CN116794135A - 一种检测毒死蜱的光电化学免疫传感器及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测毒死蜱的光电化学免疫传感器及其制备与应用，属于农药残留检测技术领域。所述光电化学免疫传感器包括工作电极；所述工作电极通过在基底电极表面修饰Bi₂WO₆‑TiO₂复合纳米材料，然后在Bi₂WO₆‑TiO₂复合纳米材料表面固定毒死蜱抗体，在毒死蜱抗体表面固定毒死蜱抗原，再利用夹心法将葡萄糖氧化酶标记物连接到电极表面获得。该光电化学免疫传感器实现了对毒死蜱的灵敏检测，在0.3V的偏压下，标记在金纳米颗粒上的葡萄糖氧化酶能够催化电解液中的葡萄糖产生大量H₂O₂，极大地增强了光电信号，产生稳定光电流。

Description

一种检测毒死蜱的光电化学免疫传感器及其制备与应用

技术领域

本发明涉及农药残留检测技术领域，特别是涉及一种检测毒死蜱的光电化学免疫传感器及其制备与应用。

背景技术

食品是人类生存的基本保障。随着现代工业化的加快发展，食品工业也迅速崛起，成为经济发展的重要产业支柱。同时，随着人民生活水平的逐步提高，消费观念也发生了转变，消费者在食品安全问题上尤为关注。食品安全问题主要是来自外来污染，主要包括：农药兽药残留、非法添加剂和致病微生物等，其中农药残留最易发生，影响也较大，对食品安全造成重大隐患。

比如毒死蜱残留，毒死蜱作为一种广谱性有机磷杀虫剂，常用于果蔬害虫防治中。但因其具有良好的杀虫效果，在许多果蔬中残留仍然超标严重。大量研究发现毒死蜱能够抑制乙酰胆碱酯酶活性，若误食入人体，会引起呼吸困难、抽搐、致畸和致死等危险情况。据文献报道，毒死蜱可引起内脏功能受损、肠道微生物种群破坏，甚至具有遗传毒性。近年来，毒死蜱的安全问题引起了越来越多的关注，国际中对毒死蜱的残留限量标准日益苛刻。面对这样的现状，开发快速、准确、灵敏、廉价、操作简便的毒死蜱分析技术，来实时监测食品质量安全已成为刻不容缓的任务。

目前，检测食品中的毒死蜱残留主要是依靠传统的常规分析技术，例如高效液相色谱法、气相色谱法和质谱法。这些方法在检测过程中，样品前处理繁琐耗时，还需专业人员操作，而且检测费用昂贵。种种不利条件，催生出许多另辟蹊径的高效检测设备，比如传感器的问世。依据自身体积小、反应灵敏、成本低、操作方便等优势，打破了传统方法的局限。再通过结合酶、抗体、适配体等特异性生物活性分子，进一步扩大其分析性能。但是对毒死蜱进行检测的传感器仍然较少，因此，开发一种能快速有效检测毒死蜱残留，且检测性能优异的传感器十分必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测毒死蜱的光电化学免疫传感器及其制备与应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明的技术方案之一：一种检测毒死蜱(CPF)的光电化学免疫传感器，包括工作电极；所述工作电极通过在基底电极表面修饰Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料，然后在Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料表面固定毒死蜱抗体，在毒死蜱抗体表面固定毒死蜱抗原，再利用夹心法将葡萄糖氧化酶标记物连接到电极表面获得。

进一步地，所述光电化学免疫传感器为一种钨酸铋/二氧化钛纳米光电化学免疫传感器。

进一步地，所述基底电极为ITO玻璃电极。

进一步地，所述检测毒死蜱(CPF)的光电化学免疫传感器还包括参比电极和对电极，所述参比电极为Ag/AgCl(3.0M KCl)电极，所述对电极为铂电极。

进一步地，所述Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料的制备方法为：将钨盐溶于丙三醇中，搅拌0.5-1h后，再加入TiO₂纳米材料，得到溶液A；将铋盐溶于乙二醇中搅拌0.5-1h，得到溶液B；在搅拌的情况下，将溶液B滴加到溶液A中，滴加完毕后先搅拌0.5-1h，再加入无水乙醇继续搅拌0.5-1h，得到混合溶液；将所述混合溶液在155-165℃的温度下进行10-14h的溶剂热反应；反应完毕后烘干，焙烧，得到所述Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料。

进一步地，制备溶液A时，钨盐与丙三醇的用量比为1mol:250-300mL，钨盐与TiO₂纳米材料的摩尔用量比为1:165-170；制备溶液B时，铋盐与乙二醇的用量比为1mol:250-300mL；钨盐与铋盐的摩尔用量比为1:1-1.02。

进一步地，所述钨盐为Na₂WO₄，所述铋盐为Bi(NO₃)₃。

进一步地，所述Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料中Bi₂WO₆的质量含量为5％，据此计算制备Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料过程中所需Na₂WO₄、Bi(NO₃)₃和TiO₂纳米材料的用量比。

进一步地，所述焙烧的温度为400℃，时间为4h。

进一步地，所述TiO₂纳米材料的制备方法为：在无水乙醇中加入钛酸丁酯，磁力搅拌0.5h，得到钛酸丁酯溶液；再将超纯水加入到无水乙醇中，搅拌10min，配制成水醇液；在搅拌下将水醇液缓慢滴入钛酸丁酯溶液中，当溶液有白色絮凝物出现时，停止滴入；将上述溶液在40℃下恒温搅拌过夜；搅拌结束后，用超纯水洗涤、过滤，所得固体产物在80℃下烘干2h，干燥后550℃下煅烧3h，冷却，得到所述TiO₂纳米材料。

