CN113281523A - 一种SARS-CoV-2中和抗体试纸条及其制备方法、试剂盒 - Google Patents

一种SARS-CoV-2中和抗体试纸条及其制备方法、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物医学检测技术领域，更具体地说，它涉及一种SARS‑CoV‑2中和抗体试纸条及其制备方法、试剂盒。所述试纸条包括底板和设置在底板上并依次连接的样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫；所述样品垫上包被有SARS‑CoV‑2 ACE2，所述结合垫上包被有胶体金标记的SARS‑CoV‑2 S‑RBD抗原，所述检测垫上设置了检测线和控制线，所述检测线上包被有SARS‑CoV‑2 S‑RBD抗原。本申请的试纸条无需使用相关仪器，适用于不同场景的现场检测，且检测时间短、检测灵敏度高，进而实现现场高准确度快检。

Description

一种SARS-CoV-2中和抗体试纸条及其制备方法、试剂盒
技术领域
本申请涉及生物医学检测技术领域，更具体地说，它涉及一种SARS-CoV-2中和抗体试纸条及其制备方法、试剂盒。
背景技术
SARS-CoV-2是一种β属的新型冠状病毒，呈圆形或椭圆形，直径60-140nm，电镜下呈皇冠样形状，可感染哺乳动物和人。当SARS-CoV-2在侵入机体时，冠状病毒S蛋白受体结合域（receptor bindingdomain，RBD）可使病毒与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2（angiotensin-convertingenzyme 2，ACE2）结合，此时，病毒刺激机体中的B淋巴细胞产生保护性的中和抗体，该中和抗体能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止侵入细胞，从而发挥抗病毒作用。
SARS-CoV-2发病后症状与感冒类似难分辨，而重症又可致命，风险人群基数大等这些因素，都是快速控制疫情的难题。目前我国多家企业和机构都在积极进行着疫苗的研发，并取得了重大突破。因此对于疫苗研发过程中接种人群是否产生特异性保护性抗体(中和抗体)以及上市后普通大众接种疫苗后是否产生特异性的中和抗体的检测需求，日益递增。因此，急需更为简便、快速且可广泛应用的检测产品。
专利号为CN202011542972.5的中国发明专利公开了一种新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括检测卡，稀释处理液和信息卡，其中检测卡包括硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫以及任选地吸水垫，并且在硝酸纤维素膜上含有检测线和质控线，所述结合垫上涂覆有量子点荧光微球标记的鼠抗新型冠状病毒S1中和抗体和量子点荧光微球标记的人源ACE2，所述检测线上包被有S1抗原，所述质控线上含有抗鼠IgG抗体。该发明为竞争法检测中和抗体，能在10min内完成检测。当血液中没有中和抗体，结合垫上ACE2与检测线上的S1抗原结合，因ACE2有量子点荧光微球标记而使检测线显色；当血液中有中和抗体，该中和抗体与检测线上的S1抗原结合，因中和抗体没有荧光标记而使检测线不显色。检测人员在实际操作中，若中和抗体存在但滴度不高时，该试剂盒的检测线依然会出现显色，进而对检测结果判读产生干扰。
专利号CN202110065490.3的中国发明专利公开了一种SARS-CoV-2中和抗体的检测方法、检测试剂盒，其公开的SARS-CoV-2中和抗体的检测方法是基于hACE2-RBD放大的胶乳增强免疫比浊检测法，检测试剂盒包括SARS-CoV-2的S蛋白受体结合域RBD标记的第一胶乳微球和人hACE2标记的第二胶乳微球。该发明通过在胶乳微球上标记抗原，其虽然放大了检测信号以增加检测的灵敏度，但是其为比浊法，需要配套使用仪器才能检测，同时试剂需要保存在4℃环境中，不便于检测人员在其他场景中现场检测。
针对上述中的相关技术，发明人认为，如何实现现场高准确度快检是目前急需解决的技术难题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本申请提供一种SARS-CoV-2中和抗体试纸条及其制备方法、试剂盒，该试纸条无需使用相关仪器，适用于不同场景的现场检测，且检测时间短、检测灵敏度高，进而实现现场高准确度快检。
第一方面，本申请提供一种SARS-CoV-2中和抗体试纸条，采用如下的技术方案：
