CN107085019B - 赭曲酶毒素a光电化学适配体传感电极的制备方法和应用 - Google Patents

赭曲酶毒素a光电化学适配体传感电极的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种赭曲酶毒素A光电化学适配体传感电极的制备方法和应用,属于光电化学分析领域。所述制备方法是将二氧化钛纳米颗粒(TiO2,Aeroxide P25)滴涂于氧化铟锡(ITO)导电玻璃电极上,干燥后高温烧结,再将其浸入合成好的羧基化硫化镉(CdS)量子点溶液中,得到CdS/TiO2/ITO电极,通过化学耦合反应把氨基修饰的赭曲酶毒素A(OTA)核酸适配体桥接于CdS量子点上,最终获得DNA/CdS/TiO2/ITO传感电极,该传感电极特异性识别OTA分子,产生位阻效应使得光电流显著下降。电极的多孔结构和高光电转换效率以及对OTA的特异性识别,显著提高了传感电极的稳定性、灵敏度和选择性,在食品安全质量检测领域具有良好的发展前景。

Description

赭曲酶毒素A光电化学适配体传感电极的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种基于位阻效应型的赭曲酶毒素A光电化学适配体传感电极的制备方法及其对赭曲酶毒素A的检测应用,属于光电化学分析领域。
背景技术
食品安全一直是社会关注的焦点,这主要是由于食品中霉菌毒素给人类健康带来的巨大负面影响。其中,赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA),作为仅次于黄曲霉毒素而列第二位的一种霉菌毒素,被国际癌症研究机构(IARC)确定为ⅡB类致癌物。OTA是由碳黑曲霉、赭曲霉及疣孢青霉等一些有毒的真菌在恶劣环境条件下所产生的有毒次级代谢产物。相对于其他代谢产物,OTA的污染范围比较广,主要存在于谷物、水果、中草药、茶叶、咖啡、豆类、牛奶、奶制品、食用油和啤酒中,近几年又相继在葡萄干、葡萄酒及调味品中发现OTA存在,同时在动物饲料中OTA的污染也非常严重。OTA可通过食物链进入人体从而对人的健康产生危害,也可通过母体血液、乳汁影响下一代。它的化学稳定性和热稳定性比较高,而且毒性也强。按照化合物经口急性毒性分类标准将OTA分为剧毒类化合物,它的毒性主要体现为肾毒性和肝毒性,同时具有免疫毒性、致突变性、致癌性、致畸性和神经毒性。因此,实现OTA的快速分析检测是食品安全中的一个重要环节,对食品安全管控具有重要的意义。
现阶段,国内外针对OTA分析检测的方法大概归纳有两类,一类是以结合紫外、荧光、质谱等检测手段的高效液相色谱法(HPLC)和酶联免疫吸附法(ELISA)为代表的传统检测方法。HPLC灵敏度高,但是操作繁锁,对样品的预处理步骤复杂,对仪器设备的要求高,检测成本高。尽管ELISA可以弥补某些不足,但其所使用的抗体易受外界条件的影响,假阳性率高,在某种程度上限制了它们的应用;另一类是以结合光学、电化学信号换能器的生物传感为代表的新型检测方法,它的核心是生物特异性识别元件和高效率的换能器,常见的有电化学传感器、化学发光传感器、电致化学发光传感器等免疫和适配体传感器,然而,这些方法亦存在其各自的缺点,比如电化学和荧光传感器通常需要对适配体进行电化学和荧光信号标记,化学发光需要加入额外的发光试剂鲁米诺,比色法检出限较高等。光电化学分析是利用光电化学过程和化学/生物分子识别过程建立起来的一种新型的分析方法,因其灵敏度高、响应速度快、设备简单和背景信号低等特点在生物化学、医学、食品安全和环境等分析领域受到了广泛关注,展现出广阔的应用前景,满足市场需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于位阻效应型的赭曲酶毒素A光电化学适配体传感电极的制备方法,以提高传感电极对OTA检测的选择性、灵敏度和稳定性,解决现有方法成本高、灵敏度低、制备复杂等问题。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种赭曲酶毒素A光电化学适配体传感电极的制备方法,包括以下步骤:
A、配制二氧化钛纳米颗粒(TiO2,Aeroxide P25)溶胶,并滴涂于氧化铟锡(ITO)导电玻璃电极表面,电极置于450~500℃高温烧结30分钟;
B、合成硫化镉量子点(CdS)溶液,并将烧结后二氧化钛/导电玻璃(TiO2/ITO)电极浸入该溶液中吸附量子点;
C、通过化学耦合反应将赭曲酶毒素(OTA)核酸适配体(DNA)桥接于硫化镉/二氧化钛/导电玻璃(CdS/TiO2/ITO)电极表面,使用乙醇胺(MEA)缓冲液封闭电极活性位点,最终得到适配体/硫化镉/二氧化钛/导电玻璃(DNA/CdS/TiO2/ITO)传感电极并测试其对不同浓度OTA的光电化学响应。
进一步的,步骤A中的TiO2纳米颗粒粒径为21~25nm,浓度为0.5~5mg/mL。所述的导电玻璃为氧化铟锡玻璃(ITO)、氟掺杂氧化锡玻璃(FTO)或者铝掺杂氧化锌玻璃(AZO),经过2mol/L KOH的异丙醇溶液中煮沸20分钟,超纯水和乙醇清洗,120℃干燥2小时,面积为0.25cm2,表面涂覆量为20~30μL。
进一步的,步骤B中的CdS量子点采用水相合成法,加入巯基乙酸(TGA)使其表面带有大量的羧基基团,粒径为5±1nm,浓度为1.0~1.5mg/mL。烧结后TiO2/ITO电极对量子点的吸附时间为3~12h,电极表面成膜厚度为1~20μm。
进一步的,步骤C中的赭曲酶毒素核酸适配体的碱基序列为5’-NH2-(CH2)6-GATCGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3’,适配体桥接采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺EDC/NHS偶联反应,将CdS/TiO2/ITO电极浸入1mL含20mg EDC和10mg NHS水溶液中室温活化1小时,清洗,取20~30μL浓度为0.5~2μM适配体溶液滴涂于有效电极上,在4℃孵化反应12~18小时。乙醇胺(MEA)封闭缓冲液为10mM Tris-HCl pH 8.5含1mM MEA,封闭温度和时间为4℃1~2小时。
