CN111443199A

CN111443199A - 磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂及其制备方法

Info

Publication number: CN111443199A
Application number: CN202010253328.XA
Authority: CN
Inventors: 杨宇; 刘艳丽; 聂聪
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-04-02
Filing date: 2020-04-02
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2040-04-02
Also published as: CN111443199B

Abstract

本发明涉及一种磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂及其制备方法，试剂包括由加样垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素检测膜及吸水垫依次搭接并贴在底衬卡构成的免疫层析试纸和磁性纳米颗粒捕获试剂，其中，所述硝酸纤维素检测膜上包被有兔抗N蛋白多克隆抗体的质控线和新冠肺炎病毒N蛋白的检测线，所述磁性纳米颗粒捕获试剂为新冠肺炎病毒N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米磁颗粒。本发明提供的试剂采用制备的新冠肺炎病毒N蛋白抗原进行制备，可有效用于检测新冠肺炎病毒抗体，检测结果灵敏度高、特异性强，检测结果可靠稳定，可通过肉眼观察来判断检测结果，并不需要仪器也可进行判断，使用方便。

Description

磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的检测试剂及其制备方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

2019新型冠状病毒与SARS-CoV同属于网巢病毒目冠状病毒科乙型冠状病毒属，为一种不分节段的单股正链RNA病毒。病毒具有包膜、颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，该病毒变异快、宿主多，具有较强的宿主适应性。目前已造成上百个国家上万人感染的全球大流行。

防控疫情的关键在于早发现、早隔离、早诊断、早治疗。各大医疗机构急需明确诊断对抗疫情，其中核酸检测方法和试剂在确诊工作中扮演最重要的角色，是疫情诊断的金标准。但目前核酸检测试剂不仅短缺，而且存在着检出率不高，经常出现假阴性的问题；连续几天进行核酸检测，直到检测3-4次后才能确诊是核酸阳性，而且受PCR实验环境设施的严格要求，具有检测资质的实验室数量有限。这些都在影响新型冠状病毒肺炎病人的确诊，成为影响疫情防控的瓶颈问题。如何开发快速、有效的新冠肺炎病毒抗体检测试剂迫在眉睫。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂及其制备方法。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂，其包括由加样垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素检测膜及吸水垫依次搭接并贴在底衬卡构成的免疫层析试纸和磁性纳米颗粒捕获试剂，其中，所述硝酸纤维素检测膜上包被有兔抗N蛋白多克隆抗体的质控线和新冠肺炎病毒N蛋白的检测线，所述磁性纳米颗粒捕获试剂为新冠肺炎病毒N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米磁颗粒。

在一个优选的实施方案中，所述新冠肺炎病毒N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一个优选的实施方案中，所述新冠肺炎病毒N蛋白的表达采用如 SEQ ID NO.1所示基因序列进行。

在一个优选的实施方案中，所述加样垫为含鼠抗人红细胞抗体的处理液进行浸泡处理后的玻璃纤维膜。

在一个优选的实施方案中，所述玻璃纤维垫为经含有重量百分比为 0.1％的Tris碱、1％的BSA和5％的蔗糖溶液浸泡过的玻璃纤维膜。

经大量实验验证，如果对免疫层析试纸中对玻璃纤维垫不进行处理时，加入待测样品的稀释液时，会有少数试纸条出现假阳性，所以将玻璃纤维垫采用重悬液处理后，有效避免了假阳性的发生。

一种磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂的制备方法，所述其包括如下步骤：

S1、将四氧化三铁磁性纳米磁颗粒羧基化后，加入新冠肺炎病毒N 蛋白进行标记，获得新冠肺炎病毒N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米磁颗粒捕获试剂；

S2、将玻璃纤维膜经重悬液浸泡后，干燥获得玻璃纤维垫；

S3、硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线，质控线上包被有兔抗N 蛋白多克隆抗体，检测线上包被有新冠肺炎病毒N蛋白，获得硝酸纤维素检测膜；

S4、将玻璃纤维膜浸入含有鼠抗人红细胞抗体的处理液中浸泡处理后，取出烘干，获得加样垫；

S5、将加样垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素检测膜、吸水垫依次搭接并贴在底衬卡组成，按硝酸纤维素检测膜上靠近质控线的一端覆盖上吸水垫，靠近检测线的另一端覆盖玻璃纤维垫进行贴条。

在一个优选的实施方案中，在步骤S1中，所述四氧化三铁磁性纳米磁颗粒的粒径大小为15nm，羧基化采用质量分数25％的戊二醛溶液进行。

在一个优选的实施方案中，在步骤S1中，所述新冠肺炎病毒N蛋白标记的浓度为2mg/mL，标记时反应时间为3h，磁吸附后弃去溶液，再加入0.5％BSA溶液，摇晃30分钟，进行封闭；磁吸附后弃去溶液，加入含0.01％吐温-20浓度为0.01mol/L的PBS，洗涤；在加入重悬液，获得 N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂溶液，其中，重悬液中含有重量百分比为0.1％的Tris碱、1％的BSA和5％的蔗糖。