一种SARS-CoV-2中和抗体试纸条，包括底板和设置在底板上并依次连接的样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫；
其中，所述样品垫上包被有SARS-CoV-2 ACE2，所述结合垫上包被有胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原，所述检测垫上设置了检测线和控制线，所述检测线上包被有SARS-CoV-2 S-RBD抗原。
本申请在S-RBD和ACE2抑制竞争法的基础上，通过夹心法检测中和抗体的浓度，若待检样品中不含有中和抗体，样品垫中的ACE2会与结合垫中的S-RBD抗原结合，检测线不会显色；若待检样品中含有中和抗体，中和抗体会阻断样品垫中ACE2与结合垫中的S-RBD抗原结合，检测线上会产生胶体金标记的S-RBD、中和抗体、检测线上包被的S-RBD形成的复合物，表现为检测线显色，待检样品中的抗体含量与检测线的显色强度呈正比，整个检测耗时在7min以内，反应结束后，直接可以肉眼观察显色情况。
其中，本申请的夹心法形成的复合物为“胶体金标记的S-RBD抗原—中和抗体—S-RBD抗原”，其结合原理仅为S-RBD抗原与中和抗体的特异性结合，其相对于“胶体金标记的S-RBD抗原—中和抗体—中和抗体二抗”等其他复合物需要多种特异性结合的方式，本申请具有更好的专一性。
由此，本申请利用中和抗体与SARS-CoV-2 S-RBD抗原具有特异性结合的特点，检测专一性强，操作简单，其相对于传统竞争法具有更高的检测灵敏度，相对于比浊法能省去相关仪器的使用，适用于不同场景的现场检测，具有检测时间短、检测灵敏度高的特点，进而实现现场高准确度快检。
优选的，所述胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为1.8-2.4μL/cm的包被量固定于所述结合垫上。
优选的，所述SARS-CoV-2 S-RBD抗原按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为0.8-1.2μL/cm的包被量固定于所述检测线上。
通常接种人群体内的中和抗体浓度较低，若S-RBD抗原的浓度过高，其会增加原料投入成本；若S-RBD抗原的浓度过低，则会存在中和抗体结合不完全，在检测线上显色较浅；其中，胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原需多余检测垫上固定的SARS-CoV-2 S-RBD抗原，这是为了检测线上的SARS-CoV-2 S-RBD抗原都能结合上中和抗体并进行显色，便于检测人员观察显色情况，因此本申请优选胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为1.8-2.4μL/cm的包被量固定于所述结合垫上，SARS-CoV-2 S-RBD抗原按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为0.8-1.2μL/cm的包被量固定于所述检测线上。
优选的，所述结合垫上还包被有胶体金标记的鸡IgY，所述控制线上包被有羊抗鸡二抗。
由于鸡IgY相对于哺乳动物的IgG，无需进行采血，只需收集免疫母鸡产下的鸡蛋即可获得，因此其能有效降低试纸条的生产成本；由于鸡IgY与中和抗体存在较大的种系发生距离，两者之间不会发生交叉血清学反应，进而使得试纸条的检测更加准确，有效减少其在检测过程中产生假阴性或假阳性结果。
优选的，所述胶体金标记的鸡IgY按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为1.8-2.4μL/cm的包被量固定于所述结合垫上。
优选的，所述羊抗鸡二抗按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为0.8-1.2μL/cm的包被量固定于所述控制线上。
鸡IgY与羊抗鸡二抗为特异性结合，本申请在上述浓度足以在控制线上进行显色以便于检测人员的观察。
优选的，所述胶体金的粒径为13-60nm。
通过采用上述技术方案，若胶体金的粒径过大，则会影响胶体金在检测垫上的移动速度，若胶体金的粒径过小，则会影响检测线的显色深浅，本申请选用粒径为13-60nm的胶体金，保证检测线显色清晰的基础上，能进一步加快试纸条的检测速度。
优选的，所述检测垫采用Sartorius CN95膜。
通过采用上述技术方案，Sartorius CN95膜为具有衬垫物的硝酸纤维素膜，其孔径比CN150和CN140更大，因此排放速度也更快，能较快清除胶体金颗粒，阻止胶体金在检测垫上产生底色，进而便于检测人员对检测结果的观察。
