开一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，具体步骤为：
步骤一，上转换纳米材料的制备：准确称取0.087g六水氯化钇、0.047g六水氯化镱、0.005g六水氯化钬以及0.066g六水氯化钆，用3mL甲醇超声溶解5min，转至250mL的三口烧瓶中，加4.5mL油酸和10.5mL 1-十八烯；在氩气保护条件下，第一次加热到160℃、磁力搅拌反应30min，冷却至室温；向冷却液中逐滴加入含0.221g氟化铵和0.45g氢氧化钠的甲醇溶液15mL，然后第一水浴50℃下反应30min，第二次水浴80℃反应40min，使溶液中的甲醇完全挥发；接着，在氩气保护条件下，第二次加热到300℃、磁力搅拌反应1h，冷却至室温，得到反应产物；最后，用乙醇和二氯甲烷(体积比为1:2)混合溶液对反应产物进行清洗3次，60℃下真空干燥得到上转换纳米材料。
步骤二，上转换纳米材料的氨基化修饰：精准称取10mg步骤一得到的上转换纳米材料于100mL锥形瓶中，加入6mL乙醇，超声分散25min；然后将2mL去离子水与0.25mL 25％的氨水依次加入上转换纳米材料溶液中，在35℃水浴条件下，第一次搅拌反应8min；接着在65℃水浴条件下，逐滴加入6μL正硅酸四乙脂，第二次搅拌反应9h；逐滴加入10μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，第三次搅拌反应3h，冷却至室温，得到反应产物；最后用乙醇和水的混合液(体积比为1：1)对反应产物清洗，真空干燥，得到氨基化上转换纳米材料(图1)。
步骤三，适配体功能化上转换纳米材料的制备：首先将称取的10mg步骤二得到的氨基化上转换纳米材料，超声分散于5mL的磷酸缓冲盐溶液中(pH＝7.4)；接着，向氨基化上转换纳米材料溶液中加入1.25mL质量浓度为25％的戊二醛溶液，第一次室温反应2h，反应结束后，用磷酸缓冲盐溶液清洗3次，再分散于5mL的磷酸缓冲盐溶液中；然后，加入0.5mL的适配体(200mM)溶液，适配体链为5’-NH2-TGA GTG ATA AAG CTG GCC GAG CCT CTT CTCTAC-3’，第二次在摇床中室温反应12h。反应结束后，用磷酸缓冲盐溶液对氨基化上转换纳米材料进行清洗，再分散于5mL磷酸缓冲盐溶液中，得到适配体功能化上转换纳米材料溶液，浓度为2.0mg/mL。
步骤四，金纳米的制备：先分别配制1％质量浓度的柠檬酸三钠溶液和1％质量浓度的四氯金酸溶液，取95mL去离子水加入到装有5mL四氯金酸溶液的锥形瓶中，在磁力搅拌、100℃条件下反应10min，接着迅速加入10mL柠檬酸三钠溶液，可以发现溶液在短时间内变为蓝色，继续反应，溶液从蓝色转为酒红色，然后溶液继续反应10min，反应结束后，将溶液冷却至室温，得到金纳米溶液(图2)，放置冰箱保存备用。
步骤五，磁性纳米材料的制备：将1.5g六水三氯化铁、9.7g 1,6-已二胺和3g无水醋酸钠加入到装有45mL乙二醇的烧杯中，将混合溶液转移到50℃的水浴锅中，待混合溶液清澈透明，将溶液转移到100mL的聚四氟乙烯内衬中，随后将聚四氟乙烯内衬放置反应釜中并在200℃烘箱中反应6h，反应结束后，反应釜冷却至室温，然后利用磁铁对反应液中的Fe3O4进行分离，分离后重新分散到去离子水中，重复该操作3次，放置在60℃的真空烘箱中烘干，得到磁性纳米材料(图3)。
步骤六，亲和素修饰的磁性纳米材料：称取10mg磁性纳米材料加入到5mL磷酸缓冲盐溶液，超声分散20min后，加入1.25mL的25％戊二醛溶液反应2h，用磷酸缓冲盐溶液进行第一次清洗；然后加入2mL的0.5mg/mL亲和素溶液反应12h，用磷酸缓冲盐溶液进行第二次清洗；在60℃下真空干燥，得到亲和素修饰的磁性纳米材料。