进一步地，所述钛酸丁酯与无水乙醇的用量比为0.01mol：30mL；所述超纯水与无水乙醇的体积比为0.7:20。

进一步地，所述葡萄糖氧化酶标记物为Ab₂-AuNPs-GOD(葡萄糖氧化酶)生物共轭体，所述Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体的制备方法为：将氯金酸溶液加入水中，加热搅拌至开始沸腾，然后加入柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌反应20-30min，冷却，得到AuNPs溶液；将所述AuNPs溶液离心浓缩，去除上清液，在沉淀中加入Ab₂溶液和GOD(葡萄糖氧化酶)的PBS溶液，振荡1-3h，加入BSA(牛血清蛋白)溶液封闭1-2h；然后离心，去除上清液，将沉淀洗涤离心，得到所述Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体；将所述Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体分散到PBS溶液中，得到Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体溶液，保存。

进一步地，所述氯金酸溶液的浓度为1wt％，柠檬酸三钠溶液的浓度为1wt％；所述Ab₂溶液的浓度为1mg/mL；所述GOD的PBS溶液中GOD的浓度为6mg/mL，PBS的浓度为0.01M；所述BAS溶液的浓度为1wt％；按体积比计，氯金酸溶液：柠檬酸三钠溶液：Ab₂溶液：GOD的PBS溶液：BSA溶液＝0.5mL:1mL:40μL:100μL:100μL。

进一步地，所述氯金酸溶液与水的体积比为1:100。

进一步地，所述在基底电极表面修饰Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料，然后在Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料表面固定毒死蜱抗体，在毒死蜱抗体表面固定毒死蜱抗原，再利用夹心法将葡萄糖氧化酶标记物连接到电极表面即为：在基底电极ITO玻璃电极表面修饰Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料，然后在Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料表面固定毒死蜱抗体，得到BSA/Ab₁/Bi₂WO₆-TiO₂/ITO光电极，然后以BSA/Ab₁/Bi₂WO₆-TiO₂/ITO光电极为免疫探针，利用夹心法将葡萄糖氧化酶标记物(Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体)连接到电极表面。

本发明的技术方案之二：一种利用上述检测毒死蜱的光电化学免疫传感器检测毒死蜱的方法，包括以下步骤：

(1)制备检测毒死蜱的光电化学免疫传感器的工作电极：

在基底电极表面修饰Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料，然后在Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料表面固定毒死蜱抗体，在毒死蜱抗体表面固定不同浓度的毒死蜱抗原标准溶液，再利用夹心法将葡萄糖氧化酶标记物连接到电极表面获得固定有不同浓度毒死蜱抗原的工作电极；

(2)绘制工作曲线：

将工作电极与参比电极和对电极构成三电极系统，以PBS溶液为电解质溶液，分别对步骤(1)中得到的固定有不同浓度毒死蜱抗原的工作电极进行PEC(光电化学)免疫检测，打开光源，待光电流响应稳定后，在电解液中加入葡萄糖溶液，测试光电流值，加入葡萄糖溶液后测得的光电流值与毒死蜱抗原标准溶液浓度的对数呈线性关系，以毒死蜱抗原标准溶液浓度的对数为横坐标，光电流值为纵坐标绘制工作曲线；

(3)果蔬中毒死蜱的检测：用待测果蔬样品溶液代替步骤(1)中的毒死蜱抗原标准溶液制备工作电极，按照步骤(2)进行PEC免疫检测，根据得到的光电流值和工作曲线得到待测果蔬中毒死蜱的含量。

进一步地，步骤(1)所述制备检测毒死蜱的光电化学免疫传感器的工作电极的方法，具体包括以下步骤：

(a)将Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料分散在Nafion溶液和无水乙醇的混合溶液中，得到悬浮液；将所述悬浮液滴涂修饰于ITO电极表面，干燥，得到Bi₂WO₆-TiO₂/ITO光电极；

(b)在Bi₂WO₆-TiO₂/ITO光电极表面滴涂壳聚糖溶液，烘干，洗涤，干燥，继续滴涂戊二醛溶液，室温下反应2h，洗涤，干燥；然后滴涂Ab₁溶液，4℃下反应12h，并用免疫清洗液清洗；最后滴涂BSA溶液，37℃孵育20min，并用免疫清洗液清洗，得到固定有毒死蜱抗体的BSA/Ab₁/Bi₂WO₆-TiO₂/ITO免疫探针；

(c)在BSA/Ab₁/Bi₂WO₆-TiO₂/ITO免疫探针表面分别滴涂不同浓度的毒死蜱抗原标准溶液，于探针上孵育，用免疫清洗液清洗；继续滴涂Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体溶液，孵育，再用免疫清洗液清洗并干燥，得到固定有不同浓度毒死蜱抗原的工作电极(钨酸铋/二氧化钛纳米光电化学免疫传感器的工作电极)；

进一步地，步骤(c)中所述不同浓度的毒死蜱抗原标准溶液为浓度分别为0.01、0.25、1、5μg/mL的毒死蜱抗原标准溶液，滴涂量为20μL；所述Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体溶液的滴涂量为20μL；所述滴涂不同浓度的毒死蜱抗原标准溶液后和滴涂Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体溶液后孵育的条件均是孵育温度为35℃，孵育时间为45min。