第二方面，本申请提供一种SARS-CoV-2中和抗体试纸条的制备方法，采用如下的技术方案：
一种SARS-CoV-2中和抗体试纸条的制备方法，包括以下步骤：
①、预处理：将样品垫置于第一处理液中，于35-40℃恒温孵育25-40min，随后用PBS洗净，于35-40℃干燥1-6h，保存备用；将结合垫浸泡在第二处理液中，于35-40℃恒温孵育25-40min，随后用PBS洗净，于35-40℃干燥1-6h，保存备用；
其中，所述第一处理液包括20mM PBS、1.0wt%BSA、1.5wt%蔗糖和0.1wt%P300防腐剂；所述第二处理液包括20mM PBS、1.0wt%BSA、1.5wt%蔗糖、0.5wt%吐温和0.1wt%P300防腐剂；
②、喷涂固定：将SARS-CoV-2 ACE2按设定量喷涂在预处理后的样品垫上；将SARS-CoV-2 S-RBD抗原和质控蛋白分别与胶体金颗粒孵育形成胶体金标记的SARS-CoV-2 RBD抗原和胶体金标记的质控蛋白，随后将其按设定量喷涂在经②预处理后的结合垫上；
③、基线制作：将SARS-CoV-2 S-RBD抗原按设定量固定在检测垫上，形成检测线；将抗质控蛋白抗体按设定量固定在检测垫上，形成控制线；
④、试纸条组装：将包被有SARS-CoV-2 ACE2的样品垫、包被有胶体金标记的SARS-CoV-2 RBD抗原和胶体金标记的质控蛋白的结合垫、包被有检测蛋白和抗质控蛋白抗体的检测垫以及吸水垫设置在所述底板上并依次连接，制成所述SARS-CoV-2中和抗体试纸条。
通过采用上述技术方案，本申请对样品垫和结合垫均进行预处理，有助于SARS-CoV-2 ACE2更好地固定在样品垫上，胶体金标记的SARS-CoV-2 RBD抗原和胶体金标记的质控蛋白更好地固定在结合垫上，其采用喷涂的方式便于操作人员对使得上述基料的用量控制，提高试纸条的检测准确度。
第三方面，本申请提供一种试剂盒，采用如下的技术方案：
一种试剂盒，包括上述的SARS-CoV-2中和抗体试纸条。该试剂盒与上述试纸条相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请在S-RBD和ACE2抑制竞争法的基础上，通过夹心法检测中和抗体的浓度，可以定性或半定量检测样本中的SARS-CoV-2的含量，可在7min内实现中和抗体的可视化检测，并且检测专一性强，操作简单，能广泛用于评价接种育苗的人体内是否含有中和抗体，起到快速检测和筛查作用；而现有的胶体金是检测总抗，仅仅是检测有无传染上新冠病毒。
附图说明
图1是本申请实施例1中试纸条的结构示意图。
图2是本申请应用例8中试剂盒的结构示意图。
图中，1、底板；2、样品垫；3、结合垫；4、检测垫；5、吸水垫；6、检测线；7、控制线；8、外壳；81、底壳；82、顶盖；821、上样孔；822、观测孔。
具体实施方式
以下结合附图、实施例和对比例对本申请作进一步详细说明。其中，本申请中的生化试剂均为市售产品。
原料/中间体的制备例
鸡IgY购自上海延慕实业有限公司，货号为FK-025。
羊抗鸡二抗购自洛阳市佰泰科生物技术有限公司，mg/mL效价测定（ELISA）＞1:10万，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度＞96％；储存缓冲液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，含0.14mol/L氯化钠，pH7.4；P300防腐剂购自国药美国SIGMA公司。
人IgG购自北京伊塔生物科技有限公司，货号为YT7150。
抗人IgG抗体购自上海江莱生物科技有限公司，货号为AbM59504-10-PU。
SARS-CoV-2 S-RBD抗原购自南京申基生物科技有限公司，蛋白质构建为编码SARS-CoV-2（2019-nCoV）棘突蛋白RBD区域（Gln321-Ser591）的DNA序列，表达宿主为HEK293Cells，通过SDS-PAGE 确定纯度＞95%，通过LAL方法测定的每微克蛋白质<1.0EU，重组SARS-CoV-2 (2019-nCoV)棘突蛋白（RBD）由271个氨基酸组成，预测分子量为30.3kDa，储存缓冲液为150mM NaCl, 20mM NaHCO3, pH7.0。
SARS-CoV-2 ACE2购自南京申基生物科技有限公司，抗原来自哺乳动物细胞，融合his标签种属为人源，纯度＞90%（R250染色的SDS-PAGE胶），储存缓冲液为1×PBS，pH7.4。
制备例1
胶体金的制备
本申请中胶体金的制备方法，采用柠檬酸钠还原法制备胶体纳米颗粒，包括以下步骤：