步骤七，金纳米-磁性纳米材料的制备：将10mg亲和素修饰的磁性纳米材料分散到5mL磷酸缓冲盐溶液中，与0.5mL生物素修饰的适配体互补链(200mM)溶液进行第一次反应，时间为3h，生物素修饰的适配体互补链为5’-Biotin-CGA TCA CTA ACT ATr AGG AAG AGATG-SH-3’；然后与1mL金纳米溶液进行第二次反应，时间为1h，最后通过磁铁分离得到金纳米-磁性纳米材料，并重新分散到5mL磷酸缓冲盐溶液中，得到金纳米-磁性纳米材料溶液，浓度为2.0mg/mL。
步骤八，特异性检测体系的构建：将步骤三得到的适配体功能化上转换纳米材料溶液稀释成1.0mg/mL，将步骤七得到的金纳米-磁性纳米溶液稀释成1.0mg/mL；然后将0.2mL浓度为1.0mg/mL的适配体功能化上转换纳米材料溶液，与0.2mL浓度为1.0mg/mL的金纳米-磁性纳米材料溶液混合，孵育10min后，使用磁铁对溶液中的上转换-金纳米-磁性纳米材料进行分离，分散到0.4mL的磷酸缓冲盐溶液中，得到上转换-金纳米-磁性纳米材料溶液，即特异性检测体系。
适配体功能化上转换纳米材料溶液与金纳米-磁性纳米材料溶液浓度比例的优化分析。分别取不同浓度的0.2mL的金纳米-磁性纳米溶液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0mg/mL)加入到0.2mL适配体功能化上转换纳米材料溶液(1mg/mL)。混合反应10min后，采集金纳米-磁性纳米溶液与适配体功能化上转换混合溶液的荧光，当金纳米-磁性纳米溶液的浓度达到1.0mg/mL时，荧光猝灭效率达到最高，因此，取1.0mg/mL金纳米-磁性纳米溶液和1.0mg/mL适配体功能化上转换溶液用于构建特异性检测体系。
适配体功能化上转换纳米材料溶液与金纳米-磁性纳米材料溶液的孵育时间优化。取0.2mL金纳米-磁性纳米溶液(1.0mg/mL)加入到0.2mL的适配体修饰的适配体功能化上转换纳米材料溶液，混合后，分别在反应0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22min后测试混合溶液的荧光强度；随着孵育时间的增加，荧光强度不断降低，当反应时间到达10min后，荧光强度基本不发生变化，因此，10min为最佳孵育时间。
步骤九，铅含量检测标准曲线的建立：将0.2mL不同浓度的铅离子溶液(pH＝7.4)加入到0.2mL步骤八得到的特异性检测体系中反应4min，得到检测溶液，测定检测溶液在980nm激发光激发下547nm处的荧光值，作为检测溶液的荧光强度信号特征值Y。图4为不同铅离子浓度下检测溶液的荧光光谱，随着铅离子浓度的增加，547nm处的荧光强度也不断增加。建立铅离子浓度x与荧光强度信号特征值Y的关系，得到铅含量检测标准曲线Y＝1.212x+677.29，决定系数R2＝0.9930，检测限为5.70nM，线性范围为25-1400nM。
铅离子与上转换-磁性纳米-金纳米溶液反应时间优化，取0.2mL铅离子(1000nM)加入到0.2mL制备好的上转换-磁性纳米-金纳米溶液中，分别在反应2、4、6、8、10min测试检测溶液的荧光强度；随着反应时间的增加荧光不断地增强，当反应时间达到4min时，荧光强度基本不会随着反应时间的增加而增强，因此，4min反应时间为铅离子与上转换-磁性纳米-金纳米溶液反应的最佳时间。
