CN114966023A - 基于压电效应和lspr效应协同增强的光电化学免疫分析方法 - Google Patents

基于压电效应和lspr效应协同增强的光电化学免疫分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于压电效应和局域表面等离子体共振（LSPR）效应协同增强的光电化学免疫分析方法，其是将具有LSPR效应的Ag纳米粒子和具有压电性质的NaNbO3钙钛矿材料复合形成异质结构，然后将其滴涂在丝网印刷电极工作区域制成光电传感电极，再利用含PSA的三明治型免疫复合物氧化葡萄糖，并将所得反应液加入由光电传感电极构建的光电检测池中构成光电化学生物传感器并进行检测。本发明通过夹心免疫识别过程，可实现对前列腺目标特异性抗原PSA的高灵敏检测。

Description

基于压电效应和LSPR效应协同增强的光电化学免疫分析方法
技术领域
本发明属于纳米材料和生物分析技术领域，具体涉及一种基于压电效应和局域表面等离子体共振效应（LSPR）协同增强的光电化学免疫分析方法。
背景技术
随着生物医学研究的深入和对早期治疗需求的不断增长，专业医疗保健人员甚至居民为满足日常健康监测需求，对癌症相关的疾病检测提出了更高标准。常见的免疫分析方法，例如ELISA、电化学、荧光和拉曼检测等，因存在着诸如设备昂贵、操作繁琐以及需要专业人员等不足，限制了它们的应用范围。光电化学（PEC）作为电化学的一个重要分支，由于其低背景值、高灵敏度和简便的操作，有望成为即时检测（POC）的主流方法。尽管新的PEC检测策略迅速发展，但PEC生物传感器的商业应用仍然稀缺，仍面临着严峻挑战，这主要归因于PEC测试系统的小型化策略的选择。目前，主流的测试系统依赖于光源、电化学工作站和信号显示系统（通常是电脑），这限制了其在POC测试领域的进一步发展。因此，需要重新探究并发展小型化的PEC生物测试工作平台。
电极材料作为PEC传感器的重要部分，其体相中的光电子和空穴转移效率直接影响了PEC传感器的高效性。通常，研究人员通过构建p-n结、均质结或半导体表面极性修饰来提高PEC效率，重要的是，在半导体内部构建内置电场被认为是有效分离光生电子和空穴的最有效方法。NaNbO3作为一种优异的PEC光电极材料，在室温下表现为n型半导体和压电特性。此外，它还具有优异的化学稳定性和高的电荷载体迁移率，后者主要是由于在自发的压电电场条件下发生电子和空穴的定向转移。特别是，贵金属的局域表面等离子体共振效应（LSPR）有助于提高压电半导体的光学和电化学性能，这是一类新兴的PEC增强模式。然而，在现有的报道中没有发现任何关于此类材料的相关研究。
发明内容
基于以上背景，本发明的目的在于提供一种基于压电效应和表面等离子共振（LSPR）效应协同增强的光电化学（PEC）免疫分析方法，其能够实现对前列腺目标特异性抗原PSA的高灵敏检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于压电效应和局域表面等离子体共振效应协同增强的光电化学免疫分析方法，是用于前列腺目标特异性抗原PSA的检测，其包括如下步骤：
1）Ag/NaNbO3异质结复合材料的制备
a）压电相NaNbO3钙钛矿光电材料的制备：将1.2 mmol的Nb2O5溶解于40 mL去离子水中，加入一定量固体氢氧化钠调节pH值至13左右，温和搅拌2 h，使Nb2O5在碱性条件下水解，然后将所得白色浑浊液转移到100 mL内衬为聚四氟乙烯的水热反应器中，并在150℃烘箱中热处理48 h，合成纳米立方体NaNbO3；产物用去离子水和乙醇洗涤几次，离心收集；
