CN108535342B - 一种基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器的制备方法及应用，属于纳米材料和电化学分析技术领域。采用钯纳米粒子掺杂十六烷基三甲基溴化铵改性的二硫化钼纳米球制备的电化学免疫传感器，实现了N末端B型利钠肽原的高灵敏检测。

Description

一种基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器的制备 方法及应用
技术领域
本发明涉及一种基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器的制备方法及应用，属于纳米材料和电化学分析领域。
背景技术
N末端B型利钠肽原在心力衰竭的筛选、疗效评估和预后判断中具有十分重要的作用。作为心功能紊乱最敏感和最特异性的指标，可作为早期诊断舒张性心力衰竭的新指标，具有重要的临床指标意义。如何能高效准确实现N末端B型利钠肽原的灵敏检测是亟待解决的问题。
电化学免疫法免疫传感分析是抗原和抗体的特异性结合的一类分析方法，具有分析灵敏度高、特异性强、使用简便及成本低等优点，目前它的应用已涉及到临床医学中肿瘤疾病标志物的检测。
本发明制备了一种基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器，具体采用钯纳米粒子掺杂二硫化钼纳米球作为传感器平台构建了一种无标记型电化学免疫传感器，并用于N末端B型利钠肽原的灵敏检测。二硫化钼作为类石墨烯材料，具有良好的导电性，出色的电荷传输能力和大的比表面积，已被广泛应用于各种领域，其边缘部位拥有丰富的催化活性位点，使其具有很好的催化效果，而发展纳米或缺陷MoS2结构使其活性边缘位置最大化是最近几年研究的热点（Am. Chem. Soc. 135 (2013), 17881-17888）。尤其，具有丰富褶皱面的 MoS2纳米球对H2O2还原呈现出类似过氧化物酶的活性。此外，MoS2相关衍生物的大表面积可以加载更活跃的探针和活性结构域来结合生物分子，对电化学传感信号提供显著的放大作用。而本发明通过水热法合成形貌均一的二硫化钼纳米球使其拥有更多的褶皱面，从而获得更多的活性位点，提高其催化活性。虽然二硫化钼催化活性远高于氧化还原石墨烯，但其分散性和导电性要比氧化还原石墨烯弱。为解决这一问题，首先我们选择用阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵与带负电的二硫化钼结合，以调节优化表面结构（CrystEngComm 2014, 16, 9469−9477），除此之外，阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵还起到了模板剂的作用，使钯纳米粒子更容易还原在二硫化钼纳米球表面，且分散均匀。其次，钯纳米粒子杂化二硫化钼球，提高其导电性，而钯纳米粒子和二硫化钼纳米球的协同作用使其对过氧化氢具有更好的催化效果，本发明所制备的钯纳米粒子杂化二硫化钼纳米球具有以下优点：二硫化钼纳米球具有大的比表面积和良好的催化性能。阳离子表面活性剂的引入使二硫化钼纳米球具有良好的分散性和吸附阴离子的能力，将更多带负电的氯钯酸根吸附在二硫化钼表面，而原位还原使钯纳米粒子可以均匀分布在二硫化钼纳米球表面，钯纳米粒子杂化二硫化钼球不但提高了复合材料的导电性，而且通过两者之间的协同作用，使所合成的材料具有更优越的催化性，同时大量地钯纳米粒子可以大大提高抗体的负载量。
发明内容
本发明的目的之一是提出一种基于水热法制备二硫化钼纳米球的方法。
本发明的目的之二制备钯纳米粒子杂化二硫化钼纳米球，在十六烷基三甲基溴化铵改性的二硫化钼溶液后，在室温条件下，加入氯钯酸，大量的氯钯酸根结合到改性的二硫化钼，在弱还原剂抗坏血酸作用下，慢慢还原成钯纳米粒子，此方法可有效的将钯纳米粒子均匀地负载在二硫化钼纳米球表面，而钯纳米粒子和二硫化钼纳米球的协同催化作用进一步提高了对过氧化氢的催化能力。
本发明的目的之三将基于钯纳米粒子杂化二硫化钼纳米球制备的电化学免疫传感器应用于N末端B型利钠肽原抗体的高灵敏、特异性检测，钯纳米粒子可直接连接N末端B型利钠肽原抗体，不需要使用其它连接剂，简化了实验操作。增加对N末端B型利钠肽原的检测下限，实现更宽范围浓度的检测，提高检测的灵敏度。
本发明的技术方案如下：
1. 一种基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1）钯掺杂二硫化钼纳米球的制备
1) 将0.5~1.5 mmol四水合钼酸铵，10~20 mmol硫脲和0.005~0.015 mmol聚乙烯吡咯烷酮依次加入到35 mL超纯水中，磁力搅拌形成均一溶液A；