（1）取99mL超纯水和1mL 1wt%的三氯金酸水溶液，混匀后，磁力搅拌煮沸；
（2）快速加入1.8mL1wt%的柠檬酸三钠溶液，继续加热煮沸；
（3）当胶体金溶液颜色由浅黄色变为蓝黑色，最后变为酒红色后，继续加热煮沸10min；
（4）当制备好的胶体金溶液的温度降至室温时，将制备好的胶体金溶液定容到100mL。
（5）最后，将制备好的胶体金溶液放于干净的玻璃瓶中，并于4℃环境条件下存放备用。
制备例2
胶体金标记的SARS-CoV-2 RBD抗原的制备
本申请中胶体金标记的SARS-CoV-2 RBD抗原的制备方法，包括以下步骤：
（1）取制备例1制备好的胶体金溶液2mL，用0.1M K2CO3调节pH值到8.0；
（2）逐滴加入200μL浓度为0.1ug/μL的SARS-CoV-2 S-RBD抗原，室温条件下磁力搅拌反应2h；
（3）逐滴加入10wt%的BSA溶液，使其终浓度为0.5wt%，室温条件下磁力搅拌反应30min：
（4）逐滴加入10wt%的PEG20000溶液，并使其终浓度为0.2wt%，室温条件下磁力搅拌30min；
（5）12000rpm离心力30min，弃掉上清，留下胶体金沉淀；
（6）向沉淀中加入1wt%的BSA溶液重悬胶体金，然后12000rpm离心，重复进行三次后，用胶体金重悬液（20mM PBS，2.5wt%蔗糖，0.5wt%吐温-20，0.02wt% PEG20000）重悬沉淀至原体积的1/10，制得胶体金标记的SARS-CoV-2 RBD抗原。
制备例3
胶体金标记的鸡IgY的制备
本申请中胶体金标记的鸡IgY的制备方法，包括以下步骤：
（1）取制备例1制备好的胶体金溶液2mL，用0.1M K2CO3调节pH值到8.0；
（2）逐滴加入200μL浓度为0.1ug/μL的鸡IgY，室温条件下磁力搅拌反应2h；
（3）逐滴加入10wt%的BSA溶液，使其终浓度为0.5wt%，室温条件下磁力搅拌反应30min：
（4）逐滴加入10wt%的PEG20000溶液，并使其终浓度为0.2wt%，室温条件下磁力搅拌30min；
（5）12000rpm离心力30min，弃掉上清，留下胶体金沉淀；
（6）向沉淀中加入1wt%的BSA溶液重悬胶体金，然后12000rpm离心，重复进行三次后，用胶体金重悬液（20mM PBS，2.5wt%蔗糖，0.5wt%吐温-20，0.02wt% PEG20000）重悬沉淀至原体积的1/10，制得胶体金标记的鸡IgY。
实施例
实施例1
一种SARS-CoV-2中和抗体试纸条，参见图1，包括底板1和设置在底板1上并依次连接的样品垫2、结合垫3、检测垫4和吸水垫5。
本实施例中，底板1的尺寸可以根据需要进行调整，其宽度通常为2.5-5.0mm，长度通常为4-8cm，本实施例中具体以宽3.0mm、长6cm为例进行说明。吸水垫5压住检测垫4的一端，检测垫4的另一端被结合垫3压住，样品垫2压住结合垫3远离检测垫4的一端。其采用压住的方式能使得相邻两个垫之间存在上下重叠部分，有助于减小待测样品在不同垫之间流动阻力，进而能进一步提高试纸条的检测速度。
其中的上下重叠部分的长度可以根据需要进行调整，本实施例中具体以2mm为例进行说明，即吸水垫5和结合垫3分别压住检测垫42mm，样品垫2压住结合垫3远离检测垫4的一端2mm。
另外，本实施例中的样品垫2和结合垫3均采用玻璃纤维素膜，由于玻璃纤维素膜具有毛细限位结构，能吸附比同等纤维素更多的水分，且流速块，可以快速吸收待测样品并输送至检测垫4中。检测垫4使用NC膜，具体为Sartorius CN95。这是由于Sartorius CN95膜为具有衬垫物的硝酸纤维素膜，其孔径比CN150和CN140更大，因此排放速度也更快，能较快清除胶体金颗粒，阻止胶体金在检测垫4上产生底色，进而便于检测人员对检测结果的观察。吸水垫5采用滤纸纤维，其同样具有良好的吸水效果，能将多余的待测样品进行吸附，保证试纸条在检测过程中的整洁。
样品垫2上包被有SARS-CoV-2 ACE2，结合垫3上包被有胶体金标记的SARS-CoV-2S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY，检测垫4上设置了检测线6和控制线7，检测线6上包被有SARS-CoV-2 S-RBD抗原，控制线7上包被有羊抗鸡二抗。