进一步地，步骤(a)中所述悬浮液的滴涂量为100μL；步骤(b)中所述壳聚糖溶液的浓度为0.08wt％，滴涂量为20μL，所述戊二醛溶液的浓度为0.25wt％，滴涂量为20μL，所述Ab₁溶液的浓度为100μg/mL，滴涂量为20μL，所述BSA溶液的浓度为2wt％，滴涂量为20μL。

进一步地，步骤(a)中所述Nafion溶液和无水乙醇的混合溶液由Nafion溶液(5wt％)和无水乙醇按1:5的体积比混合而成；所述Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料与Nafion溶液和无水乙醇的混合溶液的用量比为20mg:1mL；所述ITO玻璃电极在使用前依次用丙酮、无水乙醇和超纯水分别超声清洗30min。

进一步地，步骤(b)和步骤(c)中所述免疫清洗液均为吐温-20(0.05wt％)。

进一步地，步骤(2)中所述打开光源，待光电流响应稳定后，在电解液中加入葡萄糖溶液，测试光电流值的具体操作为：每次间隔20s打开光源，每三次记为一组，直至前后两组电流大小相同时，加入葡萄糖溶液，再测一组光电流值。

进一步地，所述PEC免疫检测的条件为：电解液pH值为7.4，偏压为0.3V。

进一步地，所述PEC免疫检测过程中加入葡萄糖溶液后电解液中葡萄糖的浓度为10mmoL/L。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明以TiO₂/Bi₂WO₆纳米复合材料修饰基底电极，通过在TiO₂/Bi₂WO₆纳米复合材料表面固定毒死蜱抗体，进行抗体-抗原-标记抗体的免疫夹心反应，在光照条件下，检测果蔬中的毒死蜱含量。Bi₂WO₆与TiO₂的复合，扩宽了光吸收范围，提高了光电子的传递效率。

(2)本发明制备了葡萄糖氧化酶和二抗共同标记在金纳米颗粒上的Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体，并以BSA/Ab₁/Bi₂WO₆-TiO₂/ITO为免疫探针，利用夹心法将可以放大信号的葡萄糖氧化酶标记物(Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体)连接到电极表面构建了一种通过葡萄糖氧化酶放大光电信号的光电化学免疫传感器，实现了对毒死蜱的灵敏检测。在0.3V的偏压下，标记在金纳米颗粒上的葡萄糖氧化酶能够催化电解液中的葡萄糖产生大量H₂O₂，极大地增强了光电信号，产生稳定光电流。

(3)本发明还考察了影响光电信号产生大小的因素，并对光电化学免疫传感器的分析性能进行优化，得到最佳检测条件为：偏压为0.3V、孵育温度为35℃、孵育时间为45min和电解液pH值为7.4。在此条件下，建立了标准曲线，线性回归方程为y＝4.556LgC_CPF+5.282，相关系数为0.9985，对毒死蜱残留的检测范围为0.1-5μg/mL，最低检出限为0.03μg/mL。本发明基于免疫夹心法构建的光电化学免疫传感器对毒死蜱检测表现出了高的灵敏度。为食品安全检测提供了一种新的检测方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中BSA/Ab₁/Bi₂WO₆-TiO₂/ITO免疫探针的构建流程示意图；

图2为本发明光电化学免疫传感器的检测原理示意图；

图3为对本发明的光电化学免疫传感器检测条件的优化结果，其中(a)为偏压、(b)为孵育时间、(c)为孵育温度、(d)为pH值；

图4为本发明实施例1制得的光电化学免疫传感器工作电极的检测结果，其中，(a)为PEC免疫传感器在不同浓度的毒死蜱抗原下产生的光电流，其中a-e浓度分别为0.1、0.25、0.5、1、5μg/mL，(b)为光电流值与毒死蜱浓度的标准曲线；

图5为TiO₂、Bi₂WO₆和Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料的XRD图谱；

图6为TiO₂、Bi₂WO₆和Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料的SEM图，(a)为TiO₂、(b)为Bi₂WO₆、(c)为5％Bi₂WO₆-TiO₂(Lowfold，低倍率)、(d)为5％Bi₂WO₆-TiO₂(Highfold，高倍率)；

图7为不同纳米材料(TiO₂、Bi₂WO₆和Bi₂WO₆-TiO₂)的紫外可见光谱(UV-vis)，其中，(a)为三种纳米材料的UV-vis漫反射光谱、(b)为三种纳米材料的光学带隙能量；

图8为不同纳米材料(TiO₂、Bi₂WO₆和Bi₂WO₆-TiO₂)在光照下的电流-时间曲线；

图9为金纳米颗粒和Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体的TEM图像，其中，(c)、(d)是金纳米颗粒在不同放大倍数下的TEM形貌图；(a)、(b)为Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体在不同放大倍数下的TEM形貌图；

图10为不同物质的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为葡萄糖氧化酶和二抗混合物；b为金纳米颗粒；c为Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体；

图11为本发明的光电化学免疫传感器的特异性测试结果；

图12为本发明的光电化学免疫传感器的稳定性和重现性测试结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

光电化学免疫传感器的制备

(1)TiO₂纳米材料的制备(采用溶胶-凝胶法)：

在30mL无水乙醇中加入0.01mol的钛酸丁酯，磁力搅拌0.5h，得到钛酸丁酯溶液；再将0.7mL的超纯水加入到20mL无水乙醇中，搅拌10min，配制成水醇液；在搅拌下将水醇液缓慢滴入钛酸丁酯溶液中，当溶液有白色絮凝物出现时(约滴入水醇液2mL时)，停止滴入；将上述溶液在40℃下恒温搅拌过夜；搅拌结束后，用超纯水洗涤、过滤，所得固体产物在80℃下烘干2h，干燥后转移至马弗炉中在550℃下煅烧3h，冷却，即得TiO₂纳米材料。