2）将溶液A转移到高温反应釜中，在220ºC条件下，反应18h，离心分离，分别用超纯水，无水乙醇洗涤以除去杂质，将产物置于冷冻干燥机中冻干，制得二硫化钼纳米球；
3）将30~70 mmol十六烷基三甲基溴化铵溶解在10mL超纯水中，超声10~20 min，得到均匀溶液B；然后将1~5 mg二硫化钼纳米球加入到溶液中B中，混合溶液变成灰黑色，持续超声10~20 min，制得十六烷基三甲基溴化铵改性的二硫化钼纳米球；
4) 10~40 mL 1mmol/L的H2PdCl4溶液置于二硫化钼纳米球悬浮液中，超声处理60min，快速注入2~8 mL、10mmol/L的抗坏血酸溶液，快速倒置20~40s，静置6h，离心、水洗，将棕色沉淀物在室温下干燥，得到钯掺杂二硫化钼纳米球；
（2）电化学免疫传感器的制备
1）玻碳电极经Al2O3粉打磨至镜面，用超纯水彻底清洗干净；
2）将6μL浓度为0.5~2.5 mg/mL的钯掺杂二硫化钼纳米球溶液滴加到电极表面，4ºC下干燥；
3）继续滴加6μL浓度为6~12μg/mL的N末端B型利钠肽原抗体溶液于电极表面，4ºC保存至干燥；
4）继续滴加3μL质量分数为0.5~1%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH为7.4的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，4ºC晾干；
5）分别滴加6μL不同浓度的N末端B型利钠肽原于上述电极表面，4ºC下孵化20~40min，用pH为7.4的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，4ºC晾干。
2. 在钯掺杂二硫化钼纳米球中，通过水热法一步合成了二硫化钼纳米球，然后用阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵对其改性，并运用原位还原法使钯纳米粒子均匀分布改性的二硫化钼纳米球上。
3. 基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器，作为N末端B型利钠肽原检测的应用。
4. 电化学免疫传感器作为N末端B型利钠肽原检测的应用，检测步骤如下：
（1）将饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.0 ~ 8.04磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH = 7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；
（4）将待测的N末端B型利钠肽原样品溶液代替N末端B型利钠肽原标准溶液进行检测，基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器用于N末端B型利钠肽原检测，检测范围为0.01~ 100.0ng/mL，检测限为3.3 pg/mL。
本发明的有益成果
（1）本发明通过十六烷基三甲基溴化铵改性二硫化钼纳米球，实现了对钯纳米粒子的高效固定；
（2）本发明使用了钯纳米粒子杂化二硫化钼纳米球作为基底，二硫化钼具有大的比表面积、良好的电子传递能力和催化性能，具有大量褶皱面的二硫化钼纳米球有丰富的催化活性位点，对过氧化氢有良好的催化作用，钯纳米粒子具有极好的导电性能、良好的好生物相容性，可以固载大量抗体，对于提高传感器灵敏度具有重要作用；
（3）本发明制备了一种基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器并用于N末端B型利钠肽原的检测。操作简单，响应时间短，信号响应范围宽，检测线性范围为0.01-100.0ng/mL，检测限为3.3 pg/mL，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1一种基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1）钯掺杂二硫化钼纳米球的制备
1) 将0.5mmol四水合钼酸铵，10mmol硫脲和0.005mmol聚乙烯吡咯烷酮依次加入到35 mL超纯水中，磁力搅拌形成均一溶液A；
2）将溶液A转移到高温反应釜中，在220ºC条件下，反应18h，离心分离，分别用超纯水，无水乙醇洗涤以除去杂质，将产物置于冷冻干燥机中冻干，制得二硫化钼纳米球；
3）将30 mmol十六烷基三甲基溴化铵溶解在10mL超纯水中，超声10 min，得到均匀溶液B；然后将1mg二硫化钼纳米球加入到溶液中B中，混合溶液变成灰黑色，持续超声10min，制得十六烷基三甲基溴化铵改性的二硫化钼纳米球；