本实施例中，SARS-CoV-2 ACE2按浓度为1.0mg/mL、喷量为1.8-2.4μL/cm的包被量固定于样品垫2上，胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY均按浓度为1.0mg/mL、喷量为1.8-2.4μL/cm的包被量固定于结合垫3上，SARS-CoV-2 S-RBD抗原和羊抗鸡二抗均按浓度为1.0mg/mL、喷量为0.8-1.2μL/cm的包被量固定于检测线6上。这是由于通常接种人群体内的中和抗体浓度较低，若胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY的浓度过高，其会增加原料投入成本；若胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY的浓度过低，则会使检测线6和控制线7上显色较浅，不利于检测人员进行观察。
其中，样品垫2中的SARS-CoV-2 ACE2用于配合胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原，因此其包被量通常与胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原的包被量相关。胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原需多余检测垫4上固定的SARS-CoV-2 S-RBD抗原，胶体金标记的鸡IgY需多余控制线7上固定的羊抗鸡二抗，这是为了检测线6上的SARS-CoV-2 S-RBD抗原都能结合上中和抗体并进行显色，控制线7上的羊抗鸡二抗都能结合上胶体金标记的鸡IgY并进行显色，便于检测人员观察显色情况。
因此，本申请优选SARS-CoV-2 ACE2按30-40μg/cm2的包被量固定于样品垫2上，胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY均按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为1.8-2.4μL/cm的包被量固定于结合垫3上，SARS-CoV-2 S-RBD抗原和羊抗鸡二抗均按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为0.8-1.2μL/cm的包被量固定于检测线6上。另外，发明人经过大量试验验证，试纸条上的SARS-CoV-2 ACE2、胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原、胶体金标记的鸡IgY、SARS-CoV-2 S-RBD抗原和羊抗鸡二抗在上述包被量范围内拨动时，其显色明显，相应的检测灵敏度高和检测耗时相差较小。本实施例中SARS-CoV-2 ACE2、胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY具体以浓度为1.0mg/mL、喷量为2.0μL/cm的包被量，SARS-CoV-2 S-RBD抗原和羊抗鸡二抗具体以浓度为1.0mg/mL、喷量为1.0μL/cm的包被量为例进行说明。
本实施例中，若胶体金的粒径过大，则会影响胶体金在检测垫4上的移动速度，若胶体金的粒径过小，则会影响检测线6的显色深浅，因此本本实施例选用粒径为13-60nm的胶体金，其能在保证检测线6显色清晰的基础上，能进一步加快试纸条的检测速度。进一步优选为粒径均值为40nm的胶体金。
本实施例的SARS-CoV-2中和抗体试纸条的使用原理为：
将待测样品滴加在试纸条的样品垫2上，待测样品自样品垫2向吸水垫5方向流动。
若待检样品中不含有中和抗体，样品垫2中的SARS-CoV-2 ACE2会与结合垫3中的胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原结合，形成的ACE2—S-RBD抗原复合物进而被吸水垫5吸附，检测线6不会显色。与此同时，结合垫3中的胶体金标记的鸡IgY与控制线7上的羊抗鸡二抗结合，使得胶体金标记的鸡IgY固定在控制线7上，进而使得控制线7显色，以保证检测结果有效。
若待检样品中含有中和抗体，中和抗体会阻断样品垫2中SARS-CoV-2 ACE2与结合垫3中的胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原结合，检测线6上会产生胶体金标记的S-RBD、中和抗体、检测线6上包被的S-RBD形成的复合物，表现为检测线6显色，待检样品中的抗体含量与检测线6的显色强度呈正比。与此同时，结合垫3中的胶体金标记的鸡IgY与控制线7上的羊抗鸡二抗结合，使得胶体金标记的鸡IgY固定在控制线7上，进而使得控制线7显色，以保证检测结果有效。
本申请在S-RBD和ACE2抑制竞争法的基础上，通过夹心法检测中和抗体的浓度，整个检测耗时在7min以内，反应结束后，直接可以肉眼观察显色情况。本申请的夹心法形成的复合物为“胶体金标记的S-RBD抗原—中和抗体—S-RBD抗原”，其结合原理仅为S-RBD抗原与中和抗体的特异性结合，其相对于“胶体金标记的S-RBD抗原—中和抗体—中和抗体二抗”等其他复合物需要多种特异性结合的方式，本申请具有更好的专一性和灵敏性。
