CN109187454A - 一种茶叶中风险物质氟的荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,属于食品安全检测技术领域。本发明的茶叶中风险物质氟的荧光检测方法具体为:以氯化钇、氯化镱、氯化钬、油酸、1‑十八烯、氟化铵和氢氧化钠的甲醇混合液为原料,制备得到六方相上转换纳米晶;加入环己烷、IGEPAL CO‑520、正硅酸四乙酯、APTES,得到氨基化的六方相上转换纳米晶;与姜黄素水溶液进行混合,得到特异性混合检测体系;建立氟离子检测标准曲线;最后对待测茶叶中的氟含量进行测定。本发明通过纳米可控自组装制备荧光信号增强基底,构建稳态特异性氟离子检测体系,实现茶叶中氟的高灵敏、特异性检测,具有较宽的线性检测范围,检测限较低,有望应用于规模化检测茶叶中风险物质氟。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,属于食品安全检测技术领域。
背景技术
中国是茶的故乡,是茶文化的发祥地。茶叶是纯天然的、符合人体生理健康的卫生、安全、保健、无公害的饮料。茶树是一种富集氟元素的植物,叶片是氟元素富集的一个重要场所,因茶树品种、叶片老嫩程度的不同每千克茶叶中的氟含量从几十到上千毫克不等。适量的氟有助于防治龋齿,但长期摄入过量氟化物会使人体中毒,甚至可能导致癌症、神经疾病以及内分泌系统功能失常。长期饮用高氟含量的砖茶、边茶易引发氟中毒。在茶叶加工过程无法降解或消除氟含量。因此,由氟元素引起的茶的饮用安全性问题已引起人们的重视。另外,茶叶这种绿色保健的天然产物作为重要原料用于食品的深加工,对含氟量的检测限有了更高的要求。
氟离子选择电极法是目前应用与测定茶叶中氟化物含量较多的一种方法。但是该方法也有其局限性,其测定结果容易受外部环境如电极材料、规格、使用时的状态、测定温度、测试液pH值、干扰离子等的影响,只适用于高含量的检测,无法用于茶及其深加工产品的含氟量的痕量分析。离子色谱法和高效液相色谱法具在氟离子检测方面具有灵敏性高和选择性好的优点,但色谱仪器价格昂贵,仪器稳定时间长,分析成本高,基体效应大,普及程度不高。相关专利公开了一种茶树鲜叶氟含量无损快速确定方法,利用建立的叶绿素指数SPAD与氟的相关方程预测氟含量,因叶绿素含量和氟之间无直接的相关关系,预测精度不高。相关专利公开了一种用于测定茶叶中氟含量的茶叶中氟的提取方法,以超声波水浴法缩短茶叶浸泡时间,然后再用氟离子选择电极法测定,仅在检测前处理方面做了改进。
低成本、超灵敏、高特异性的茶叶风险物质检测方法亟待开发,纳米光学检测在技术原理实现上具有可行性,在茶叶风险物质评价中的应用有待探索。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的技术缺陷,如:检测灵敏性差、易受仪器器件和试剂条件的影响、检测成本高、检测时间长等,本发明提供了一种茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,通过纳米可控自组装制备荧光信号增强基底,构建稳态特异性氟离子检测体系,消除背景荧光、其他阴离子干扰及茶汤颜色的影响,实现茶叶中氟的低成本、高灵敏、特异性检测。
具体的,本发明采取的技术方案是:
(1)六方相上转换纳米晶的可控合成:
将氯化钇、氯化镱和氯化钬,用甲醇超声溶解后,加入油酸和1-十八烯,在氩气的保护下,第一次加热搅拌,自然冷却,加入氟化铵和氢氧化钠的甲醇混合液,搅拌并第二次加热,在氩气保护下第三次加热,冷却至室温,离心、真空干燥,得到六方相上转换纳米晶;
(2)六方相上转换纳米晶的氨基化修饰:
向步骤(1)合成的六方相上转换纳米晶中,加入环己烷和IGEPAL CO-520,搅拌,加入氨水,超声分散,加入正硅酸四乙酯,搅拌过夜后,加入APTES,继续反应后停止搅拌,室温下陈化后,离心、真空干燥,得到氨基化的六方相上转换纳米晶;
(3)特异性混合检测体系的构建:
将氨基化的六方相上转换纳米晶水溶液与姜黄素水溶液进行混合,得到姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系;
(4)氟离子检测标准曲线的建立:
将不同浓度梯度的F-标准品溶液,分别与步骤(3)的姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系混合均匀,得到混合液,测定混合液的荧光强度,建立F-浓度n与混合液的荧光强度F的线性关系,即得到氟离子检测标准曲线方程;