4) 将10mL、1mmol/L的H2PdCl4溶液置于二硫化钼纳米球悬浮液中，超声处理60min，快速注入2 mL、10mmol/L的抗坏血酸溶液，快速倒置20s，静置6h，离心、水洗，将棕色沉淀物在室温下干燥，得到钯掺杂二硫化钼纳米球。
（2）电化学免疫传感器的制备
1）玻碳电极经Al2O3粉打磨至镜面，用超纯水彻底清洗干净；
2）将6μL浓度为0.5mg/mL的钯掺杂二硫化钼纳米球溶液滴加到电极表面，4ºC下干燥；
3）继续滴加6μL浓度为6μg/mL的N末端B型利钠肽原抗体溶液于电极表面，4ºC保存至干燥；
4）继续滴加3μL质量分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH为7.4的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，4ºC晾干；
5）分别滴加6μL不同浓度的N末端B型利钠肽原于上述电极表面，4ºC下孵化20min，用pH为7.4的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，4ºC晾干。
实施例2一种基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1）钯掺杂二硫化钼纳米球的制备
1) 将1.0 mmol四水合钼酸铵，15 mmol硫脲和0.010 mmol聚乙烯吡咯烷酮依次加入到35 mL超纯水中，磁力搅拌形成均一溶液A；
2）将溶液A转移到高温反应釜中，在220ºC条件下，反应18h，离心分离，分别用超纯水，无水乙醇洗涤以除去杂质，将产物置于冷冻干燥机中冻干，制得二硫化钼纳米球；
3）将50 mmol十六烷基三甲基溴化铵溶解在10mL超纯水中，超声15 min，得到均匀溶液B；然后将3 mg二硫化钼纳米球加入到溶液中B中，混合溶液变成灰黑色，持续超声15min，制得十六烷基三甲基溴化铵改性的二硫化钼纳米球；
4) 将20 mL、1mmol/L的H2PdCl4溶液置于二硫化钼纳米球悬浮液中，超声处理60min，快速注入5 mL、10mmol/L的抗坏血酸溶液，快速倒置30s，静置6h，离心、水洗，将棕色沉淀物在室温下干燥，得到钯掺杂二硫化钼纳米球。
（2）电化学免疫传感器的制备
1）玻碳电极经Al2O3粉打磨至镜面，用超纯水彻底清洗干净；
2） 将6μL浓度为1.5 mg/mL的钯掺杂二硫化钼纳米球溶液滴加到电极表面，4ºC下干燥；
3）继续滴加6μL浓度为9μg/mL的N末端B型利钠肽原抗体溶液于电极表面，4ºC保存至干燥；
4）继续滴加3μL质量分数为0.8%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH为7.4的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，4ºC晾干；
5）分别滴加6μL不同浓度的N末端B型利钠肽原于上述电极表面，4ºC下孵化30min，用pH为7.4的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，4ºC晾干。
实施例3一种基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1）钯掺杂二硫化钼纳米球的制备
1）将1.5 mmol四水合钼酸铵，20 mmol硫脲和0.015 mmol聚乙烯吡咯烷酮依次加入到35 mL超纯水中，磁力搅拌形成均一溶液A；
2）将溶液A转移到高温反应釜中，在220ºC条件下，反应18h，离心分离，分别用超纯水，无水乙醇洗涤以除去杂质，将产物置于冷冻干燥机中冻干，制得二硫化钼纳米球；
3）将70 mmol十六烷基三甲基溴化铵溶解在10mL超纯水中，超声20 min，得到均匀溶液B；然后将5 mg二硫化钼纳米球加入到溶液中B中，混合溶液变成灰黑色，持续超声20min，制得十六烷基三甲基溴化铵改性的二硫化钼纳米球；
4）将40 mL 1mmol/L的H2PdCl4溶液置于二硫化钼纳米球悬浮液中，超声处理60min，快速注入8 mL、10mmol/L的抗坏血酸溶液，快速倒置40s，静置6h，离心、水洗，将棕色沉淀物在室温下干燥，得到钯掺杂二硫化钼纳米球。
（2）电化学免疫传感器的制备
1）玻碳电极经Al2O3粉打磨至镜面，用超纯水彻底清洗干净；
2）将6μL浓度为2.5 mg/mL的钯掺杂二硫化钼纳米球溶液滴加到电极表面，4ºC下干燥；
3）继续滴加6μL浓度为12μg/mL的N末端B型利钠肽原抗体溶液于电极表面，4ºC保存至干燥；
4）继续滴加3μL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH为7.4的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，4ºC晾干；
