CN109932507A - 一种用于诺如病毒检测的生物传感器及其制备、使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体公开一种用于诺如病毒检测的生物传感器及其制备、使用方法。所述用于诺如病毒检测的生物传感器，包括工作电极，所述工作电极为硫化镉量子点包覆的氧化铟锡，且所述工作电极的硫化镉量子点表面偶联有特异性抗体和/或特异性探针，且所述特异性抗体为针对诺如病毒的核衣壳蛋白VP1设计的特异性抗体，或所述特异性探针为针对诺如病毒设计的特异性探针。本发明提供的用于诺如病毒检测的生物传感器，组成简单，不涉及复杂的技术和设备，对技术和设备的要求较低，且检测灵敏度高，适于广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于诺如病毒检测的生物传感器及其制备、使用方法。
背景技术
食品安全是世界公共卫生的一个重要课题。食品安全问题伴随着人类社会发展的各个阶段。随着社会经济日益全球化和国际食品贸易的日益扩大，食品安全也日益成为一个重要的世界经济的政治议题。一个国家的食品安全状况代表着整个国家的面貌和其国际形象。
在发达国家，食品工业的规模化、产业化和系统化以及食品工业和广大消费者食品安全意识较高，食品相关的法律法规及监管机构的分工合作比较完善。其食品安全问题主要集中于食源性病原菌和毒素造成的食物中毒。在微生物污染中，细菌性污染是涉及面最广、影响最大、问题最多的一种污染。根据WHO统计，全球每年大约有150000万例食源性腹泻病，约70％是由微生物性污染引起。食源性疾病不但威胁人民身心健康，还给社会造成巨大的经济损失。在发展中国家，致病性微生物造成的食源性疾病，也仍然是危害公众健康的最重要因素。与世界各国一样，我国的食品安全危害问题主要是微生物病原菌和生物毒素造成的食物中毒。据中国CDC的一项初步调查，我国每年由于微生物病原菌和生物毒素造成的食物中毒事件在2-4亿例以上，给公共安全造成很大的威胁和巨大的经济损失。目前，我国尚没有建立起完善的食源性疾病报告系统。根据世界卫生组织估计，发展中国家食源性疾病的漏报率在95％以上。按照卫生部提供的统计数字，中国最近几年由食源性疾病引起的食品安全问题呈现出上升趋势。近年中国卫生部每年接到食物中毒报告一二百起，涉及数千人发病，百余人死亡，除意外事故外，大部分是由致病微生物引起的。统计数据表明，由肠道致病菌(沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌O157∶H7、单核细胞增生李斯特菌、伤冷沙门菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌等)污染食品而引起的食品中毒以及疾病散发是直接造成人体健康损害的主要食源性危害。除了细菌性病原，诺如病毒(norovirus)是造成食品中毒的最为普遍的因素之一。诺如病毒具有高度传染性病原体。它是在世界范围造成非细菌性肠胃炎的急性传染病的重要病原体，其经常通过食物和水进行传播。海鲜和即食食品被认为是食源性诺如病毒感染的重要媒介。在我国，每年都有大型的爆发案例。2013年3月，广州大学城多所高校出现因感染诺如病毒而导致的聚集性腹泻病例。累计确诊200多例，无人死亡。2013年4月，广东省揭阳市揭阳职业技术学院近400名学生感染诺如病毒，有173名学生送医院诊治观察。2014年2月，浙江嘉兴的海宁市、海盐县两地部分学校400多人感染。
目前，诺如病毒的检测方法主要基于RT-PCR，此方法的不足之处是要求较高的技术、设备和较长的时间，而且无法实现实时检测分析。冷冻电镜法是检测分析诺如病毒的另一个传统技术，同样该方法对技术和设备都有很高的要求，从而限制了广泛应用。利用免疫学方法对诺如病毒进行检测分析是另一个快速、简便、灵敏和特异的方法，但目前已有的免疫学检测技术具有较低的检测灵敏度问题。鉴于此，为了更好地预防和监控食品中诺如病毒的污染情况，以及实现对诺如病毒的实时实地方便快捷的检测分析，开发出新的诺如病毒的检测技术已迫在眉睫。