本发明的赭曲酶毒素A光电化学适配体传感电极在食品安全分析检测中的应用。
进一步的,所述赭曲酶毒素A光电化学适配体传感电极在食品安全分析检测中的应用是,采用标准三电极系统,DNA/CdS/TiO2/ITO传感电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂电极为对电极,检测缓冲液为0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲液含0.1M抗坏血酸(AA),激发光的波长范围为410~510nm,优选420nm,光电流的测定在恒定电位下0V vs饱和Ag/AgCl;具体步骤是,将20~30μL 10mM pH 8.5Tris-HCl缓冲液(120mM NaCl,5mM KCl,20mMCaCl2)含不同浓度待测赭曲酶毒素A滴涂于传感电极区37℃反应1~2小时,清洗电极,置于检测缓冲液中进行光电化学分析测试,光电流变化的差值与赭曲酶毒素A建立标准曲线。
本发明具有以下有益效果:
(1)CdS/TiO2复合材料相对于单一的光电转换材料来说,具有更高的光电转换效率,能显著增强光电流,从而获得更高的灵敏度和检测范围,检测限为1pg/mL,0.01~100ng/mL;
(2)TiO2/ITO电极经过高温烧结,一方面使TiO2发生晶型转变,另一方面形成多孔的结构,有利益吸附和固定更多的CdS量子点,且不易流失,从而提高传感电极的稳定性和进一步增强光电流;
(3)本发明选择OTA核酸适配体作为生物分子识别元件,其对OTA特异性的识别作用,提高了传感电极对待测物的选择性,同时,核酸适配体识别元件合成简单、价格低廉和保存方便,相对于其他方法而言成本较低。
附图说明:
图1为本发明合成的光电化学传感电极扫描电镜图,烧结后TiO2/ITO电极的扫描电镜图(A)呈现出多孔的结构,吸附量子点后CdS/TiO2/ITO电极的扫描电镜图(B)及其局部放大图(C),电极表面大面积平整、均匀且紧密,仍然存在少量的空隙,有利于赭曲霉毒素A和电子供体抗坏血酸的进入。
图2为本发明实施过程中激发波长420nm下的光电流表征图,其中未烧结TiO2/ITO电极(a),烧结后TiO2/ITO电极(b),未烧结CdS/TiO2/ITO电极(c),烧结后CdS/TiO2/ITO电极(d)。
图3为本发明中赭曲酶毒素A浓度与光电流信号变化值的线性关系曲线图(A),即赭曲霉毒素光电化学分析检测标准曲线。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明,但不用来限制本发明的范围:
实施例1:光电化学适配体传感电极的制备
(1)羧基化水溶性CdS量子点的制备:将50mL 0.01M CdCl2溶液和250μL TGA加入到100mL三颈瓶中,通氮气,搅拌30min,期间用2M NaOH调节pH至11。30min后,缓慢加入5mL0.1M Na2S,继续通氮气,在110℃条件下回流4h,即得到羧基化水溶性CdS量子点,待溶液自然冷却后,转移到50mL离心管,用封口膜封口,置于4℃冰箱保存备用。
(2)DNA/CdS/TiO2/ITO传感电极组装:将ITO切割成0.5cm*3.0cm长条,丙酮清洗后浸入2M KOH的异丙醇溶液中煮沸20min,超纯水和乙醇反复冲洗,120℃干燥2h,自然冷却后取出待用。将0.025g TiO2分散于5mL超纯水中,超声10min,移取30μL TiO2分散液滴涂到ITO电极表面,固定电极面积为0.25cm2,自然干燥后置于马弗炉中450℃烧结30min,降至室温取出即得到TiO2/ITO电极,表面形貌如图1A,光电流测试曲线如图2b。将TiO2/ITO电极有效工作面完全浸入CdS溶液中9h,漂洗,氮气吹干得到CdS/TiO2/ITO电极,表面形貌如图1B和图1C,光电流测试曲线如图2d。将CdS/TiO2/ITO电极浸入1mL含20mg EDC和10mg NHS的水溶液中室温反应1h活化CdS表面羧基,去除未反应物后,移取25μL 1μM DNA适配体于有效电极表面4℃饱和湿度下孵化过夜16h,清洗电极,最后移取25μL 10mM Tris-HCl pH 8.5含1mMMEA于有效电极表面4℃饱和湿度下封闭非特异性结合位点1h,清洗电极,氮气吹干得到DNA/CdS/TiO2/ITO传感电极。
实施例2:对食品安全管控中赭曲酶毒素A的光电化学检测
配制1mL 1mg/mL OTA的二甲亚砜(DMSO)母液于-20℃保存。用10mM pH 8.5Tris-HCl缓冲液含120mM NaCl,5mM KCl,20mM CaCl2逐级稀释OTA,得到不同浓度的OTA溶液,移取25μL OTA溶液于DNA/CdS/TiO2/ITO传感电极表面37℃饱和湿度下孵化1h,清洗电极,最后将该传感电极置于0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲液含0.1M抗坏血酸(AA)的检测液中进行光电化学测试,传感电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂电极为对电极,激发光波长为420nm,测定不同浓度OTA处理前后光电流的变化值,对OTA浓度作图,两者呈现出良好的线性关系,如图3,线性范围为0.01~100ng/mL,检测限为1pg/mL,因此该传感电极能实现该浓度范围内OTA的定量检测。
上述具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案,凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏科技大学
<120> 赭曲酶毒素A光电化学适配体传感电极的制备方法和应用
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36