b）一步水热法制备Ag掺杂NaNbO3纳米粒子：将制备的NaNbO3配制成2 mg·mL-1的铌酸钠水溶液，然后取50mL，加入0.074 g柠檬酸三钠和5 mL、5 mM的硝酸银水溶液，加热至70 ℃后逐滴加入4 mL、0.1 mol/L的硼氢化钠溶液，待混合液颜色从棕色变成墨绿色直至变成黑色，表明反应结束，再将得到的混浊溶液离心洗涤，烘干，得到Ag/NaNbO3异质结复合材料；
2）利用Ag/NaNbO3异质结复合材料制备光电传感电极
将所得Ag/NaNbO3异质结复合材料制成10 mg/mL的Ag/NaNbO3溶液，取20 μL滴涂于丝网印刷电极的工作区域（直径为4 mm），并于60 ℃烘干，重复滴涂三次后，再经10 min超声作用，诱导Ag/NaNbO3异质结复合材料的偶极子进行定向排列，制得光电传感电极；
3）含PSA的三明治型免疫复合物的制备
a）捕获抗体包被酶联免疫微孔板（ELISA）的制备：在含有碳酸钠缓冲液（0.05 M、pH 9.6）的高亲和96孔微孔板中每孔加入50 μL的捕获抗体mAb1溶液（10 μg·mL-1），4 ℃下孵育24 h，然后用含0.05 %（v/v）吐温20的PBA缓冲液（pH 7.4）洗涤3次，随后每孔添加300μL的封闭缓冲液孵育1h，完成微孔板的制备；
b）葡萄糖氧化酶和检测抗体偶联AuNP（GOx-AuNPs-mAb2）的制备：先在5.0 mL胶体金溶液（5.0 ng·mL-1）中加入0.1 M的Na2CO3水溶液以调节pH至9.5，然后加入200 μL葡萄糖氧化酶（GOx）溶液（0.5 mg·mL-1）和50 μL的捕获抗体mAb2溶液（0.5 mg mL-1），室温下温和振荡60 min，再加入100 μL聚乙二醇溶液（1.0 wt%），4 ℃下混合孵育12 h后，在4 ℃下13000 g离心10 min，获得GOx-AuNP-mAb2偶联物，将其分散于2 mM碳酸钠溶液中，得到含金纳米颗粒25 ng·mL-1的偶联物悬浊液，4 ℃保存；
c）三明治型免疫复合物的制备：将50 μL含PSA的标准品溶液或样品溶液加入到步骤a）制备的微孔板中，在37℃下孵育40 min，继续加入50µL步骤b）制备的偶联物悬浊液，37℃下振荡孵育40 min，形成三明治型免疫复合物；
4）光电化学生物传感器的构建及检测
在步骤3）所得三明治型免疫复合物中加入110 µL含有4mM葡萄糖的PBS缓冲液（50mM、pH 6.5），在37℃下反应12 min，使葡萄糖氧化生成D-葡萄糖-β-内酯和过氧化氢，然后取50 µL加入到利用光电传感电极制备的光电检测池中，以小型手持式紫外线发射器为光源、便携式电流表为信号读出装置构建光电化学生物传感器并进行光电检测。
步骤2）所述超声选取最大功率（200W）的90 %。
步骤3）中a）所述封闭缓冲液为含1.0 wt % BSA的10 mM、pH 7.4的PBS溶液；b）所述碳酸钠溶液中含1.0 wt% BSA和0.1 wt%叠氮化钠，其pH为7.4。
本发明的优点如下：
1. 本发明提供一种压电效应和局域表面等离子体共振效应协同增强的光电化学免疫分析方法，可用于前列腺目标特异性抗原PSA的高灵敏检测。
2. 本发明采用Ag纳米粒子与压电半导体NaNbO3复合材料作为电极材料，由于Ag掺杂导致NaNbO3体相中晶格畸变，使得异质结构价带和导带发生弯曲，这有利于电子和空穴的定向分离；同时，Ag作为一类带隙极窄的掺杂材料，能够诱导更多的自由态电子产生，使得光电信号响应显著增强，因而与单独NaNbO3相比，可展现出稳定的增强型光电流信号。
3. 本发明所提供的分析方法便于集成在微型检测器中，适合于家庭环境和POC的快速测试。