发明内容
针对现有诺如病毒监测技术存在的对技术和设备要求高，所用时间长，监测灵敏度低等问题，本发明提供一种用于诺如病毒检测的生物传感器及其制备、使用方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种用于诺如病毒检测的生物传感器，包括工作电极，所述工作电极为硫化镉量子点包覆的氧化铟锡，且所述工作电极的硫化镉量子点表面偶联有特异性抗体和/或特异性探针，且所述特异性抗体为针对诺如病毒的核衣壳蛋白VP1设计的特异性抗体，或所述特异性探针为针对诺如病毒设计的特异性探针。
相对于现有技术，本发明提供的用于诺如病毒检测的生物传感器，组成简单，不涉及复杂的技术和设备，对技术和设备的要求较低，工作电极表面偶联有特异性抗体和/或特异性探针，能特异性结合诺如病毒，灵敏度高，适于广泛应用。
进一步地，本发明还提供了用于诺如病毒检测的生物传感器的制备方法。该制备方法，包括以下步骤：
(1)提供针对诺如病毒核衣壳蛋白VP1的特异性抗体，和/或提供针对诺如病毒的特异性探针；
(2)将所述特特异性抗体和/或特异性探针偶联在硫化镉量子点包覆的氧化铟锡表面，得到工作电极；
(3)将所述的工作电极与铂电极、参比电极、电解液、单色光源、电化学检测装置进行组装，得到用于诺如病毒检测的生物传感器。
相对于现有技术，本发明提供的用于诺如病毒检测的生物传感器的制备方法，工艺简单，操作方便，绿色安全。
进一步地，本发明还提供了用于诺如病毒检测的生物传感器的使用方法。该使用方法，包括以下步骤：
(1)将工作电极与铂电极、参比电极放入电解液中，用单色光激发工作电极，记录光电信号；
(2)向工作电极表面滴加VP1蛋白或灭活的诺如病毒，得到结合后的工作电极；
(3)将结合后的工作电极与铂电极、参比电极放入电解液中，用单色光激发结合后的工作电极，记录光电信号；
(4)比较步骤(1)、(3)中的光电信号，分析工作电极的阻抗变化，衡量对诺如病毒的检测效果。
相对于现有技术，本发明提供的用于诺如病毒检测的生物传感器的使用方法，通过用于诺如病毒检测的生物传感器，结合了免疫学和材料科学的各自优势，通过光电信号的变化，来判断工作电极阻抗的变化，进而衡量对诺如病毒的检测效果，对诺如病毒的检测分析具有快速、方便和检测灵敏度高的特点，同时，对技术和设备的要求较低，适于广泛应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例用于诺如病毒检测的生物传感器的原理图；
图2是本发明实施例用于诺如病毒检测的生物传感器对浓度为2x10-4g/mL的重组型VP1蛋白的检测分析结果；
图3是本发明实施例用于诺如病毒检测的生物传感器对浓度为2x10-6g/mL的重组型VP1蛋白的检测分析结果；
图4是本发明实施例用于诺如病毒检测的生物传感器对浓度为2x10-10g/mL的重组型VP1蛋白的检测分析结果；
图5是本发明实施例用于诺如病毒检测的生物传感器经不同浓度重组型VP1蛋白处理后的生物传感器表面阻抗变化率结果；
图6是本发明实施例用于诺如病毒检测的生物传感器对重组型VP1蛋白的检测分析特异性；
图7是本发明实施例用于诺如病毒检测的生物传感器对灭活诺如病毒颗粒的检测分析结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种用于诺如病毒检测的生物传感器。该用于诺如病毒检测的生物传感器，包括工作电极，所述工作电极为硫化镉量子点包覆的氧化铟锡，且所述工作电极的硫化镉量子点表面偶联有特异性抗体和/或特异性探针，且所述特异性抗体为针对诺如病毒的核衣壳蛋白VP1设计的特异性抗体，或所述特异性探针为针对诺如病毒设计的特异性探针。
优选地，所述硫化镉量子点表面含有末端为氨基和/或羧基的修饰剂，且所述特异性抗体和/或特异性探针与所述硫化镉量子点表面的氨基和/或羧基偶联，得到工作电极。