由此，本申请利用中和抗体与SARS-CoV-2 S-RBD抗原具有特异性结合的特点，检测专一性强，操作简单，其相对于传统竞争法具有更高的检测灵敏度，相对于比浊法能省去相关仪器的使用，适用于不同场景的现场检测，具有检测时间短、检测灵敏度高的特点，进而实现现场高准确度快检。
实施例2
一种SARS-CoV-2中和抗体试纸条的制备方法，用于制备实施例1的SARS-CoV-2中和抗体试纸条，具体包括以下步骤：
①、预处理：将样品垫2置于第一处理液中，于35-40℃恒温水浴箱中孵育25-40min，本实施例具体在37℃孵育30min，随后用PBS洗净第一处理液，于35-40℃烘箱内干燥1-6h，具体在37℃干燥5h至烘干PBS，保存备用；将结合垫3浸泡在第二处理液中，于35-40℃恒温水浴箱中孵育25-40min，本实施例中具体在37℃孵育30min，随后用PBS洗净第一处理液，于35-40℃烘箱内干燥1-6h，具体在37℃干燥2h至烘干PBS，保存备用；
其中，第一处理液包括20mM PBS、1.0wt%BSA、1.5wt%蔗糖和0.1wt%P300防腐剂；第二处理液包括20mM PBS、1.0wt%BSA、1.5wt%蔗糖、0.5wt%吐温和0.1wt%P300防腐剂；
②、喷涂固定：将SARS-CoV-2 ACE2以浓度为1.0mg/mL、喷量为2.0μL/cm的包被量喷涂在预处理后的样品垫2上；将胶体金标记的SARS-CoV-2 RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY均以浓度为1.0mg/mL、喷量为2.0μL/cm的包被量喷涂在经②预处理后的结合垫3上；
③、基线制作：将SARS-CoV-2 S-RBD抗原以浓度为1.0mg/mL、喷量为1.0μL/cm的包被量涂覆在检测垫4上，形成检测线6；将羊抗鸡二抗以浓度为1.0mg/mL、喷量为1.0μL/cm的包被量涂覆在检测垫4上，形成控制线7；
④、试纸条组装：将固定有SARS-CoV-2 S-RBD抗原和抗质控蛋白抗体的检测垫4固定在底板1上，再将吸水垫5以及包被有胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的质控蛋白的结合垫3分别固定在检测垫4相对两侧的底板1上，最后将包被有SARS-CoV-2ACE2的样品垫2固定在结合垫3远离检测垫4一侧的底板1上，至样品垫2、结合垫3、检测垫4和吸水垫5依次连接，制成SARS-CoV-2中和抗体试纸条。
实施例3-4
实施例3-4在实施例2的基础上，对试纸条上的SARS-CoV-2 ACE2、胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原、胶体金标记的鸡IgY、SARS-CoV-2 S-RBD抗原以及羊抗鸡二抗的包被量进行调整。
实施例3中SARS-CoV-2 ACE2、胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY的包被量具体为浓度为1.0mg/mL、喷量为1.0μL/cm，SARS-CoV-2 S-RBD抗原和羊抗鸡二抗的包被量具体为浓度为1.0mg/mL、喷量为0.5μL/cm。
实施例4中SARS-CoV-2 ACE2、胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY的包被量具体为浓度为1.0mg/mL、喷量为3.0μL/cm，SARS-CoV-2 S-RBD抗原和羊抗鸡二抗的包被量具体为浓度为1.0mg/mL、喷量为2.0μL/cm。
实施例5
本实施例在实施例2的基础上，将胶体金标记的鸡IgY更改为胶体金标记的人IgG，其制备方法参考制备例3。同时将羊抗鸡二抗更换为抗人IgG抗体。
实施例6-7
本实施例在实施例2的基础上，将胶体金的粒径进行调整。其中，实施例6中胶体金的粒径均值为8nm；实施例7中胶体金的粒径均值为80nm。
实施例8
本实施例在实施例2的基础上，样品垫和结合垫未进行预处理。
对比例1
本对比例在实施例2的基础上，将检测线上的SARS-CoV-2 S-RBD抗原更改为抗人IgG抗体。
对比例2
本对比例在实施例2的基础上，将SARS-CoV-2 ACE2、胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY的包被量具体为浓度为0.7mg/mL、喷量为1.6μL/cm，SARS-CoV-2 S-RBD抗原和羊抗鸡二抗的包被量具体为浓度为0.7mg/mL、喷量为1.3μL/cm。