步骤十，茶叶中铅含量的检测：将茶叶样本粉粹40目过筛，得到茶粉；然后取1.0g茶粉和15mL浓硝酸混合进行微波消解，在微波消解炉中120℃反应5min，加热到160℃继续反应10min，再将温度升到180℃反应10min，然后室温冷却；随后将消解液体放置150℃油浴锅中，使其溶液中的酸完全挥发，然后用过滤器对消解液进行过滤，使用磷酸盐缓冲溶液调节消解液pH＝7.4，将0.2mL消解液加入到0.2mL步骤八得到的特异性检测体系中，得到检测溶液，测定检测溶液在980nm激发光激发下547nm处的荧光值，作为检测溶液的荧光强度信号特征值；通过所构建的铅含量检测标准曲线，计算出茶叶样本中铅含量。
实施例2：
本发明公开一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，具体步骤为：
步骤一，上转换纳米材料的制备：准确称取0.087g六水氯化钇、0.047g六水氯化镱、0.005g六水氯化钬以及0.066g六水氯化钆，用3mL甲醇超声溶解10min，转至250mL的三口烧瓶中，加4.5mL油酸和10.5mL 1-十八烯；在氩气保护条件下，第一次加热到150℃、磁力搅拌反应30min，冷却至室温；向冷却液中逐滴加入含0.221g氟化铵和0.45g氢氧化钠的甲醇溶液15mL，然后第一水浴45℃下反应30min，第二次水浴85℃反应40min，使溶液中的甲醇完全挥发；接着，在氩气保护条件下，第二次加热到310℃、磁力搅拌反应1h，冷却至室温，得到反应产物；最后，用乙醇和二氯甲烷(体积比为1:2)混合溶液对反应产物进行清洗3次，60℃下真空干燥得到上转换纳米材料。
步骤二，上转换纳米材料的氨基化修饰：精准称取10mg步骤一得到的上转换纳米材料于100mL锥形瓶中，加入6mL乙醇，超声分散20min；然后将2mL去离子水与0.25mL 25％的氨水依次加入上转换纳米材料溶液中，在35℃水浴条件下，第一次搅拌反应5min；接着在65℃水浴条件下，逐滴加入4μL正硅酸四乙脂，第二次搅拌反应8h；逐滴加入8μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，第三次搅拌反应2h，冷却至室温，得到反应产物；最后用乙醇和水的混合液(醇和水的体积比为1：1)对反应产物清洗，真空干燥，得到氨基化上转换纳米材料。
步骤三，适配体功能化上转换纳米材料的制备：首先将称取的10mg步骤二得到的氨基化上转换纳米材料，超声分散于5mL的磷酸缓冲盐溶液中(pH＝7.4)，接着，向氨基化上转换纳米材料溶液中加入1.25mL质量浓度为25％的戊二醛溶液，第一次室温反应2.5h，反应结束后，用磷酸缓冲盐溶液清洗3次，再分散于5mL的磷酸缓冲盐溶液中；然后，加入0.5mL的适配体(200mM)溶液，适配体链为5’-NH2-TGA GTG ATA AAG CTG GCC GAG CCT CTT CTCTAC-3’，第二次在摇床中室温反应10h。反应结束后，用磷酸缓冲盐溶液对氨基化上转换纳米材料进行清洗，再分散于5mL磷酸缓冲盐溶液中，得到适配体功能化上转换纳米材料溶液，浓度为2.0mg/mL。
步骤四，金纳米的制备：先分别配制1％质量浓度的柠檬酸三钠溶液和1％质量浓度的四氯金酸溶液，取95mL去离子水加入到装有5mL四氯金酸溶液的锥形瓶中，在磁力搅拌、90℃条件下反应12min，接着迅速加入10mL柠檬酸三钠溶液，可以发现溶液在短时间内变为蓝色，继续反应，溶液从蓝色转为酒红色，然后溶液继续反应12min，反应结束后，将溶液冷却至室温，得到金纳米溶液，放置冰箱保存备用。