(2)Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料的制备(采用溶剂热法)：

将0.0251g的Na₂WO₄·2H₂O溶解于20mL丙三醇中，搅拌30min后，再添加1g步骤(1)制得的TiO₂纳米材料，得到溶液A；将0.0375g的Bi(NO₃)₃·5H₂O溶于20mL的乙二醇，进行30min的搅拌，得到溶液B；在搅拌的情况下，将溶液B滴加到溶液A中，搅拌30min，然后添加40mL的无水乙醇，搅拌30min，得到混合溶液；将该混合液输送到100mL聚四氟乙烯的水热式反应器中，在160℃下进行12h的水热反应；水热反应产物在80℃条件下烘干10h后，在400℃条件下焙烧4h，得到Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料，其中Bi₂WO₆的质量含量为5％。

(3)Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体的制备

在100mL的锥形瓶中加入50mL的超纯水，用移液枪移取0.5mL的氯金酸(1wt％)溶液，加热搅拌，当溶液开始沸腾时迅速加入1mL柠檬酸三钠(1wt％)溶液，溶液颜色由无色-灰色-酒红色，继续搅拌，20min后停止反应，冷却至室温，得到AuNPs溶液；

将制得的AuNPs溶液离心浓缩，去除上清液，然后加入40μLAb₂(1mg/mL)和100μLGOD(6mg/mL)的PBS(0.01M，pH＝7.4)溶液，得到混合溶液，该混合溶液于室温下温和振荡2h，然后加入100μL 1wt％BSA溶液进行封闭1h。混合溶液在12000rpm下离心10min，去除上清液；加入PBS(0.01M，pH＝7.4)溶液进行清洗，然后再离心，得到的沉淀即为Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体；将上述沉淀分散于1mL PBS(0.01M，pH＝7.4)中，得到Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体溶液，于4℃下保存。

(4)光电化学免疫传感器工作电极的制备：

(a)Bi₂WO₆-TiO₂/ITO光电极的制备：

ITO玻璃电极依次用丙酮、无水乙醇和超纯水分别超声清洗30min，自然晾干，备用；称取Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料20mg，将其分散在1mLNafion溶液和无水乙醇的混合溶液中(该混合溶液由5wt％Nafion溶液和无水乙醇按1:5的体积比混合而成，即按体积比计，5wt％Nafion溶液:无水乙醇＝1:5)，在25℃超声水浴中超声分散30min，得到悬浮液；然后用移液枪多次少量地量取100μL上述悬浮液滴涂修饰于ITO电极表面，50℃干燥；得到Bi₂WO₆-TiO₂/ITO光电极，最后放置4℃环境备用。

(b)BSA/Ab₁/Bi₂WO₆-TiO₂/ITO免疫探针的构建(构建流程示意图如图1所示)

在Bi₂WO₆-TiO₂/ITO表面滴涂20μL壳聚糖溶液(0.08wt％)，50℃烘干，依次用0.1mol/LNaOH溶液和超纯水洗涤，室温下干燥。继续滴涂20μL 0.25wt％戊二醛溶液，室温下反应2h，用去离子水洗涤并干燥，然后滴涂20μLAb₁溶液(100μg/mL)，置于4℃下反应12h，并用免疫清洗液吐温-20(0.05wt％)清洗电极，除去未反应的Ab₁。最后滴涂20μL BSA溶液(2wt％)37℃孵育20min，以封闭电极表面的非特异性吸附位点，并用免疫清洗液吐温-20(0.05wt％)清洗，得到BSA/Ab₁/Bi₂WO₆-TiO₂/ITO免疫探针，于4℃下保存备用。

(c)Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体的连接

在BSA/Ab₁/Bi₂WO₆-TiO₂/ITO免疫探针表面分别滴涂20μL待测浓度(0.1、0.25、0.5、1、5μg/mL)的毒死蜱抗原标准溶液，于探针上孵育(孵育温度为35℃，孵育时间为45min)，并用免疫清洗液吐温-20(0.05wt％)清洗；继续滴涂20μLAb₂-AuNPs-GOD生物共轭体溶液，孵育(孵育温度为35℃，孵育时间为45min)，再用免疫清洗液吐温-20(0.05wt％)清洗并干燥，得到固定有不同浓度的毒死蜱抗原标准溶液的光电化学免疫传感器。

应用例1

通过光电化学(PEC)免疫分析对光电化学免疫传感器进行检测并绘制工作曲线

检测方法：构建三电极系统，用的工作电极为实施例1制得的固定有不同浓度毒死蜱抗原标准溶液的光电化学免疫传感器的工作电极，参比电极是Ag/AgCl(3.0M KCl)电极，对电极为铂电极。将工作电极固定到电解池中，使其背面正对光源，加入40mLPBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4)作为电解液，再将三电极体系与电化学工作站相连，进行PEC免疫检测，即在室温下，用电流-时间法测定电流大小，每次间隔20s打开光源，每三次记为一组，直至前后两组光电流值大小近似相同时，加入葡萄糖溶液(10mmoL/L，此浓度是指加入葡萄糖溶液后电解液中葡萄糖的浓度)，再测一组光电流值，加入葡萄糖溶液后测得的光电流值与毒死蜱抗原标准溶液浓度的对数呈线性关系，以毒死蜱抗原标准溶液浓度的对数为横坐标，光电流值为纵坐标绘制工作曲线。