对比例3
本对比例在实施例2的基础上，将SARS-CoV-2 ACE2、胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原和胶体金标记的鸡IgY的包被量具体为浓度为1.6mg/mL、喷量为1.7μL/cm，SARS-CoV-2 S-RBD抗原和羊抗鸡二抗的包被量具体为浓度为1.6mg/mL、喷量为0.7μL/cm。
性能检测试验
试纸条对中和抗体的检测
取100例接种过疫苗的人血清样本200份，没有接种过疫苗抗体的人血清100份，进行中和抗体性能评价。将每个血清样本分为8份，分别用实施例2-8以及对比例1的试纸条进行检测，检测结果参见下表一。
表一 实施例2-8以及对比例1的中和抗体检测结果
Figure 18712DEST_PATH_IMAGE001
由表一可得，实施例2的阳性率为100%，阴性率为100%；实施例3的阳性率为98%，阴性率为99%；实施例4的阳性率为99%，阴性率为100%；实施例5的阳性率为97.5%，阴性率为98%；实施例6的阳性率为98.5%，阴性率为98%；实施例7的阳性率为99%，阴性率为99%；对比例1的阳性率为95%，阴性率为96%；对比例2的阳性率为96%，阴性率为为96%；对比例3的阳性率为100%，阴性率为为100%，与实施例2的检测结果一致，但是浓度越高，成本越高，所以性价比不高。
因此，本申请实施例2-8的阳性率和阴性率相比于对比例1更接近100%，故本申请的试纸条具有更为突出的特异性，因此其准确性更高，其中实施例2的阳性率和阴性率均高于实施例3-6以及实施例8，而实施例7因原料用量增多而使其成本高于实施例1，故优选实施例2为优选实施例。
中和抗体灵敏度测试
使用抑制率为100%的阳性样本，和没有接种疫苗的阴性样本，经ELISA测试该阴性样本抑制率为0%，然后使用阴性样本对阳性样本进行稀释，稀释出不同浓度抑制率的样本，抑制率浓度分别为100%、75%、50%、35%、25%、20%、15%、10%、5%、2%、0%，然后对每个浓度检测20次，当阳性率低于100%时，此时的抑制率为产品的灵敏度。
检测结果显示，实施例2的灵敏度抑制率为10%，实施例3-4以及实施例6-8的灵敏度抑制率为15%，实施例5的灵敏度抑制率为20%，而对比例1的灵敏度抑制率为35%。因此。本申请的试纸条具有较高的灵敏度，其中实施例2为优选实施例。
因此，本申请的试纸条无需使用相关仪器，能适用于不同场景的现场检测，且检测时间短、检测灵敏度高，进而实现现场高准确度快检。
中和抗体检测时长测试
收集接种疫苗人员血清样本和未接种疫苗血清样本各3个作为待测样品，将该6个血清样本的每个血清样本分为8份，分别用实施例2-8以及对比例1的试纸条进行中和抗体检测；记录每个实施例/对比例的试纸条在准确测定待测样品时的平均最短检测时长（以试纸条显示结果与待测样品实际结果一致为准），测试结果参见下表二。
表二 实施例2-8以及对比例1的检测时长
Figure 945080DEST_PATH_IMAGE002
由表二可得，本申请的纸质条的检测时长均在7min内，能较好地应用于不同场景的现场快检。
应用例
本申请基于中和抗体竞争性胶体金检测试纸条的基础上，具体可以基于实施例2-8任一个实施例中的SARS-CoV-2中和抗体试纸条，进行夹心法检测试剂盒的开发，其在S-RBD和ACE2抑制竞争法的基础上，通过夹心法检测中和抗体的浓度，可以定性或半定性检测样本中的SARS-CoV-2中和抗体含量，在7min内实现中和抗体的检测，适用于疫苗接种后效果的评价。
本应用例具体为基于实施例1的SARS-CoV-2中和抗体试纸条所开发的试剂盒，参见图2，该试剂盒包括外壳8以及实施例1的SARS-CoV-2中和抗体试纸条，SARS-CoV-2中和抗体试纸条安装在外壳8内。外壳8能对SARS-CoV-2中和抗体试纸条进行防护，保证SARS-CoV-2中和抗体试纸条的平整性，便于待测样品更好地在SARS-CoV-2中和抗体试纸条上进行流动。
该外壳8通常由塑料制成，为方便SARS-CoV-2中和抗体试纸条的安装，外壳8具体由底壳81和顶盖82卡接固定而成。外壳8的顶盖82在SARS-CoV-2中和抗体试纸条的样品垫2处开设有至少一个上样孔821，本应用例中具体开设有一个，其用于待测样品进行定点加入，使得检测人员集中在同一部位进行加样，由此减少检测人员之间的检测差异性。外壳8的顶盖82在SARS-CoV-2中和抗体试纸条的检测垫4处开设有至少一个观测孔822，本应用例中具体开设有一个，由此便于检测人员更为直观地对检测结果进行读取。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种SARS-CoV-2中和抗体试纸条，其特征在于：包括底板（1）和设置在底板（1）上并依次连接的样品垫（2）、结合垫（3）、检测垫（4）和吸水垫（5）；