步骤五，磁性纳米材料的制备：将1.5g六水三氯化铁、9.7g 1,6-已二胺和3g无水醋酸钠加入到装有45mL乙二醇的烧杯中，将混合溶液转移到40℃的水浴锅中，待混合溶液清澈透明，将溶液转移到100mL的聚四氟乙烯内衬中，随后将聚四氟乙烯内衬放置反应釜中并在195℃烘箱中反应7h；反应结束后，反应釜冷却至室温，然后利用磁铁对反应液中的Fe3O4进行分离，分离后重新分散到去离子水中，重复该操作3次，放置在60℃的真空烘箱中烘干，得到磁性纳米材料。
步骤六，亲和素修饰的磁性纳米材料：称取10mg磁性纳米材料加入到5mL磷酸缓冲盐溶液，超声分散20min后，加入1.25mL的25％戊二醛溶液反应2h，用磷酸缓冲盐溶液进行第一次清洗；然后加入2mL的0.5mg/mL亲和素溶液反应12h，用磷酸缓冲盐溶液进行第二次清洗；在60℃下真空干燥，得到亲和素修饰的磁性纳米材料。
步骤七，金纳米-磁性纳米材料的制备：将10mg亲和素修饰的磁性纳米材料分散到5mL磷酸缓冲盐溶液中，与0.5mL生物素修饰的适配体互补链(200mM)溶液进行第一次反应，时间为3h，生物素修饰的适配体互补链为5’-Biotin-CGA TCA CTA ACT ATr AGG AAG AGATG-SH-3’；然后与1mL金纳米溶液进行第二次反应，时间为1h，最后通过磁铁分离得到金纳米-磁性纳米材料，并重新分散到5mL磷酸缓冲盐溶液中，得到金纳米-磁性纳米材料溶液，浓度为2.0mg/mL。
步骤八，特异性检测体系的构建：将步骤三得到的适配体功能化上转换纳米材料溶液稀释成1.0mg/mL，将步骤七得到的金纳米-磁性纳米溶液稀释成1.0mg/mL；然后将0.2mL浓度为1.0mg/mL的适配体功能化上转换纳米材料溶液，与0.2mL浓度为1.0mg/mL的金纳米-磁性纳米材料溶液混合，孵育10min后，使用磁铁对溶液中的上转换-金纳米-磁性纳米材料进行分离，分散到0.4mL的磷酸缓冲盐溶液中，得到上转换-金纳米-磁性纳米材料溶液，即特异性检测体系。
步骤九，铅含量检测标准曲线的建立：将0.2mL不同浓度的铅离子溶液(pH＝7.4)加入到0.2mL步骤八得到的特异性检测体系中反应4min，得到检测溶液，测定检测溶液在980nm激发光激发下547nm处的荧光值，作为检测体系的荧光强度信号特征值Y，建立铅离子浓度x与荧光强度信号特征值Y的关系，得到铅含量检测标准曲线Y＝1.215x+675.48，决定系数R2＝0.9906，检测限为5.71nM，线性范围为25-1400nM。
步骤十，茶叶中铅含量的检测：将茶叶样本粉粹40目过筛，得到茶粉；然后取1.0g茶粉和15mL浓硝酸混合进行微波消解，在微波消解炉中120℃反应5min，加热到160℃继续反应10min，再将温度升到180℃反应10min，然后室温冷却；随后将消解液体放置140℃油浴锅中，使其溶液中的酸完全挥发，然后用过滤器对消解液进行过滤，使用磷酸盐缓冲溶液调节消解液pH＝7.4，将0.2mL消解液加入到0.2mL步骤八得到的特异性检测体系中，得到检测溶液，测定检测溶液在980nm激发光激发下547nm处的荧光值，作为检测溶液的荧光强度信号特征值；通过所构建的铅含量检测标准曲线，计算出茶叶样本中铅含量。
实施例3：
本发明公开一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，具体步骤为：