经大量实验证明，如果不采用含有0.5％的BSA溶液进行封闭，会出现假阳性结果。

在一个优选的实施方案中，所述新冠肺炎病毒N蛋白的获得采用基因序列如SEQID NO.1进行表达制备。

在一个优选的实施方案中，在步骤S2中，所述重悬液为含有重量百分比为0.1％的Tris碱、1％的BSA和5％的蔗糖溶液。

在一个优选的实施方案中，在步骤S3中，所述兔抗N蛋白多克隆抗体的包被浓度为1.2mg/mL和新冠肺炎病毒N蛋白的包被浓度为2mg/mL。

本发明通过大量实验验证获得湿法免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂。采用了磁性纳米颗粒捕获试剂为新冠肺炎病毒N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米磁颗粒，通过磁性的吸附作用起到富集的作用，将待检测血清，血浆，全血或指尖血加入磁性纳米颗粒捕获试剂中，如果待测血清或血浆或指尖血中有被感染新冠肺炎病毒产生的抗体时，抗体会与血新冠肺炎病毒N蛋白结合，而新冠肺炎病毒N蛋白是包被在四氧化三铁磁性纳米磁颗粒上，通过磁力架的磁力吸附的作用，会将抗体- 新冠肺炎病毒N蛋白-四氧化三铁磁性纳米磁颗粒的复合物吸附，此时弃去血清、血浆，全血或指尖血，达到富集抗体的目的。再将复合物重溶到50μL缓冲液，加入上述制备的免疫层析试纸的加样孔中，提高检测灵敏度。并且在取样时，指尖血仅需要50μL，通过采用磁性纳米颗粒捕获试剂可有效富集待测样品中的抗体，极大的提高了检测灵敏度。

本发明还对加样垫进行了处理，通过大量实验发现，经过含有鼠抗人红细胞抗体处理过的加样垫，可有效避免假阴性的发生。因采用未处理的加样垫进行全血、血浆或指尖血的检测时，会出现拖尾、滞留等现象，与条带上抗原结合不完全的现象，导致假阴性的发生。当采用含有鼠抗人红细胞抗体处理过的加样垫，可将全血或血浆或指尖血中的一些红细胞抗体吸附，避免假阴性发生。

本发明经过研究发现，磁性纳米颗粒捕获试剂不进行重量百分比为 0.1％的Tris碱、1％的BSA和5％的蔗糖重悬或用其它重悬液时，会有非特异性条带出现，导致假阳性的发生。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种新冠肺炎病毒N蛋白，该蛋白可用做为抗原，用于检测新冠肺炎病毒抗体免疫试剂的制备。采用该新冠肺炎病毒N蛋白制备的磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂，其检测灵敏度和特异性较强，可有效用于感染新冠肺炎病毒的后产生阳性抗体的检测。

本发明提供的磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂，采用制备的新冠肺炎病毒N蛋白抗原进行制备，该免疫层析试剂用于检测新冠肺炎病毒抗体IgG或/和IgM。本发明提供的检测新冠肺炎病毒抗体的磁性纳米颗粒免疫层析试剂，可通过磁性吸附富集作用捕获体系内更多的被检物，通过富集作用提高检测灵敏度。试剂成本低，检测试剂溶液稳定、特异性强、灵敏度高、比胶体金检测结果灵敏度高10 倍，检测结果准确可靠，操作简单，不需要较强的专业技术就可以操作，通过肉眼观察来判断检测结果，并不需要仪器也可进行判断，使用方便。

本发明提供的磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂，用于检测新冠肺炎病毒抗体时，检测上样量可达到1mL，之后进行富集反应，去除吸附后液体，之后再加入重悬液进行反应，有效提高了检测样品的灵敏度，能有效避免假阴性的结果。

附图说明

图1为纯化重组N抗原蛋白的电泳结果；

图2为纯化重组S抗原蛋白的电泳结果；

图3为样品富集前的照片；

图4为样品富集后的照片；

图5为对样品垫进行处理和不处理进行检测结果的照片；

图6为用实施例3制备的磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂检测阳性样本的结果；

图7为胶体金层析试纸检测阳性样本的结果。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述，下面实施例中未做特别说明的，均采用本领域技术的常规技术方法。