5）分别滴加6μL不同浓度的N末端B型利钠肽原于上述电极表面，4ºC下孵化40min，用pH为7.4的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，4ºC晾干。
实施例4电化学免疫传感器作为N末端B型利钠肽原检测的应用，检测步骤如下：
（1）将电化学免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，使用10mL、pH为8.04缓冲溶液，制备电化学工作站，并将其和化学发光检测仪连接在一起进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
实施例5实施例1-3所述的基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器，按照实施例4的步骤，用于N末端B型利钠肽原的检测，测线性范围为0.01~100.0ng/mL，检测限为3.3 pg/mL，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。

Claims (4)

1.一种基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）钯掺杂二硫化钼纳米球的制备
1) 将0.5~1.5 mmol四水合钼酸铵，10~20 mmol硫脲和0.005~0.015 mmol聚乙烯吡咯烷酮依次加入到35 mL超纯水中，磁力搅拌形成均一溶液A；
2）将溶液A转移到高温反应釜中，在220ºC条件下，反应18h，离心分离，分别用超纯水，无水乙醇洗涤以除去杂质，将产物置于冷冻干燥机中冻干，制得二硫化钼纳米球；
3）将30~70 mmol十六烷基三甲基溴化铵溶解在10mL超纯水中，超声10~20 min，得到均匀溶液B；然后将1~5 mg二硫化钼纳米球加入到溶液中B中，混合溶液变成灰黑色，持续超声10~20 min，制得十六烷基三甲基溴化铵改性的二硫化钼纳米球；
4) 将10~40 mL、1mmol/L的H2PdCl4溶液置于二硫化钼纳米球悬浮液中，超声处理60min，快速注入2~8 mL、10mmol/L的抗坏血酸溶液，快速倒置20~40s，静置6h，离心、水洗，将棕色沉淀物在室温下干燥，得到钯掺杂二硫化钼纳米球；
（2）电化学免疫传感器的制备
1）玻碳电极经Al2O3粉打磨至镜面，用超纯水彻底清洗干净；
2）将6μL浓度为0.5~2.5 mg/mL的钯掺杂二硫化钼纳米球溶液滴加到电极表面，4ºC下干燥；
3）继续滴加6μL浓度为6~12μg/mL的N末端B型利钠肽原抗体溶液于电极表面，4ºC保存至干燥；
4）继续滴加3μL质量分数为0.5~1%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH为7.4的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，4ºC晾干；
5）分别滴加6μL不同浓度的N末端B型利钠肽原于上述电极表面，4ºC下孵化20~40min，用pH为7.4的PBS缓冲溶液冲洗电极表面，4ºC晾干。
2.根据权利要求1所述的一种基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，通过水热法一步合成了二硫化钼纳米球，然后用阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵对其改性，并运用原位还原法使钯纳米粒子均匀分布改性的二硫化钼纳米球上。
3.根据权利要求1所述的制备方法制备的一种基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器，其特征在于，所述电化学免疫传感器能够用于N末端B型利钠肽原的检测。
4.根据权利要求1所述的一种基于钯掺杂二硫化钼纳米球的电化学免疫传感器的制备方法制备的电化学免疫传感器，其特征在于，所述电化学免疫传感器用于N末端B型利钠肽原的检测，检测步骤如下：
（1）将饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.0 ~ 8.04磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH = 7.4磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；
（4）将待测的N末端B型利钠肽原样品溶液代替N末端B型利钠肽原抗原标准溶液进行检测。
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