步骤一，上转换纳米材料的制备：准确称取0.087g六水氯化钇、0.047g六水氯化镱、0.005g六水氯化钬以及0.066g六水氯化钆，用3mL甲醇超声溶解8min，转至250mL的三口烧瓶中，加4.5mL油酸和10.5mL 1-十八烯；在氩气保护条件下，第一次加热到170℃、磁力搅拌反应30min，冷却至室温；向冷却液中逐滴加入含0.221g氟化铵和0.45g氢氧化钠的甲醇溶液15mL，然后第一水浴55℃下反应30min，第二次水浴75℃反应40min，使溶液中的甲醇完全挥发；接着，在氩气保护条件下，第二次加热到290℃、磁力搅拌反应1h，冷却至室温，得到反应产物；最后，用乙醇和二氯甲烷(体积比为1:2)混合溶液对反应产物进行清洗3次，60℃下真空干燥得到上转换纳米材料。
步骤二，上转换纳米材料的氨基化修饰：精准称取10mg步骤一得到的上转换纳米材料于100mL锥形瓶中，加入6mL乙醇，超声分散30min；然后将2mL去离子水与0.25mL 25％的氨水依次加入上转换纳米材料溶液中，在35℃水浴条件下，第一次搅拌反应10min；接着在65℃水浴条件下，逐滴加入8μL正硅酸四乙脂，第二次搅拌反应10h；逐滴加入12μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，第三次搅拌反应4h，冷却至室温，得到反应产物；最后用乙醇和水的混合液(体积比为1：1)对反应产物清洗，真空干燥，得到氨基化上转换纳米材料。
步骤三，适配体功能化上转换纳米材料的制备：首先将称取的10mg步骤二得到的氨基化上转换纳米材料，超声分散于5mL的磷酸缓冲盐溶液中(pH＝7.4)，接着，向氨基化上转换纳米材料溶液中加入1.25mL质量浓度为25％的戊二醛溶液，第一次室温反应3h，反应结束后，用磷酸缓冲盐溶液清洗3次，再分散于5mL的磷酸缓冲盐溶液中；然后，加入0.5mL的适配体(200mM)溶液，适配体链为5’-NH2-TGA GTG ATA AAG CTG GCC GAG CCT CTT CTCTAC-3’，第二次在摇床中室温反应11h。反应结束后，用磷酸缓冲盐溶液对氨基化上转换纳米材料进行清洗，再分散于5mL磷酸缓冲盐溶液中，得到适配体功能化上转换纳米材料溶液，浓度为2.0mg/mL。
步骤四，金纳米的制备：先分别配制1％质量浓度的柠檬酸三钠溶液和1％质量浓度的四氯金酸溶液，取95mL去离子水加入到装有5mL四氯金酸溶液的锥形瓶中，在磁力搅拌、110℃条件下反应8min，接着迅速加入10mL柠檬酸三钠溶液，可以发现溶液在短时间内变为蓝色，继续反应，溶液从蓝色转为酒红色。然后溶液继续反应8min，反应结束后，将溶液冷却至室温，得到金纳米溶液，放置冰箱保存备用。
步骤五，磁性纳米材料的制备：将1.5g六水三氯化铁、9.7g 1,6-已二胺和3g无水醋酸钠加入到装有45mL乙二醇的烧杯中，将混合溶液转移到60℃的水浴锅中，待混合溶液清澈透明，将溶液转移到100mL的聚四氟乙烯内衬中，随后将聚四氟乙烯内衬放置反应釜中并在205℃烘箱中反应5h；反应结束后，反应釜冷却至室温，然后利用磁铁对反应液中的Fe3O4进行分离，分离后重新分散到去离子水中，重复该操作3次，放置在60℃的真空烘箱中烘干，得到磁性纳米材料。
步骤六，亲和素修饰的磁性纳米材料：称取10mg磁性纳米材料加入到5mL磷酸缓冲盐溶液，超声分散20min后，加入1.25mL的25％戊二醛溶液反应2h，用磷酸缓冲盐溶液进行第一次清洗；然后加入2mL的0.5mg/mL亲和素溶液反应12h，用磷酸缓冲盐溶液进行第二次清洗；在60℃下真空干燥，得到亲和素修饰的磁性纳米材料。
步骤七，金纳米-磁性纳米材料的制备：将10mg亲和素修饰的磁性纳米材料分散到5mL磷酸缓冲盐溶液中，与0.5mL生物素修饰的适配体互补链(200mM)溶液进行第一次反应，时间为3h，生物素修饰的适配体互补链为5’-Biotin-CGA TCA CTA ACT ATr AGG AAG AGATG-SH-3’；然后与1mL金纳米溶液进行第二次反应，时间为1h，最后通过磁铁分离得到金纳米-磁性纳米材料，并重新分散到5mL磷酸缓冲盐溶液中，得到金纳米-磁性纳米材料溶液，浓度为2.0mg/mL。