实施例1重组新冠肺炎病毒N蛋白抗原的制备

1.1重组质粒的构建

选择新冠肺炎病毒N蛋白，其核苷酸序列(GNnBank序列号： HM133639.1)，依据大肠杆菌NschNrichia coli O127:H6偏爱密码子对基因序列进行改造，经大量实验研究，获得了增大的表达效率，外源蛋白表达效率达70％以上，并通过生物信息学对重组蛋白二级结构筛选，获得优化后的基因序列如SEQ ID NO.1所示，其对应的氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示，委托上海生工公司合成优化的基因序列(SEQ ID NO.1)，基因克隆至表达载体pNT30a，获得重组质粒。经试验研究表明如果采用没有优化过的基因序列进行重组表达，并不能获得重组蛋白。

1.2重组蛋白的表达及鉴定

将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21，将鉴定正确的单菌落接种到含氨苄青霉素(浓度为10μg/mL)的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜，次日按1:100接种于新的含氨苄青霉素的LB液体培养基中震荡培养至OD600达0.8后，冷却菌液温度至22℃，加入IPTG使其终浓度为0.8mmol/L，在22℃进行诱导表达；并于6小时后吸取1mL菌液，超声裂解，收集菌液，水浴煮沸10min，4℃、12000r/min离心3min，冰上放置，吸取上清和沉淀进行12％的SDS-PAGN电泳检测；电泳结束后，胶用考马斯亮兰染色80min，再脱色2h后观察蛋白诱导表达情况，结果在沉淀中出现目标蛋白，约为45KD大小的蛋白。

1.3重组蛋白的纯化

吸取2mL诱导表达菌液4℃，12000r/min离心30分钟，收集细胞沉淀，用0.01MpH7.4的PBS洗涤三次，加入pH8.0裂解液(Tris-Nacl) 悬浮，超声，离心后后沉淀加入pH8.0浓度为8mol/L的尿素悬浮，置于冰上摇2小时溶解包涵体，12000r/min，离心30分钟，上清液经0.22μm 的滤膜过滤后用His Trap TMHP(组氨酸)亲和吸附柱纯化系统进行纯化， SDS-PAGN鉴定纯度，最后将纯化的蛋白透析到0.01mol/L，pH7.4的PBS 中，PNG-20000浓缩，得到分子量约45KD的纯化重组蛋白，结果如图1 所示，图中从左到右，M为Mark，1为菌液沉淀的条带，2为纯化后的蛋白的条带。取2mg纯化的重组蛋白制备多克隆抗体，采用常规方法进行免疫兔子，获得阳性兔血清，纯化后获得兔抗N蛋白多克隆抗体。

实施例2重组新冠肺炎病毒S抗原蛋白的制备

制备新冠肺炎病毒S蛋白抗原具体步骤如下：

对新冠肺炎病毒抗原的选择，本发明发明人进行多次试验，最终确定选择新冠肺炎病毒刺突蛋白(S蛋白)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示，依据大肠杆菌Ecoli O127:H6偏爱密码子对基因序列进行改造，并通过生物信息学对重组蛋白二级结构筛选，并经多次实验验证，最终确定的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

按照SEQ ID NO.4所示的序列委托上海英俊公司合成，连接入表达载体PGEX-4T-2，获得连接产物即重组质粒，转化于DH5α感受态细胞；用PCR和双酶切鉴定重组质粒，筛选阳性克隆送上海英俊公司测序，将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21，将鉴定正确的单菌落接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜，次日按1:100接种于新的含氨苄青霉素的LB液体培养基中震荡培养至OD600达0.8后，冷却菌液温度至22℃，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG，在22℃进行诱导表达；并分别于1h、2h、3h、4h、5h、6h时吸取1mL菌液，超声裂解，收集菌液，100℃煮沸10min，4℃、12000r/min离心3min，冰上放置，吸取上清进行SDS-PAGE电泳检测；电泳结束后，胶用考马斯亮兰染色 80min，再脱色2h后观察蛋白诱导表达情况；从诱导后1h起就有分子量约为25KD的目的蛋白表达，6h时产量最高。

吸取2ml诱导表达6h的菌液12000r/min离心30分钟，收集细胞沉淀，用0.01MpH7.4的PBS洗涤三次，加入pH8.0裂解液(Tris-NaCl) 悬浮，超声，离心后分别取10μl上清和沉淀做SDS-PAGE，电泳后用考马斯亮蓝R-250进行凝胶染色，脱色液进行脱色后检查特异性目的蛋白条带。结果表明重组蛋白以包涵体的形式表达，收集超声离心后的细胞沉淀(主要含有一些细胞碎片和包涵体)，加入pH8.0浓度为8mol/L的尿素悬浮，置于冰上摇2小时溶解包涵体，12000r/min，离心30分钟，上清液经0.22μm的滤膜过滤后用His Trap TMHP(组氨酸)亲和吸附柱纯化系统进行纯化，SDS-PAGE鉴定纯度，最后将纯化的蛋白透析到0.01mol/L，pH7.4的PBS中，PEG-20000浓缩，得到分子量约25KD的纯化重组S蛋白。电泳结果如图2所示，图中从左到右，第1条带为Mark，第2条带为菌液沉淀的条带0.01M，pH7.4的PBS的对照，第3条带为纯化后的蛋白的，进行10倍稀释的条带，第4条为纯化后的蛋白，进行100倍稀释的条带，第5条为纯化后的蛋白，进行1000倍稀释的条带。