检测原理：本发明的光电化学免疫传感器的检测原理示意图如图2所示，当工作电极浸入含葡萄糖的电解液中，电极上的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生产葡萄糖酸内酯和H₂O₂，在光照前，施加一定偏压后，H₂O₂可作为电子供体源源不断地补充到纳米材料的导带中，产生稳定的光电流。因此，光电化学免疫传感器中光电信号的大小取决于所固定葡萄糖氧化酶的量，而葡萄糖氧化酶与二抗被共同标记到金纳米颗粒上，由于抗原与抗体之间的特异性反应，葡萄糖氧化酶的固定量又取决于抗原的固定量，通过电化学工作站的灵敏显示，最终得到电信号与抗原之间的关系。

检测条件优化：

图3所示为对光电化学免疫传感器检测条件的优化，其中(a)为偏压、(b)为孵育时间、(c)为孵育温度、(d)为pH值。为了探索PEC免疫传感器的最佳性能，对偏压、孵育时间、孵育温育以及pH四个因素进行了优化。偏压是影响光电流大小的重要因素之一，如图3(a)，当偏压在0到0.5V时，光电流随偏压的增大而增大，但在0到0.3V中，光电流增速较快，0.3到0.5V时，光电流增速缓慢并趋于稳定，因此，选择0.3V为最佳偏压(此优化试验样品是利用实施例1的制备步骤，通过改变抗原标准溶液浓度和步骤(c)的孵育条件制备的孵育条件为37℃孵育30min(两次孵育条件相同)，抗原标准溶液浓度为0.2μg/mL的光电化学免疫传感器工作电极)。

其次，抗体与抗原之间的孵育时间和孵育温度会影响到一抗与抗原、抗原与二抗之间的结合效率，从而直接影响到光电流的大小。如图3(b)所示，当孵育时间从20min逐渐延加到45min时，光电流也在逐渐增大。当孵育时间超过45min，光电流不再增大并且有下降的趋势，原因可能是在孵育过程中抗原抗体结合达到饱和，以及孵育时间太久会使少量抗体出现失活。在图3(c)中，随着孵育温度由20℃升高至35℃时，光电流也随之增大并到达最高点。当温度超过35℃继续升高时，光电流开始呈下降趋势(此优化试验样品是通过实施例1的制备方法，根据图3(b)和图3(c)要探究的孵育条件重新制备的一系列光电化学免疫传感器工作电极)。原因是孵育温度会影响抗体和酶的活性，在抗体与抗原结合过程和酶的催化过程产生影响，导致光电流的减弱。因此，选择最佳孵育时间为45min、最佳孵育温度为35℃。

在PEC免疫传感器中，电解液的pH会对抗体和酶的活性产生影响，过酸过碱都不利于光电流的产生。如图3(d)所示，当电解液pH值从5.5升至7.4时，光电流随pH值的增大而增大，当pH值大于7.4时，光电流信号开始减弱。说明电极上修饰的抗体和酶在电解液pH值为7.4时，表现出较强的活性。因此，选择电解液最佳pH值为7.4。

检测结果：

在以上确定的最佳检测条件下对实施例1制得的固定有不同浓度毒死蜱抗原标准溶液的光电化学免疫传感器工作电极进行检测，以毒死蜱抗原标准溶液浓度的对数为横坐标，光电流值(光电流响应值)为纵坐标绘制工作曲线，制得的工作曲线如图4所示，其中(a)为PEC免疫传感器在不同浓度的毒死蜱抗原下产生的光电流，其中a-e浓度分别为0.1、0.25、0.5、1、5μg/mL，(b)为光电流值与毒死蜱浓度的标准曲线。如图4(a)中，随着毒死蜱抗原浓度的增加，通过免疫结合到电极表面的葡萄糖氧化酶也逐渐增多，催化更多的底物产生H₂O₂，及时补充空穴，促进光生电子快速传递，产生更强的光电流。图4(b)显示出光电流响应值与毒死蜱浓度呈良好的线性关系，其线性回归方程为y＝4.556LgC_CPF+5.282，相关系数为0.9985，检测范围为0.1-5μg/mL，最低检出限为0.03μg/mL(3倍信噪比)。

应用例2

实际样品中毒死蜱的检测

(1)样品的制备：

A组试验样品：A组试验样品为从塔里木超市购买的5种果蔬(苹果、梨、西红柿、白萝卜、波菜)，将5种果蔬(苹果、梨、西红柿、白萝卜、波菜)切碎，各取50.00g样品3份，置于300mL烧杯中，加入50mL水和100mL丙酮，用高速分散机提取2min，匀浆液经布氏漏斗减压抽滤，取滤液100mL移至500mL分液漏斗中。向滤液中加入约12g左右氯化钠使溶液处于饱和状态，猛烈振摇2-3min，静置10min，使丙酮与水相分层，水相用50mL二氯甲烷继续提取。将丙酮与二氯甲烷提取液合并经无水硫酸钠脱水过滤，再用二氯甲烷少量多次洗涤容器和无水硫酸钠，洗涤液并入烧瓶中。用旋转蒸发仪浓缩至2mL，转移至5mL容量瓶中，用PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4)定容至刻度，得到各待测果蔬样品溶液。