(5)茶叶风险物质氟的检测:
取茶叶样本粉碎过筛,烘干至恒重,得到茶粉;向茶粉中,加入纯净水,置沸水浴,冷却至室温,过超滤膜,得到茶汤上清液,调节pH值,加入到姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系中,测定混合溶液的荧光强度,通过所构建的氟离子检测标准曲线,计算出茶叶样本中的氟含量。
步骤(1)中,所述氯化钇、氯化镱与氯化钬的质量比为0.2367:0.0775:0.0066;所述油酸与1-十八烯的体积比为18:42;所述第一次加热搅拌的温度为160℃,所述第一次加热搅拌的时间为30min;所述自然冷却至50℃;
所述氟化铵与氢氧化钠在甲醇混合液中的质量比为14.82:10;所述氯化钬、氟化铵与氢氧化钠的质量比为0.0066:14.82:10;
所述第二次加热的温度为70℃,所述第二次加热的时间为50min;所述第三次加热的温度为310℃,第三次加热的时间为1h;
步骤(2)中,六方相上转换纳米晶、环己烷与IGEPAL CO-520的添加比例为0.2g:20mL:10mL;氨水、正硅酸四乙酯与APTES的体积比为1.6mL:800μL:1mL,所述氨水的质量浓度为25%;所述超声分散的时间为20min;所述继续搅拌反应的时间为3-4h,所述陈化的时间为2h;
步骤(3)中,氨基化的六方相上转换纳米晶水溶液与姜黄素水溶液的体积比为1:1;氨基化的六方相上转换纳米晶水溶液与姜黄素水溶液的浓度比为1mg/mL:8×10-5M;
步骤(4)中,所述测定混合液的荧光强度时,具体是测定980nm激光激发下在546nm处的荧光信号强度;所述氟离子检测标准曲线为F=-18.955n+6266,决定系数R2=0.998;
步骤(5)中,茶粉与纯净水的用量比为0.2g:40mL;所述沸水浴的时间为15min;所述调节pH值至7.0-7.5;所述茶汤上清液与姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系的体积比为1:5;所述测定混合溶液的荧光强度,具体是测定980nm激光激发下在546nm处的荧光强度。
与现有技术相比较,本发明的有益效果体现如下:
(1)本发明公开一种茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,通过纳米可控自组装制备荧光信号增强基底,构建稳态特异性氟离子检测体系,实现茶叶中氟的高灵敏、特异性检测。与传统检测方法相比具有成本低、灵敏度高、方便快捷的优势。
(2)本发明构建的特异性混合检测体系,具体优化设计的姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系,对氟离子具有强的荧光响应性,可有效消除背景荧光及其他阴离子干扰的影响,对氟离子的检测具有特异性。
(3)本发明建立F-浓度与荧光强度的线性浓度范围5-200μM,具有较宽的线性检测范围,检测限LOD为5μM,既可以满足砖茶、边茶等高氟含量的快速检测,又可以满足茶叶精深加工低氟含量的高灵敏检测,具有很好的通用性,比传统的选择电极法检测精度和灵敏度更高。
(4)本发明制备六方相上转换纳米晶为上转换荧光纳米增强材料,构建茶叶风险物质氟的高灵敏检测体系,采用980nm激光激发产生特异性荧光检测信号,消除了不同茶叶种类茶汤色对检测结果的干扰问题,对不同发酵程度的茶叶均适用,在茶叶氟的特异性、高灵敏、适用性检测方面优势显著。
附图说明
图1示出了本发明制备的六方相上转换纳米晶结构的透射电镜图;
图2示出了本发明不同氟离子浓度下姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系的荧光信号;
图3示出了本发明基于姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系的氟检测标准曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
实施例1:
本发明公开一种茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,具体步骤为:
(1)六方相上转换纳米晶的可控合成:
精确称取0.2367g的氯化钇、0.0775g氯化镱和0.0066g氯化钬,用12mL甲醇超声溶解后转移至250mL的三口圆底烧瓶中,加18mL油酸和42mL 1-十八烯,在氩气的保护160℃第一次加热并搅拌30min,自然冷却至50℃,逐滴加入浓度为1.482g/mL氟化铵和1g/mL氢氧化钠的甲醇混合液10mL,搅拌并第二次加热至70℃维持50min,在氩气保护下第三次加热至310℃并维持1h,冷却至室温,加入乙醇后以5000rpm的高速离心机离心分离得到的产物,置于50℃的真空干燥箱,真空干燥过夜,得到六方相上转换纳米晶,待用。
(2)六方相上转换纳米晶的氨基化修饰:
取步骤(1)合成的六方相上转换纳米晶0.2g于100mL的单口圆底烧瓶,加入20mL环己烷和10mL IGEPAL CO-520,搅拌10min,加1.6mL 25%的氨水,超声分散20min,逐滴加入800μL正硅酸四乙酯,搅拌过夜后,逐滴加入1mL的APTES,继续搅拌反应3h后停止,室温下陈化2h后用离心机离心分离,弃上清液,50℃的真空干燥箱,得到氨基化的六方相上转换纳米晶,待用,氨基化的六方相上转换纳米粒子结构的透射电镜图如图1所示。
由图1可得,合成的氨基化上转换纳米材料呈六方相,颗粒分布均匀,粒径约为55nm。
(3)特异性混合检测体系的构建:
取步骤(2)制备的氨基化的六方相上转换纳米晶配置1mg/mL的水溶液,配置浓度为8×10-5M姜黄素水溶液,将六方相上转换纳米晶水溶液与姜黄素水溶液等体积混合,得到姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系,即为特异性混合检测体系。
所述姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系呈淡黄色,在980nm激光照射下,发出明亮的绿色荧光,加入氟离子后,姜黄素紫外吸收发生红移,红移后的紫外吸收峰和六方相上转换纳米晶的发射峰发生有效重叠,导致荧光内滤效应,实现上转换荧光的淬灭,体系变为蓝紫色,980nm激光照射下发出的绿色荧光变弱。
为了获取荧光强度最大的特异性混合检测体系,六方相上转换纳米晶水溶液与姜黄素水溶液的体积比例是通过检测信号优化确定的,在特异性混合检测体系中,上转换纳米材料浓度和被检测的氟离子浓度(200μM)一定的情况下,采用980nm激光激发,记录添加不同浓度的姜黄素水溶液时,上转换荧光546nm处信号强度变化,随着姜黄素浓度的增加,对上转换荧光的猝灭效率逐渐增加,当姜黄素浓度为8×10-5M时,猝灭效率达到最高,继续提高姜黄素浓度,荧光信号产生抑制作用,使荧光内滤效应减弱,荧光信号逐渐降低,以荧光增强信号最大确定所述特异性混合检测体系中两种水溶液的比例关系。
通过试验优化确定所述两种水溶液等体积混合,得到姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系,对氟离子具有强的荧光响应性,对氟的检测具有高的特异性和灵敏性,不同浓度氟下姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系的荧光信号如图2所示,随氟离子浓度的增加检测体系在546nm处的荧光信息强度依次降低。
(4)氟离子检测标准曲线的建立:
配置5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、200μM的F-标准品溶液;将步骤(3)制备最优的姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系分别与F-标准品溶液混合均匀,得到混合液,测定混合液980nm激光激发下在546nm处的荧光信号强度。具体为:采集不同浓度F-的上转换荧光光谱,对获取的上转换荧光光谱进行标准化预处理,以546nm的上转换发光强度作为荧光检测信号,建立F-浓度n与混合液的荧光强度F的线性关系,建立氟离子检测标准曲线为F=-18.955n+6266,决定系数R2=0.998。基于姜黄素-上转换纳米材料混合检测体系的氟检测标准曲线图如图3所示,可以看出,F-在浓度范围5-200μM内与荧光检测信号线性关系显著。
上述上转换荧光光谱的标准化预处理,用于消除检测背景和外界因素对上转换发光强度的干扰,批量采集在不同氟离子浓度下的姜黄素-上转换纳米材料混合检测体系的荧光光谱,选择荧光光谱的平均光谱460nm、515nm、600nm、710nm和845nm位置的荧光强度值进行不同方程(线性、多项式、对数及其变换形式)进行基线拟合,得到基线拟合方程,对测试样本的荧光光谱扣除所述基线拟合方程,用于消除基线漂移的影响,同时以785nm处的荧光强度的平均值作为标准变换参考值,对所述基线校正后的样本的荧光光谱以758nm的荧光强度为基准强度进行荧光光谱的标准化变换,标准化预处理方程如下:
其中为样本标准化预处理后的荧光光谱,I(1,λ)为采集样本的原始荧光光谱,D(0,λ)为得到的基线拟合方程,I(0,785)为785nm处的荧光强度的标准变换参考值I(1,785)为样本785nm处的原始荧光强度,λ为采集荧光光谱的波长,波长范围为450-850nm。
(5)茶叶风险物质氟的检测:
取茶叶样本20g粉碎过40目筛,80℃烘干至恒重,准确称取0.2g(精确至0.1mg)茶粉置于50mL具塞磨口三角瓶中,加40mL纯净水,置沸水浴15min,冷却至室温,过超滤膜,得到茶汤上清液,加1M的氢氧化钠于清液中调节pH值至7.0~7.5,再用PBS缓冲液稀释或浓缩得到含有5-200μM氟离子的样品,加入姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系中,测定980nm激光激发下在546nm处的荧光信号强度,通过所构建的氟离子检测标准曲线,计算出茶叶样本中的氟含量。
其中,所述茶汤上清液与姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系的体积比为1:5;对所述茶叶提取液的稀释或浓缩是通过茶叶中氟含量进行优化的,当茶叶中氟含量很高时,对提取液用PBS缓冲液进行稀释,当茶叶中氟含量很低时,特别是对茶叶的深加工制品,对提取液进行真空浓缩处理,使F离子浓度在检测线性范围5-200μM内。
实施例2:
对12个茶叶标准样品,采用本发明实施例1所述方法和步骤,对茶叶中风险物质氟含量进行测定,测定结果表1所示,可以看出测定的符合率较高,变异系数均小于5%,可高精度的检测茶叶中的氟含量。
表1本发明的检测方法检测茶叶标准样品的符合率和变异系数
将所构建的检测方法用于其他阴离子标准液的检测,离子如H2PO4 -,Fe2+,AcO-,HSO4 -,NO3 -,ClO4 -,OH-,CN-,I-,Br-,Cl-的十倍量加入不会引起荧光信号的变化,只有在检测氟离子的时候,体系的颜色才会发生明显的变紫色,上转换荧光才会发生明显的减弱,表明所构建的方法具有较高的特异性;另外,在上所述离子存在的情况下向所构建检测体系中加入F-的竞争性实验,向所构建检测体系中加入F-都会引起上转换荧光的明显减弱,结果表明,所构建的检测体系在检测F-时几乎不受其他共存离子的影响,本发明所构建的姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系可以作为F-检测的具有高特异性、高选择性。
由验证结果可以发现,所述茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,构建稳态特异性氟离子检测体系,消除背景荧光、其他阴离子干扰及茶汤颜色的影响,实现茶叶中氟的高灵敏、特异性检测。与传统检测方法相比具有成本低、灵敏度高、方便快捷的优势,在检测能力和精度方面本发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
实施例3:
本实施例的具体检测方法,只是将步骤(2)中继续反应的时间改为4h后停止,其他步骤和方法与实施例1相同。
实施例4:
本实施例的具体检测方法,只是将步骤(2)中继续反应的时间改为3.5h后停止,其他步骤和方法与实施例1相同。
虽然结合附图描述了本发明的实施方式,但是本领域技术人员可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下做出各种修改和变型,这样的修改和变型均落入由所附权利要求所限定的范围之内。
Claims (10)
1.一种茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)六方相上转换纳米晶的可控合成:
将氯化钇、氯化镱和氯化钬,用甲醇超声溶解后,加入油酸和1-十八烯,在氩气的保护下,第一次加热搅拌,自然冷却,加入氟化铵和氢氧化钠的甲醇混合液,搅拌并第二次加热,在氩气保护下第三次加热,冷却至室温,离心、真空干燥,得到六方相上转换纳米晶;
(2)六方相上转换纳米晶的氨基化修饰:
向步骤(1)合成的六方相上转换纳米晶中,加入环己烷和IGEPAL CO-520,搅拌,加入氨水,超声分散,加入正硅酸四乙酯,搅拌过夜后,加入APTES,继续反应后停止搅拌,室温下陈化后,离心、真空干燥,得到氨基化的六方相上转换纳米晶;