Claims (2)

1.一种赭曲酶毒素A光电化学适配体传感电极的制备方法,其特征在于包含以下步骤:
A、配制二氧化钛纳米颗粒溶胶,并滴涂于导电玻璃电极表面,电极置于450~500℃高温烧结30分钟;
B、合成硫化镉量子点溶液,并将步骤A烧结后二氧化钛/导电玻璃的电极浸入该溶液中吸附量子点;
C、通过化学耦合反应将赭曲酶毒素核酸适配体桥接于步骤B得到的硫化镉/二氧化钛/导电玻璃电极表面,使用乙醇胺缓冲液封闭电极活性位点,最终得到适配体/硫化镉/二氧化钛/导电玻璃传感电极并测试其对不同浓度赭曲酶毒素的光电化学响应;
其中,步骤A中,所述的二氧化钛纳米颗粒粒径为21~25nm,浓度为0.5~5mg/mL;所述的导电玻璃为氧化铟锡玻璃、氟掺杂氧化锡玻璃或者铝掺杂氧化锌玻璃,经过2mol/L KOH的异丙醇溶液中煮沸20分钟,超纯水和乙醇清洗,120℃干燥2小时,面积为0.25cm2,表面涂覆量为20~30μL;
步骤B中,所述的硫化镉量子点采用水相合成法,加入巯基乙酸使其表面带有大量的羧基基团,粒径为5±1nm,浓度为1.0~1.5mg/mL;所述的烧结电极对量子点的吸附时间为3~12h,电极表面成膜厚度为1~20μm;
步骤C中,所述的赭曲酶毒素核酸适配体的碱基序列为5’-NH2-(CH2)6-GAT CGG GTGTGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3’,浓度为0.5~2μM,体积为20~30μL,桥接温度和时间为4℃和12~18小时;所述的乙醇胺缓冲液为10mM Tris-HCl pH 8.5含1mM MEA,封闭温度和时间为4℃和1~2小时。
2.一种根据权利要求1所述的赭曲酶毒素A光电化学适配体传感电极在食品安全分析检测中的应用方法,其特征在于,所述应用是采用标准三电极系统,适配体/硫化镉/二氧化钛/导电玻璃传感电极为工作电极,银/氯化银电极为参比电极,铂电极为对电极,激发光的波长范围为410~510nm,光电流的测定在恒定电位下0V vs饱和银/氯化银电极;所述方法的具体步骤是,将20~30μL 10mM pH 8.5 Tris-HCl缓冲液含不同浓度待测赭曲酶毒素A滴涂于传感电极区37℃反应1~2小时,其中缓冲溶液含有120mM NaCl,5mM KCl,20mM CaCl2,电极清洗,置于检测缓冲液中进行光电化学分析测试,光电流变化的差值与赭曲酶毒素A建立标准曲线。
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Application publication date: 20170822

Assignee: Silkworm pharmaceutical factory affiliated to Sericulture Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences

Assignor: JIANGSU University OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

Contract record no.: X2020980007222

Denomination of invention: Preparation and application of ochratoxin a photoelectrochemical aptamer sensing electrode

Granted publication date: 20190823

License type: Common License

Record date: 20201029

EC01 Cancellation of recordation of patent licensing contract
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Assignee: Silkworm pharmaceutical factory affiliated to Sericulture Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences

Assignor: JIANGSU University OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

Contract record no.: X2020980007222

Date of cancellation: 20201222