步骤八，特异性检测体系的构建：将步骤三得到的适配体功能化上转换纳米材料溶液稀释成1.0mg/mL，将步骤七得到的金纳米-磁性纳米溶液稀释成1.0mg/mL；然后将0.2mL浓度为1.0mg/mL的适配体功能化上转换纳米材料溶液，与0.2mL浓度为1.0mg/mL的金纳米-磁性纳米材料溶液混合，孵育10min后，使用磁铁对溶液中的上转换-金纳米-磁性纳米材料进行分离，分散到0.4mL的磷酸缓冲盐溶液中，得到上转换-金纳米-磁性纳米材料溶液，即特异性检测体系。
步骤九，铅含量检测标准曲线的建立：将0.2mL不同浓度的铅离子溶液(pH＝7.4)加入到0.2mL步骤八得到的特异性检测体系中反应4min，得到检测溶液，测定检测溶液在980nm激发光激发下547nm处的荧光值，作为检测体系的荧光强度信号特征值Y，建立铅离子浓度x与荧光强度信号特征值Y的关系，得到铅含量检测标准曲线Y＝1.234x+673.19，决定系数R2＝0.9914，检测限为5.80nM，线性范围为25-1400nM。
步骤十，茶叶中铅含量的检测：将茶叶样本粉粹40目过筛，得到茶粉；然后取1.0g茶粉和15mL浓硝酸混合进行微波消解，在微波消解炉中120℃反应5min，加热到160℃继续反应10min，再将温度升到180℃反应10min，然后室温冷却；随后将消解液体放置160℃油浴锅中，使其溶液中的酸完全挥发，然后用过滤器对消解液进行过滤，使用磷酸盐缓冲溶液调节消解液pH＝7.4，然后取0.2mL消解液加入到0.2mL步骤八得到的特异性检测体系中，得到检测溶液，测定检测溶液在980nm激发光激发下547nm处的荧光值，作为检测溶液的荧光强度信号特征值；通过所构建的铅含量检测标准曲线，计算出茶叶样本中铅含量。
检测：对4个茶叶标准样品，采用本发明实施例1所述方法和步骤，对茶叶中铅含量进行测定，测定结果表1所示，可以看出本发明方法与标准原子吸收光谱法的检测结果无显著性差异，表明本发明方法可高精度检测茶叶中铅含量。
表1本发明方法与标准方法检测茶叶标准样品中铅含量的结果(单位，nM)
t＝0.90<t0.05(3)＝3.182,P>0.05
将所构建的检测方法用于其他金属离子标准液的检测时，离子如Cd2+、Cr2+、Ba2+、Zn2+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Hg2+和Cu2+等100倍的加入不会引起体系荧光信号的变化，只有在体系中加入铅离子溶液时体系的荧光强度才会有明显的变化。在特异性检测体系下加入混合离子(铅离子和其中任意一种重金属离子)去测试该方法的抗干扰能力，结果表明混合离子作用下，其他重金属离子不会影响铅离子与特异性检测体系之间的反应。结果表明，所构建的检测体系在检测铅离子时几乎不受其他共存离子的影响，表明所构建的检测方法对铅离子具有高特异性、高选择性。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，制备得到上转换纳米材料；
步骤二，将步骤一得到的上转换纳米材料加入到乙醇中，超声分散，加入去离子水与氨水，进行第一次搅拌反应；加入正硅酸四乙脂，进行第二次搅拌反应；加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，进行第三次搅拌反应，冷却至室温，得到反应产物；用乙醇和去离子水的混合液对反应产物清洗，真空干燥，得到氨基功能化上转换纳米材料；