4. 本发明为光电化学免疫分析方法提供了一种新型信号增强模式。
附图说明
图1为本发明基于压电效应和局域表面等离子体共振效应协同增强的光电化学免疫分析方法中，目标PSA在微孔板上的免疫反应示意图（A）、3D打印微器件PEC记录并在智能手机上显示结果的示意图（B）及Ag/NaNbO3复合材料的能级结构和光电子转移示意图（C）。
图2为实施例1所制备的Ag/NaNbO3异质结复合材料的SEM图。
图3为实施例1中对不同浓度PSA进行检测的光电响应图。
图4为实施例1获得的标准工作曲线图。
图5为实施例2中利用NaNbO3钙钛矿光电材料和Ag/NaNbO3复合材料在有无目标PSA存在情况下的光电响应对比图。
图6为实施例3中对不同特异性抗原进行检测的对比情况图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
1．压电相NaNbO3钙钛矿光电材料的制备
1.2 mmol的Nb2O5溶解于40 mL去离子水中，加入一定量固体氢氧化钠调节pH值至13左右，温和搅拌2 h，使Nb2O5在碱性条件下水解，然后将所得白色浑浊液体溶液转移到100mL内衬为聚四氟乙烯的水热反应器中，并在烘箱中进行热处理（150℃、48 h），合成纳米立方体NaNbO3；产物用去离子水和乙醇洗涤几次，离心收集；
2．Ag/NaNbO3异质结复合材料的制备
配制50 mL、2 mg·mL-1的铌酸钠水溶液，加入0.074 g柠檬酸三钠和5 mL、5 mM的硝酸银水溶液，加热至70 ℃；接着，将4 mL，0.1 mol/L的硼氢化钠溶液逐滴加入上述溶液中，待混合液颜色从棕色变成墨绿色直至变成黑色，表明反应结束；再将得到的混浊溶液离心洗涤，烘干，备用。
图2为所得Ag/NaNbO3异质结复合材料的SEM图。由图中可见，所合成的NaNbO3呈立方体状，其表面均匀分布有粒状纳米银颗粒，证明纳米银颗粒与压电NaNbO3成功复合。
3．光电传感电极的制备
采用滴涂法制作电极，取20 μL、10 mg/mL的Ag/NaNbO3溶液滴涂于丝网印刷电极的工作区域（直径为4 mm），60 ℃烘干；重复上述步骤3次，保证电极上材料均一沉积；将超声功率设置为最大功率（200 W）的90%，超声作用10 min，完成压电相的偶极子定向排列。
4．含PSA的三明治型免疫复合物的制备
1）捕获抗体mAb1包被酶联免疫微孔板（ELISA）的制备：将10 μg·mL-1的捕获抗体mAb1溶液加入到含有碳酸钠缓冲液（0.05 M，pH 9.6）的高亲和96孔微孔板上，每孔50 μL，在4 ℃下孵育24 h，然后用含0.05%（v/v）吐温20的PBA缓冲液（pH 7.4）洗涤3次，随后每孔添加300 μL含1.0 wt % BSA的PBS溶液（10 mM、pH 7.4）孵育1h，完成微孔板的制备。
2）葡萄糖氧化酶和检测抗体偶联AuNP（GOx-AuNPs-mAb2）的制备：首先，采用0.1 M的Na2CO3水溶液将胶体金溶液（5.0 mL，5.0 ng·mL-1）调至pH 9.5；接着加入200 μL GOx溶液（0.5 mg·mL-1）和50 μL捕获抗体mAb2溶液（0.5 mg·mL-1），室温下温和振荡60 min，再加入100 μL聚乙二醇溶液（1.0 wt%），在4 ℃下混合孵育12 h；最后，在4 ℃下离心（10 min，13000 g），获得GOx-AuNP-mAb2偶联物，将其分散于1.0 mL含1.0 wt% BSA和0.1 wt%叠氮化钠的2 mM碳酸钠溶液中，得到含金纳米颗粒25 ng·mL-1的偶联物悬浊液，4 ℃保存。