B组试验样品：B组试验样品为从农田中收割的喷洒毒死蜱农药30分钟后的韭菜样品，制样过程同A组试验样品，得到3份待测韭菜样品溶液。

(2)光电化学免疫传感器工作电极的制备：

通过实施例1的制备方法，用步骤(1)中得到的各待测果蔬样品溶液代替实施例1步骤(c)中的毒死蜱抗原标准溶液制备工作电极，得到固定有不同待测果蔬样品溶液的光电化学免疫传感器工作电极。

(3)PEC免疫检测

采用50mL石英杯作电解池，电解液为0.01mol/L，pH＝7.4的PBS缓冲液，构建三电极体系，在电化学工作站中进行检测。其中工作电极为步骤(2)制得的固定有不同待测果蔬样品溶液的光电化学免疫传感器工作电极，参比电极为Ag/AgCl，对电极为铂电极。将工作电极放入电解池中，使其背面正对光源，加入40mLPBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4)，再将三电极体系与电化学工作站相连。在室温下，采用电流-时间法测定光电流值，偏压设置为0.3V，间隔20s打开光源，重复三次为一组，当前后两次光电流值近似相同时，加入葡萄糖溶液至电解液中葡萄糖的浓度为10mmoL/L，再测一组光电流值(同应用例1中的检测方法)。根据测得的光电流值，通过图4(b)中得到的线性方程计算待测物的浓度。结果显示，在A组试验样品的五种果蔬里均未检测出毒死蜱，说明A组这五种果蔬样品溶液中没有毒死蜱残留或者毒死蜱残留浓度非常低，小于本发明的光电化学免疫传感器的检出限。B组试验样品(喷洒毒死蜱农药30分钟后的韭菜)检测到的光电流值及根据光电流值和标准曲线中的线性回归方程计算出的毒死蜱浓度如表1所示：

表1

应用例3

应用例2用制备好的光电化学免疫传感器来检测A组试验样品中的五种果蔬中毒死蜱的含量，结果显示，在五种果蔬里均未检测出毒死蜱。因此，使用标准加入法将浓度为0.5、1.0、2.0μg/mL的毒死蜱标准溶液分别加入到应用例2步骤(1)中制备的A组试验样品中的五种果蔬样品溶液中，来探究构建的免疫传感器能否用来检测毒死蜱残留(光电化学免疫传感器工作电极的制备方法同实施例1，只是将毒死蜱抗原标准溶液替换为加入了浓度为0.5、1.0、2.0μg/mL的毒死蜱标准溶液的果蔬样品溶液，PEC免疫检测方法同应用例1和应用例2)。加标回收试验结果如表2所示，由表2可知，其回收率在84％-95.5％之间，相对标准偏差(RSD)均小于4.5％，精确度良好，表明本发明的光电化学免疫传感器可以用来分析毒死蜱残留。

表2免疫传感器对果蔬中毒死蜱的检测(N＝3，即重复3次)

效果例1

纳米材料的性能测试

以TiO₂纳米材料以及Bi₂WO₆纳米材料作为对照，比较TiO₂纳米材料(实施例1步骤(1)制得)、Bi₂WO₆纳米材料、Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料(实施例1步骤(2)制得)三者的各项性能。

其中，Bi₂WO₆纳米材料的制备(采用溶剂热法)：

将0.6597gNa₂WO₄·2H₂O和1.9404g Bi(NO₃)₃·5H₂O溶解在40mL乙二醇中，搅拌1h，再向上述混合溶液中加入40mL无水乙醇并搅拌0.5h；将制备的混合溶液导入至100mL聚四氟乙烯水热反应釜中，160℃下水热反应12h；冷却过滤，再用无水乙醇和超纯水分别洗涤3次，80℃干燥2h，转移至马弗炉中400℃煅烧4h，冷却，即得Bi₂WO₆纳米材料。

(1)XRD结果分析

不同纳米材料的XRD图谱如图5所示，由图5可以看出，属于TiO₂衍射峰的2θ值分别为25.1°、38.2°、47.5°、53.9°、55°、62.3°对应于(101)、(004)、(200)、(105)、(211)、(204)和(220)(JCPDS NO.21-1272)晶面。纯Bi₂WO₆在28.2°、32.3°、46.2°、55.6°、57.5°对应于(131)、(060)、(202)、(133)、(262)(JCPDS NO.73-1126)晶面具有较强的衍射峰，这是正交晶系Bi₂WO₆的衍射峰，没有出现其他特征峰。此外，与TiO₂结合后，Bi₂WO₆的衍射峰强度降低。表明Bi₂WO₆-TiO₂复合材料复合成功，主要是因为TiO₂的加入影响了Bi₂WO₆的结晶度，并且界面重合抑制了Bi₂WO₆晶体的生长。然而，这种作用却可以抑制电子和空穴的复合，有利于提高纳米复合材料的光学活性。

(2)SEM表征

TiO₂、Bi₂WO₆和Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料的SEM图如图6所示，其中，(a)为TiO₂、(b)为Bi₂WO₆、(c)为5％Bi₂WO₆-TiO₂(Lowfold，低倍率)、(d)为5％Bi₂WO₆-TiO₂(Highfold，高倍率)。从(a)和(b)可以看出，纯TiO₂纳米颗粒和纯Bi₂WO₆纳米颗粒几乎呈球形，形貌大小均一，其中TiO₂纳米颗粒外表面光滑，Bi₂WO₆纳米颗粒表面呈疏松孔状结构。从(c)和(d)可以看出，球形结构的表面具有不规则凸起，这是由于TiO₂颗粒表面上形成Bi₂WO₆，表明Bi₂WO₆和TiO₂成功复合，这与XRD分析的结果一致。