其中，所述样品垫（2）上包被有SARS-CoV-2 ACE2，所述结合垫（3）上包被有胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原，所述检测垫（4）上设置了检测线（6）和控制线（7），所述检测线（6）上包被有SARS-CoV-2 S-RBD抗原。
2.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2中和抗体试纸条，其特征在于：所述胶体金标记的SARS-CoV-2 S-RBD抗原按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为1.8-2.4μL/cm的包被量固定于所述结合垫（3）上。
3.根据权利要求2所述的SARS-CoV-2中和抗体试纸条，其特征在于：所述SARS-CoV-2S-RBD抗原按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为0.8-1.2μL/cm的包被量固定于所述检测线（6）上。
4.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2中和抗体试纸条，其特征在于：所述结合垫（3）上还包被有胶体金标记的鸡IgY，所述控制线（7）上包被有羊抗鸡二抗。
5.根据权利要求4所述的SARS-CoV-2中和抗体试纸条，其特征在于：所述胶体金标记的鸡IgY按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为1.8-2.4μL/cm的包被量固定于所述结合垫（3）上。
6.根据权利要求5所述的SARS-CoV-2中和抗体试纸条，其特征在于：所述羊抗鸡二抗按浓度为0.8-1.5mg/mL、喷量为0.8-1.2μL/cm的包被量固定于所述控制线（7）上。
7.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2中和抗体试纸条，其特征在于：所述胶体金的粒径为13-60nm。
8.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2中和抗体试纸条，其特征在于：所述检测垫（4）采用Sartorius CN95膜。
9.一种根据权利要求1-8中任一项所述的SARS-CoV-2中和抗体试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①、预处理：将样品垫（2）置于第一处理液中，于35-40℃恒温孵育25-40min，随后用PBS洗净，于35-40℃干燥1-6h，保存备用；将结合垫（3）浸泡在第二处理液中，于35-40℃恒温孵育25-40min，随后用PBS洗净，与35-40℃干燥1-6h，保存备用；
其中，所述第一处理液包括20mM PBS、1.0wt%BSA、1.5wt%蔗糖和0.1wt%P300防腐剂；所述第二处理液包括20mM PBS、1.0wt%BSA、1.5wt%蔗糖、0.5wt%吐温和0.1wt%P300防腐剂；
②、喷涂固定：将SARS-CoV-2 ACE2按设定量喷涂在预处理后的样品垫（2）上；将SARS-CoV-2 S-RBD抗原和质控蛋白分别与胶体金颗粒孵育形成胶体金标记的SARS-CoV-2 RBD抗原和胶体金标记的质控蛋白，随后将其按设定量喷涂在经②预处理后的结合垫（3）上；
③、基线制作：将SARS-CoV-2 S-RBD抗原按设定量固定在检测垫（4）上，形成检测线（6）；将抗质控蛋白抗体按设定量固定在检测垫上，形成控制线（7）；
④、试纸条组装：将包被有SARS-CoV-2 ACE2的样品垫（2）、包被有胶体金标记的SARS-CoV-2 RBD抗原和胶体金标记的质控蛋白的结合垫（3）、包被有检测蛋白和抗质控蛋白抗体的检测垫（4）以及吸水垫（5）设置在所述底板（1）上并依次连接，制成所述SARS-CoV-2中和抗体试纸条。
10.一种试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1-8中任一项所述的SARS-CoV-2中和抗体试纸条。
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