优选地，所述生物传感器还包括铂电极、参比电极、电解液、单色光源、电化学检测装置；所述铂电极、参比电极、所述工作电极均置于电解液中，且所述铂电极、参比电极、工作电极均与电化学监测装置连接，可以通过检测光电信号，来判断工作电极的阻抗变化，阻抗越大，光电信号越弱，证明工作电极与VP1蛋白或者灭活的诺如病毒进行了特异性结合，即VP1蛋白或者灭活的诺如病毒被检测到。
优选地，所述电解液为抗坏血酸电解液，起到电解质作用，传递电信号。
本发明实施例提供的用于诺如病毒检测的生物传感器，主要包括铂电极、参比电极、氧化铟锡电极、电解液、单色光源、电化学检测装置，组成简单，不涉及复杂的技术和设备，对技术和设备的要求较低，适于广泛应用。
本发明在提供该用于诺如病毒检测的生物传感器的前提下，还进一步提供了该生物传感器的制备方法。
在一实施例中，该制备方法包括以下步骤：
(1)提供针对诺如病毒核衣壳蛋白VP1的特异性抗体，和/或提供针对诺如病毒的特异性探针；
(2)将所述特特异性抗体和/或特异性探针偶联在硫化镉量子点包覆的氧化铟锡表面，得到工作电极；
(3)将所述的工作电极与铂电极、参比电极、电解液、单色光源、电化学检测装置进行组装，得到用于诺如病毒检测的生物传感器。
下面对上述检测方法做进一步的解释说明：
优选地，所述步骤(2)中，将所述特特异性抗体和/或特异性探针偶联在硫化镉量子点包覆的氧化铟锡表面的反应体系中，加入质量比为1:2的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，NHS/EDC体系用来活化硫化镉量子点表面的羧基，与特异性抗体和/或特异性探针中的氨基进行偶联反应。
本制备方法，工艺简单，操作方便，绿色安全。
具体地，本发明还提供了用于诺如病毒检测的生物传感器的使用方法。
该使用方法，包括以下步骤：
(1)将工作电极与铂电极、参比电极放入电解液中，用单色光激发工作电极，记录光电信号；
(2)向工作电极表面滴加VP1蛋白或灭活的诺如病毒，得到结合后的工作电极；
(3)将结合后的工作电极与铂电极、参比电极放入电解液中，用单色光激发结合后的工作电极，记录光电信号；
(4)比较步骤(1)、(3)中的光电信号，分析工作电极的阻抗变化，衡量对诺如病毒的检测效果。
优选地，所述工作电极的阻抗变大，光电信号变弱，说明工作电极与VP1蛋白或灭活的诺如病毒进行了特异性结合。
优选地，所述工作电极与VP1蛋白或灭活的诺如病毒结合后，使阻抗变大，VP1的浓度越高，阻抗的升幅也越大，光电信号的降幅也就越大。
优选地，所述单色光由单色光源提供，激发工作电极表面的硫化镉量子点，产生光电信号。
本使用方法过用于诺如病毒检测的生物传感器，结合了免疫学和材料科学的各自优势，通过光电信号的变化，来判断工作电极阻抗的变化，进而衡量对诺如病毒的检测效果，对诺如病毒的检测分析具有快速、方便和检测灵敏度高的特点，同时，对技术和设备的要求较低，适于广泛应用。
为了更好的说明本发明实施例提供的用于诺如病毒检测的生物传感器及其制备、使用方法，下面通过实施例做进一步的举例说明。
实施例1
如图1所示，用于诺如病毒检测的生物传感器。该用于诺如病毒检测的生物传感器，包括铂电极、参比电极、工作电极、电解液、单色光源、电化学检测装置；
所述铂电极、参比电极、工作电极均置于电解液中；所述铂电极、参比电极、工作电极均与电化学监测装置连接。
实施例2
用于诺如病毒检测的生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)根据诺如病毒的核衣壳蛋白VP1，制备特异性抗体
生物信息学分析结果显示，诺如病毒的核衣壳蛋白VP1暴露于诺如病毒表面，在诺如病毒的复制等过程中发挥着重要作用，另外VP1在诺如病毒中具有高度保守特性，是一个理想的抗原设计靶标。因此在实施例中，针对VP1，我们设计并合成了相关多肽片段，委托抗体制备公司制备特异性抗体；
(2)将所述特特异性抗体偶联在硫化镉量子点包覆的氧化铟锡表面，得到工作电极：
把经过巯基乙酸(thioglycolic acid，TGA)处理的硫化镉量子点(CdS)包被在在氧化铟锡(ITO)玻璃表面，室温条件下，利用1mL的EDC/NHS(20mg/mL/10mg/mL)混合溶液处理上述ITO1h，用超纯水清洗3次后，再利用25μL的1mg/mL的单克隆抗体(mAb)室温条件下孵育处理活化后的ITO器件1h后，利用0.01M PBS清洗3次，得到工作电极；