3）将50 μL不同浓度（0.08、0.2、0.5、1、2、4、10、20、50 ng·mL-1）的PSA标准品溶液分别加入到制备好的微孔板中，在37℃下孵育40 min，继续加入50µL制备的偶联物悬浊液（C [Au NP] ≈ 25 ng mL-1），在37℃下振荡孵育40 min，形成三明治型免疫复合物。
5．压电效应和局域表面等离子体共振效应协同增强检测前列腺目标特异性抗原
在所得三明治型免疫复合物中加入110 µL含有4mM葡萄糖的PBS缓冲液（50 mM，pH6.5），在37℃下反应12 min，使葡萄糖被氧化生成D -葡萄糖-β-内酯和过氧化氢；最后，将50 µL包含过氧化氢的反应液加入到利用光电传感电极制备的光电检测池中，以小型手持式紫外线发射器为光源、便携式电流表为信号读出装置构建光电化学生物传感器并进行光电测试，不同浓度PSA的光电流信号响应曲线如图3所示。
由图3可见，不同浓度PSA产生的光电流从0.08 ng mL-1时的1800 nA增加到50 ngmL-1时的近5000 nA，将读取的电流信号经拟合，可得到良好的线性响应（如图4）。
实施例2
将实施例1步骤1、2制备的压电相NaNbO3钙钛矿光电材料和Ag/NaNbO3复合材料分别滴涂于直径为4 mm的丝网印刷电极工作区域制成传感电极并进行光暴露实验，以考察复合材料在等离子体共振效应增强作用下的光电响应情况（目标物PSA浓度为1 ng mL-1），结果见图5。
如图5所示，独立压电相NaNbO3材料在目标PSA存在和不存在的情况下分别显示出约20 nA和35 nA的光电流，这在电流表上根本无法可靠地显示。而在使用Ag/NaNbO3复合材料时则分别显示出约1200 nA和2350 nA的光电流增强信号，这证实由Ag/NaNbO3复合材料构建的压电光电模型在压电效应和LSPR效应协同增强作用下具有良好的光电流响应。
实施例3
将实施例1步骤4 3）中所使用的PSA标准品溶液分别采用CEA、CA-15-3、IgG、AFP、PSA及其混合物（PSA浓度为5 ng mL-1，其他干扰物浓度为50 ng mL-1）进行替代，以考察不同干扰物的响应情况，结果见图5。
如图6所示，不同组分的干扰响应较小，仅在目标PSA存在下能够输出强电流信号，表现出良好的选择性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种基于压电效应和局域表面等离子体共振效应协同增强的光电化学免疫分析方法，其特征在于，所述方法用于前列腺目标特异性抗原PSA的检测，其包括如下步骤：
1）Ag/NaNbO3异质结复合材料的制备；
2）利用Ag/NaNbO3异质结复合材料制备光电传感电极；
3）含PSA的三明治型免疫复合物的制备；
4）光电化学生物传感器的构建及检测。
2.根据权利要求1所述的基于压电效应和局域表面等离子体共振效应协同增强的光电化学免疫分析方法，其特征在于，步骤1）所述Ag/NaNbO3异质结复合材料的制备包括如下步骤：
a）压电相NaNbO3钙钛矿光电材料的制备：将1.2 mmol的Nb2O5溶解于40 mL去离子水中，加入一定量固体氢氧化钠调节pH值至13，温和搅拌2 h，使Nb2O5在碱性条件下水解，然后将所得白色浑浊液转移到100 mL内衬为聚四氟乙烯的水热反应器中，并在150℃烘箱中热处理48 h，合成纳米立方体NaNbO3；产物用去离子水和乙醇洗涤几次，离心收集；