步骤三，取步骤二得到的氨基功能化上转换纳米材料，超声分散于磷酸缓冲盐溶液A中；加入戊二醛溶液，在室温下第一次反应后，用磷酸缓冲盐溶液清洗，再分散于磷酸缓冲盐溶液B中；加入适配体溶液，在室温下第二次反应后，用磷酸缓冲盐溶液清洗，再分散于磷酸缓冲盐溶液C中，得到适配体功能化上转换纳米材料溶液；
步骤四，将四氯金酸溶液和去离子水混合，在一定温度条件下进行第一次反应；然后加入柠檬酸三钠溶液，进行第二次反应，冷却至室温，得到金纳米溶液；
步骤五，将六水三氯化铁、1,6-已二胺、无水醋酸钠、乙二醇混合，得到混合溶液；在一定温度条件下进行水浴反应，待混合溶液清澈透明，转移到聚四氟乙烯内衬中，然后放置反应釜中并在烘箱中反应，冷却至室温，利用磁铁分离磁性纳米材料，用去离子水清洗，真空干燥后得到磁性纳米材料；
步骤六，将步骤五得到的磁性纳米材料超声分散在磷酸缓冲盐溶液D中，加入戊二醛溶液进行反应，反应后用磷酸缓冲盐溶液进行第一次清洗，加入亲和素溶液进行反应，反应后用磷酸缓冲盐溶液进行第二次清洗，真空干燥后得到亲和素修饰的磁性纳米材料；
步骤七，将步骤六得到的亲和素修饰的磁性纳米材料分散到磷酸缓冲盐溶液E中，与生物素修饰的适配体互补链溶液进行第一次反应，然后加入步骤四得到的金纳米溶液进行第二次反应，通过磁铁分离得到金纳米-磁性纳米材料，再次分散到磷酸缓冲盐溶液F中，得到金纳米-磁性纳米材料溶液；
步骤八，将步骤三得到的适配体功能化上转换纳米材料溶液和步骤七得到的金纳米-磁性纳米材料溶液分别用磷酸缓冲盐溶液稀释，得到稀释液后，再混合孵育，得到上转换-金纳米-磁性纳米材料，采用磁体分离，并重新分散到磷酸缓冲盐溶液中，得到特异性检测体系；
步骤九，分别将不同浓度的铅离子溶液加入到步骤八得到的特异性检测体系中反应，得到检测溶液，测定检测溶液的荧光强度信号特征值，以铅离子浓度为横坐标，荧光强度信号特征值为纵坐标，建立铅含量检测标准曲线；
步骤十，将茶叶样本粉粹过筛，得到茶粉；然后将茶粉和浓硝酸混合进行微波消解，室温冷却；得到消解液，采用油浴使消解液中酸完全挥发，过滤，调节消解液的pH，加入到步骤八得到的特异性检测体系中，得到检测溶液，测定检测溶液的荧光强度信号特征值，通过步骤九所构建的铅含量检测标准曲线，计算出茶叶样本中铅含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，其特征在于，步骤二中，所述上转换纳米材料、乙醇、去离子水、氨水、正硅酸四乙脂和3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为10mg：6mL：2mL：0.25mL：4-8μL：8-12μL；所述氨水的质量浓度为25％；所述超声分散的时间为20-30min；
所述第一次搅拌反应，温度为35℃，时间为5-10min；所述第二次搅拌反应，温度为65℃，时间为8-10h；所述第三次搅拌反应，温度为65℃，时间为2-4h；所述乙醇和去离子水混合液中乙醇和去离子水的体积比为1：1。
3.根据权利要求1所述的一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，其特征在于，步骤三中，所述氨基化上转换纳米材料、戊二醛、适配体溶液、磷酸缓冲盐溶液A的用量比为10mg：1.25mL：0.5mL：5mL；所述磷酸缓冲盐溶液A、磷酸缓冲盐溶液B和磷酸缓冲盐溶液C的用量比为1:1:1；所述戊二醛，质量浓度为25％；