(3)UV-vis结果分析

紫外可见漫反射吸收光谱可以反映样品的光吸收能力，不同纳米材料的紫外可见光谱(UV-vis)如图7所示。其中，(a)为三种纳米材料的UV-vis漫反射光谱、(b)为三种纳米材料的光学带隙能量。(a)显示TiO₂样品在紫外区域具有吸收，表明TiO₂只能在紫外光下激发，而Bi₂WO₆样品在460nm附近具有吸收，说明Bi₂WO₆在可见光区域具有光催化能力。而Bi₂WO₆-TiO₂复合催化剂的吸收边缘在可见光区域向长波方向移动，表明Bi₂WO₆-TiO₂异质结构催化剂在可见光下的光谱响应范围变宽。(b)显示TiO₂、Bi₂WO₆和Bi₂WO₆-TiO₂分别为2.85、2.57和2.73eV。结果表明，TiO₂和Bi₂WO₆的耦合可以有效地提高可见光吸收能力。

(4)光电流结果分析

ITO玻璃电极依次用丙酮、无水乙醇和超纯水分别超声清洗30min，自然晾干，备用；分别称取TiO₂、Bi₂WO₆各20mg，将其分别分散在含有5wt％Nafion的无水乙醇溶液中(其中体积比为Nafion:无水乙醇＝1:5)，在25℃超声水浴中超声分散30min，然后用移液枪分别多次少量地量取100μL上述悬浮液滴涂修饰于ITO电极表面，50℃干燥；分别得到TiO₂/ITO、Bi₂WO₆/ITO光电极，最后放置4℃环境备用。

配制pH为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液。称取1g壳聚糖(CS)，倒入醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，室温下磁力搅拌0.5h并定容至100mL，配制成浓度为1mg/mL的壳聚糖溶液。称取20mg葡萄糖氧化酶(GOD)，放入1mL壳聚糖溶液中，轻微振荡1h，现配现用。称取少量葡萄糖，用超纯水溶解，配制10μM的葡萄糖溶液。最后用移液枪取300μL的GOD/CS溶液，滴到Bi₂WO₆-TiO₂/ITO光电极上面，得到GOD/Bi₂WO₆-TiO₂/ITO光电极，4℃干燥并保存备用。

对裸ITO、TiO₂/ITO、Bi₂WO₆/ITO光电极、实施例1步骤(a)中制得的Bi₂WO₆-TiO₂/ITO光电极以及GOD/Bi₂WO₆-TiO₂/ITO光电极给予光照，不同纳米材料在光照下的电流-时间曲线如图8所示，由图8可知，当给予光照时，光电流响应急剧增加。可以观察到，光电流在几个稳定的照射周期内是可重复的。裸ITO没有光电流响应(I＝0μA)，同时，由于TiO₂的可见光响应较差，TiO₂/ITO表现出较小的光电流强度(I＝1.20μA)。与单纯的Bi₂WO₆和单纯的TiO₂相比，Bi₂WO₆-TiO₂复合材料表现出最强的光电流密度，表明Bi₂WO₆-TiO₂具有较低的光电导载流子复合率和较高的光电活性。再将葡萄糖氧化酶修饰于光电极上后，光电流明显减弱，这是由于葡萄糖氧化酶大分子阻碍了电子的传递，导致电阻增大，电流减小。这些结果表明，Bi₂WO₆和TiO₂的偶联可以有效地抑制光生电子和空穴的直接复合，从而提高复合材料的光催化能力。

效果例2

Ab2-AuNPs-GOD生物共轭体的表征

(1)TEM表征

图9是金纳米颗粒和Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体的TEM图像。其中，(c)、(d)是金纳米颗粒在不同放大倍数下的TEM形貌图，呈近圆球状，颗粒大小均匀，直径约15nm左右。(a)、(b)为Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体在不同放大倍数下的TEM形貌图。可以看出，物质呈团聚形态，相比金纳米颗粒，体积变大，分布稠密，表明了抗体和葡萄糖氧化酶连接在金纳米颗粒上，形成了Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体。

(2)紫外-可见光谱表征

图10为不同物质的紫外-可见吸收光谱图，其中，a为葡萄糖氧化酶和二抗混合物；b为金纳米颗粒；c为Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体。如图10所示，金纳米颗粒的特征峰出现在520nm左右，葡萄糖氧化酶和二抗的混合物在250nm附近出现特征峰，主要是蛋白质的紫外吸收峰，Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体的紫外吸收峰与其他相比，蛋白质的特峰明显减弱，并且吸收峰发生了一些红移。这是由于葡萄糖氧化酶和二抗被吸附在金纳米颗粒的孔隙中，也说明了二抗与葡萄糖氧化酶连接到金纳米颗粒上，形成Ab-AuNPs-GOD生物共轭体。

效果例3

光电化学免疫传感器的特异性测试

如图11所示，选择有机磷类中的三唑磷、噻虫啉、甲基对硫磷和蝇毒磷(浓度均为0.25μg/mL)作为干扰物质，来探究不同干扰物质在免疫探针表面孵育后产生光电流信号。图中显示，只有在修饰了毒死蜱的免疫探针上，表现出了较强的光电流信号。说明，干扰物质修饰后并没有与免疫探针上固定的毒死蜱抗体发生特异性结合，基本都被免疫清洗液清洗流失。由此可以证明本发明设计的免疫传感器具有良好的特异性。