b）一步水热法制备Ag掺杂NaNbO3纳米粒子：将制备的NaNbO3配制成2 mg·mL-1的铌酸钠水溶液，然后取50 mL，加入0.074 g柠檬酸三钠和5 mL、5 mM的硝酸银水溶液，加热至70 ℃后逐滴加入4 mL、0.1 mol/L的硼氢化钠溶液，待混合液颜色从棕色变成墨绿色直至变成黑色，表明反应结束，再将得到的混浊溶液离心洗涤，烘干，得到Ag/NaNbO3异质结复合材料。
3. 根据权利要求1所述的基于压电效应和局域表面等离子体共振效应协同增强的光电化学免疫分析方法，其特征在于，步骤2）所述光电传感电极的制备具体是将Ag/NaNbO3异质结复合材料制成10 mg/mL的Ag/NaNbO3溶液，取20 μL滴涂于丝网印刷电极工作区域，于60 ℃烘干后重复滴涂三次，再在超声作用下诱导Ag/NaNbO3异质结复合材料的偶极子进行定向排列制得。
4. 根据权利要求3所述的基于压电效应和局域表面等离子体共振效应协同增强的光电化学免疫分析方法，其特征在于，所述超声选取最大功率的90 %，超声时间为10 min。
5.根据权利要求1所述的基于压电效应和局域表面等离子体共振效应协同增强的光电化学免疫分析方法，其特征在于，步骤3）所述含PSA的三明治型免疫复合物的制备步骤如下：
a）捕获抗体包被酶联免疫微孔板的制备：在含有0.05 M、pH 9.6的碳酸钠缓冲液的高亲和96孔微孔板中每孔加入50 μL、10 μg·mL-1的捕获抗体mAb1溶液，4 ℃下孵育24 h，然后用含0.05 %（v/v）吐温20、pH 7.4的PBA缓冲液洗涤3次，随后每孔添加300 μL的封闭缓冲液孵育1 h，完成微孔板的制备；
b）葡萄糖氧化酶和检测抗体偶联AuNP的制备：先在5.0 mL、5.0 ng·mL-1的胶体金溶液中加入0.1 M的Na2CO3水溶液，以调节pH至9.5，然后加入200 μL、0.5 mg·mL-1葡萄糖氧化酶溶液和50 μL、0.5 mg mL-1的捕获抗体mAb2溶液，室温下温和振荡60 min，再加入100 μL、1.0 wt%聚乙二醇溶液，4 ℃下混合孵育12 h后，在4 ℃下13000 g离心10 min，获得GOx-AuNP-mAb2偶联物，将其分散于2 mM的碳酸钠溶液中，得到含金纳米颗粒25 ng·mL-1的偶联物悬浊液，4 ℃保存；
c）三明治型免疫复合物的制备：将50 μL含PSA的标准品溶液或样品溶液加入到步骤a）制备的微孔板中，在37℃下孵育40 min，继续加入50µL步骤b）制备的偶联物悬浊液，37℃下振荡孵育40 min，形成三明治型免疫复合物。
6. 根据权利要求5所述的基于压电效应和局域表面等离子体共振效应协同增强的光电化学免疫分析方法，其特征在于，步骤a）中所述封闭缓冲液为含1.0 wt % BSA的10 mM、pH 7.4的PBS溶液；
步骤b）所述碳酸钠溶液中含1.0 wt% BSA和0.1 wt%叠氮化钠，其pH为7.4。
7. 根据权利要求1所述的基于压电效应和局域表面等离子体共振效应协同增强的光电化学免疫分析方法，其特征在于，步骤4）具体是在制备好的三明治型免疫复合物中加入110 µL含有4mM葡萄糖的50 mM、pH 6.5 PBS缓冲液，在37℃下反应12 min，使葡萄糖氧化生成D-葡萄糖-β-内酯和过氧化氢，然后取50 µL加入到利用光电传感电极制备的光电检测池中构成光电化学生物传感器并进行检测。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116794135A (zh) * 2023-06-26 2023-09-22 塔里木大学 一种检测毒死蜱的光电化学免疫传感器及其制备与应用

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