所述适配体溶液浓度为200mM，溶剂为磷酸缓冲盐溶液，所述适配体链为5’-NH2-TGAGTG ATA AAG CTG GCC GAG CCT CTT CTC TAC-3’；所述第一次反应，时间为2-3h；所述第二次反应，时间为10-12h。
4.根据权利要求1所述的一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，其特征在于，步骤四中，所述四氯金酸溶液的质量浓度为1％；所述柠檬酸三钠溶液的质量浓度为1％；所述四氯金酸溶液、去离子水、柠檬酸三钠溶液的用量比为5mL：95mL：10mL；所述第一次反应和第二次反应的温度为90-110℃，时间为8-12min。
5.根据权利要求1所述的一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，其特征在于，步骤五中，所述六水三氯化铁、1,6-已二胺、无水醋酸钠、乙二醇的用量比为1.5g：9.7g：3g：45mL；所述水浴反应的温度为40-60℃；所述烘箱中反应的温度为195-205℃，反应时间为5-7h。
6.根据权利要求1所述的一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，其特征在于，步骤六中，所述磁性纳米材料、磷酸缓冲盐溶液D、戊二醛溶液、亲和素溶液的用量比为10mg：5mL：1.25mL：2mL，所述超声分散的时间为20min；所述戊二醛溶液的质量浓度为25％；所述加入戊二醛溶液反应的时间为2h；所述亲和素溶液的浓度为0.5mg/mL；所述加入亲和素溶液反应的时间为12h。
7.根据权利要求1所述的一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，其特征在于，步骤七中，所述亲和素修饰的磁性纳米材料、磷酸缓冲盐溶液E、生物素修饰的适配体互补链、金纳米溶液的用量比为10mg：5mL：0.5mL：1mL；
所述生物素修饰的适配体互补链溶液浓度为200mM，所述生物素修饰的适配体互补链为5’-Biotin-CGA TCA CTA ACT ATr AGG AAG AGA TG-SH-3’；所述第一次反应的时间为3h；所述第二次反应的时间为1h。
8.根据权利要求1所述的一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，其特征在于，步骤八中，所述适配体功能化上转换纳米材料溶液稀释后的浓度为1.0mg/mL，所述金纳米-磁性纳米材料溶液稀释后的浓度为1.0mg/mL，所述适配体功能化上转换纳米材料溶液稀释液、金纳米-磁性纳米材料溶液的稀释液混合孵育时两者的体积比为1：1，所述孵育的时间为10min。
9.根据权利要求1所述的一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，其特征在于，步骤九中，所述铅离子溶液的浓度范围25-1400nM，pH＝7.4；所述铅离子溶液与特异性检测体系的体积比为1：1；所述反应的时间为4min；所述测定检测溶液的荧光强度信号特征值为980nm激发光激发下547nm处的荧光强度值，记为I547。
10.根据权利要求1所述的一种基于上转换-金纳米-磁性纳米特异性体系的茶叶中铅含量检测方法，其特征在于，步骤十中，所述筛网的目数为40目；所述茶粉和浓硝酸的用量比为1g：15mL；所述调节消解液的pH是使用磷酸缓冲盐溶液调节为7.4；所述消解液和特异性检测体系的体积比为1：1。
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