效果例4

光电化学免疫传感器的稳定性和重现性

利用实施例1的方法，制备毒死蜱抗原标准溶液浓度为0.25μg/mL的工作电极，在同一条件下，对制备的工作电极进行PEC免疫检测(方法同应用例1)，每隔20s打开光源，在240s内连续进行6次激发，观察每次激发下光电流信号稳定，如图12所示，光电流值几乎没有减弱趋势，这表明本发明的光电化学免疫传感器具有良好的稳定性，适合对毒死蜱进行定量检测。此外，本发明还通过在4℃下将本效果例中制备的免疫电极放置三天和一周，再进行光电流测试，发现其仍然保持初始光电流的92.4％和87.5％。表明本发明制备的传感器具有良好的储存稳定性。本效果例通过在相同条件下制备了六个免疫电极(毒死蜱抗原标准溶液浓度为0.25μg/mL)，并在相同条件下进行检测，发现光电流信号相对标准偏差值较小(为4.3％)，表明此方法用来检测毒死蜱的重现性较好。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种检测毒死蜱的光电化学免疫传感器，其特征在于，包括工作电极；所述工作电极通过在基底电极表面修饰Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料，然后在Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料表面固定毒死蜱抗体，在毒死蜱抗体表面固定毒死蜱抗原，再利用夹心法将葡萄糖氧化酶标记物连接到电极表面获得。

2.如权利要求1所述的检测毒死蜱的光电化学免疫传感器，其特征在于，所述基底电极为ITO玻璃电极。

3.如权利要求1所述的检测毒死蜱的光电化学免疫传感器，其特征在于，所述Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料的制备方法为：将钨盐溶于丙三醇中，搅拌0.5-1h后，再加入TiO₂纳米材料，得到溶液A；将铋盐溶于乙二醇中搅拌0.5-1h，得到溶液B；在搅拌的情况下，将溶液B滴加到溶液A中，滴加完毕后先搅拌0.5-1h，再加入无水乙醇继续搅拌0.5-1h，得到混合溶液；将所述混合溶液在155-165℃的温度下进行10-14h的溶剂热反应；反应完毕后烘干，焙烧，得到所述Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料。

4.如权利要求3所述的检测毒死蜱的光电化学免疫传感器，其特征在于，制备溶液A时，钨盐与丙三醇的用量比为1mol:250-300mL，钨盐与TiO₂纳米材料的摩尔用量比为1:165-170；制备溶液B时，铋盐与乙二醇的用量比为1mol:250-300mL；钨盐与铋盐的摩尔用量比为1:1-1.02。

5.如权利要求3所述的检测毒死蜱的光电化学免疫传感器，其特征在于，所述焙烧的温度为400℃，时间为4h。

6.如权利要求1所述的检测毒死蜱的光电化学免疫传感器，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶标记物为Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体，所述Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体的制备方法为：将氯金酸溶液加入水中，加热搅拌至开始沸腾，然后加入柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌反应20-30min，冷却，得到AuNPs溶液；将所述AuNPs溶液离心浓缩，去除上清液，在沉淀中加入Ab₂溶液和GOD的PBS溶液，振荡1-3h，加入BSA溶液封闭1-2h；然后离心，去除上清液，将沉淀洗涤离心，得到所述Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体；将所述Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体分散到PBS溶液中，得到Ab₂-AuNPs-GOD生物共轭体溶液。

7.如权利要求6所述的用于检测毒死蜱的纳米光电化学免疫传感器，其特征在于，所述氯金酸溶液的浓度为1wt％，柠檬酸三钠溶液的浓度为1wt％；所述Ab₂溶液的浓度为1mg/mL；所述GOD的PBS溶液中GOD的浓度为6mg/mL，PBS的浓度为0.01M；所述BAS溶液的浓度为1wt％；按体积比计，氯金酸溶液：柠檬酸三钠溶液：Ab₂溶液：GOD的PBS溶液：BSA溶液＝0.5mL:1mL:40μL:100μL:100μL。

8.一种利用权利要求1-7任一项所述的检测毒死蜱的光电化学免疫传感器检测毒死蜱的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备检测毒死蜱的光电化学免疫传感器的工作电极：

在基底电极表面修饰Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料，然后在Bi₂WO₆-TiO₂复合纳米材料表面固定毒死蜱抗体，在毒死蜱抗体表面固定不同浓度的毒死蜱抗原标准溶液，再利用夹心法将葡萄糖氧化酶标记物连接到电极表面获得固定有不同浓度毒死蜱抗原的权利要求1所述的工作电极；

(2)绘制工作曲线：

将工作电极与参比电极和对电极构成三电极系统，以PBS溶液为电解质溶液，分别对步骤(1)中得到的固定有不同浓度毒死蜱抗原的工作电极进行PEC免疫检测，打开光源，待光电流响应稳定后，在电解液中加入葡萄糖溶液，测试光电流值，加入葡萄糖溶液后测得的光电流值与毒死蜱抗原标准溶液浓度的对数呈线性关系，以毒死蜱抗原标准溶液浓度的对数为横坐标，光电流值为纵坐标绘制工作曲线；

(3)果蔬中毒死蜱的检测：用待测果蔬样品溶液代替步骤(1)中的毒死蜱抗原标准溶液制备工作电极，按照步骤(2)进行PEC免疫检测，根据得到的光电流值和工作曲线得到待测果蔬中毒死蜱的含量。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述不同浓度的毒死蜱抗原标准溶液为浓度分别为0.1、0.25、0.5、1、5μg/mL的毒死蜱抗原标准溶液。