(3)特异性混合检测体系的构建:
将氨基化的六方相上转换纳米晶水溶液与姜黄素水溶液进行混合,得到姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系;
(4)氟离子检测标准曲线的建立:
将不同浓度梯度的F-标准品溶液,分别与步骤(3)的姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系混合均匀,得到混合液,测定混合液的荧光强度,建立F-浓度n与混合液的荧光强度F的线性关系,即得到氟离子检测标准曲线方程;
(5)茶叶风险物质氟的检测:
取茶叶样本粉碎过筛,烘干至恒重,得到茶粉;向茶粉中,加入纯净水,置沸水浴,冷却至室温,过超滤膜,得到茶汤上清液,调节pH值,加入到姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系中,测定混合溶液的荧光强度,通过所构建的氟离子检测标准曲线,计算出茶叶样本中的氟含量。
2.根据权利要求1所述的茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,其特征在于,步骤(1)中,所述氯化钇、氯化镱与氯化钬的质量比为0.2367:0.0775:0.0066;所述氯化钬、氟化铵与氢氧化钠的质量比为0.0066:14.82:10。
3.根据权利要求1所述的茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,其特征在于,步骤(1)中,所述油酸与1-十八烯的体积比为18:42;所述氟化铵与氢氧化钠在甲醇混合液中的质量比为14.82:10。
4.根据权利要求1所述的茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,其特征在于,步骤(1)中,所述第一次加热搅拌的温度为160℃,所述第一次加热搅拌的时间为30min;所述自然冷却至50℃;所述第二次加热的温度为70℃,所述第二次加热的时间为50min;所述第三次加热的温度为310℃,第三次加热的时间为1h。
5. 根据权利要求1所述的茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,其特征在于,步骤(2)中,所述六方相上转换纳米晶、环己烷与IGEPAL CO-520的添加比例为0.2 g:20 mL:10 mL;氨水、正硅酸四乙酯与APTES的体积比为1.6 mL:800 µL:1 mL,所述氨水的质量浓度为25%。
6. 根据权利要求1所述的茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,其特征在于,步骤(2)中,所述超声分散的时间为20min;所述继续搅拌反应的时间为3-4 h,所述陈化的时间为2h。
7. 根据权利要求1所述的茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,其特征在于,步骤(3)中,氨基化的六方相上转换纳米晶水溶液与姜黄素水溶液的体积比为1:1;氨基化的六方相上转换纳米晶水溶液与姜黄素水溶液的浓度比为1mg/mL:8×10-5 M。
8. 根据权利要求1所述的茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,其特征在于,步骤(4)中,所述测定混合液的荧光强度时,具体是测定980 nm激光激发下在546 nm处的荧光信号强度;所述氟离子检测标准曲线为F=-18.955n+6266,决定系数R2=0.998。
9.根据权利要求1所述的茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,其特征在于,步骤(5)中,茶粉与纯净水的用量比为0.2g:40mL;所述沸水浴的时间为15min;所述调节pH值至7.0-7.5。
10. 根据权利要求1所述的茶叶中风险物质氟的荧光检测方法,其特征在于,步骤(5)中,所述茶汤上清液与姜黄素-氨基化的六方相上转换纳米晶混合检测体系的体积比为1:5;所述测定混合溶液的荧光强度,具体是测定980 nm激光激发下在546 nm处的荧光强度。
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