(3)将所述的工作电极与铂电极、参比电极、电解液、单色光源、电化学检测装置进行组装，得到用于诺如病毒检测的生物传感器。
实施例3
用于诺如病毒检测的生物传感器的使用方法，包括以下步骤：
(1)将工作电极与铂电极、参比电极放入抗坏血酸电解液中，用单色光激发工作电极，记录光电信号；
(2)向工作电极表面滴加不同浓度重组型VP1蛋白或灭活的诺如病毒，得到结合后的工作电极；
(3)将结合后的工作电极与铂电极、参比电极放入抗坏血酸电解液中，用单色光激发结合后的工作电极，记录光电信号；
(4)比较步骤(1)、(3)中的光电信号，分析工作电极的阻抗变化，衡量对诺如病毒的检测效果。
该用于诺如病毒检测的生物传感器能够检测到低至2x10-10g/mL的重组型VP1蛋白，如图2、3、4、5所示；同时，该用于诺如病毒检测的生物传感器具有很好的VP1检测特异性，如图6所示；此外，该用于诺如病毒检测的生物传感器能够用来检测分析灭活的诺如病毒颗粒，如图7所示。
综上所述，该发明提供的用于诺如病毒检测的生物传感器可实现对诺如病毒的特异性检测分析，检测灵敏度为2x10-10g/mL(4.9pM)诺如病毒VP1蛋白，检测反应时间为30min。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种用于诺如病毒检测的生物传感器，其特征在于：包括工作电极，所述工作电极为硫化镉量子点包覆的氧化铟锡，且所述工作电极的硫化镉量子点表面偶联有特异性抗体和/或特异性探针，且所述特异性抗体为针对诺如病毒的核衣壳蛋白VP1设计的特异性抗体，或所述特异性探针为针对诺如病毒设计的特异性探针。
2.如权利要求1所述的用于诺如病毒检测的生物传感器，其特征在于：所述硫化镉量子点表面含有末端为氨基和/或羧基的修饰剂，且所述特异性抗体和/或特异性探针与所述硫化镉量子点表面的氨基和/或羧基偶联。
3.如权利要求1或2所述的用于诺如病毒检测的生物传感器，其特征在于：所述生物传感器还包括铂电极、参比电极、电解液、单色光源、电化学检测装置；所述铂电极、参比电极、所述工作电极均置于电解液中，且所述铂电极、参比电极、工作电极均与电化学监测装置连接。
4.如权利要求3所述的用于诺如病毒检测的生物传感器，其特征在于：所述电解液为抗坏血酸电解液。
5.如权利要求1-4任一项所述的生物传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提供针对诺如病毒核衣壳蛋白VP1的特异性抗体，和/或提供针对诺如病毒的特异性探针；
(2)将所述特特异性抗体和/或特异性探针偶联在硫化镉量子点包覆的氧化铟锡表面，得到工作电极。
6.如权利要求5所述的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，将所述特特异性抗体和/或特异性探针偶联在硫化镉量子点包覆的氧化铟锡表面的反应体系中，加入质量比为1:2的N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。
7.如权利要求1-4任一项所述的生物传感器的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将工作电极与铂电极、参比电极放入电解液中，用单色光激发工作电极，记录光电信号；
(2)向工作电极表面滴加VP1蛋白或灭活的诺如病毒，得到结合后的工作电极；
(3)将结合后的工作电极与铂电极、参比电极放入电解液中，用单色光激发结合后的工作电极，记录光电信号；
(4)比较步骤(1)、(3)中的光电信号，分析工作电极的阻抗变化，衡量对诺如病毒的检测效果。
8.如权利要求7所述的生物传感器的使用方法，其特征在于：所述单色光由单色光源提供。
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