取2mg纯化的重组S蛋白制备多克隆抗体，采用常规方法进行免疫兔子，获得阳性兔血清，纯化后获得兔抗S蛋白多克隆抗体。

实施例3磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂的优化制备

(1)、磁性纳米颗粒捕获试剂

a、取100μL四氧化三铁磁性纳米磁颗粒溶液(粒径为15nm，

2mg/mL)，用质量分数为25％的戊二醛溶液将四氧化三铁磁性纳米颗粒进行羧基化处理2h；之后用在PBS溶液洗2次，磁吸附后弃去溶液，在四氧化三铁磁性纳米颗粒中加入pH值7.6，500μL，浓度为2mg/mL的实施例1中制备的新冠肺炎病毒N蛋白，摇晃3h；磁吸附后弃去溶液，再加入500μL，0.5％BSA，摇晃30分钟，进行封闭；磁吸附后弃去溶液，加入含0.01％吐温-20浓度为0.01mol/L的PBS 1mL，洗4次；加入1mL 重悬液，获得N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂溶液，其中重悬液中含有重量百分比为0.1％的Tris碱、1％的BSA和5％的蔗糖，混匀4℃保存。

b、用实施例2中制备的新冠肺炎病毒S蛋白标记四氧化三铁磁性纳米磁颗粒，方法同a步骤的操作，获得新冠肺炎病毒S蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂溶液。

(2)、玻璃纤维垫的制备

将玻璃纤维浸泡在含有重量百分比为0.1％的Tris碱、1％的BSA和 5％的蔗糖的重悬液1h，取出后，37℃烘箱干燥，干燥3.5h后，保存。

(3)、硝酸纤维素检测膜

A、以包被缓冲液将1.2mg/mL的兔抗N蛋白多克隆抗体和实施例 1中制备的新冠肺炎病毒N蛋白2mg/mL稀释配置成质控线工作液(C) 和检测线工作液(T)，用包被机将质控线和检测线工作液划膜至硝酸纤维素膜上，置干燥箱37℃烘干，干燥保存。包被缓冲液为0.01M的PBS (PH7.4)。

B、以包被缓冲液将1.2mg/mL的兔抗S蛋白多克隆抗体和实施例2 中制备的新冠肺炎病毒S蛋白2mg/mL稀释配置成质控线工作液(C)和检测线工作液(T)，用包被机将质控线和检测线工作液划膜至硝酸纤维素膜上，置干燥箱37℃烘干，干燥保存，包被缓冲液为0.01M的PBS (PH7.4)。

C、以包被缓冲液将1.2mg/mL的兔抗S蛋白多克隆抗体和实施例2 中制备的新冠肺炎病毒N蛋白2mg/mL稀释配置成质控线工作液(C)和检测线工作液(T)，用包被机将质控线和检测线工作液划膜至硝酸纤维素膜上，置干燥箱37℃烘干，干燥保存，包被缓冲液为0.01M的PBS (PH7.4)。

D、以包被缓冲液将1.2mg/mL的兔抗N蛋白多克隆抗体和实施例2 中制备的新冠肺炎病毒S蛋白2mg/mL稀释配置成质控线工作液(C)和检测线工作液(T)，用包被机将质控线和检测线工作液划膜至硝酸纤维素膜上，置干燥箱37℃烘干，干燥保存，包被缓冲液为0.01M的PBS (PH7.4)。

(4)、加样垫

将鼠抗人红细胞抗体以0.01M PB(PH7.4)的稀释液稀释至0.2mg/ mL后制备成处理液，将加样垫(玻璃纤维)浸泡在处理液中4个小时，取出37℃烘干3小时，干燥保存。

(5)、组装

将加样垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素检测膜、吸水垫依次粘贴在PVC 底板上，其中，硝酸纤维素检测膜上靠近质控线的一端覆盖上吸水垫，靠近检测线的另一端覆盖玻璃纤维垫，切裁制得宽4mm的免疫层析试纸，最后将免疫层析试纸装入卡壳制得检测试剂卡，吸水垫为吸水纸或纯棉绒浆滤纸。

在进行新冠肺炎病毒抗体的检测时，取1000μL血清样品加入10μL 磁性纳米颗粒捕获试剂，混匀，富集前的照片图3所示，2min后，置于磁力架上，1min后，如图4所示，磁珠富集在磁场附近，去掉液体，再加入50μL 0.01M的PBS，重悬磁性纳米颗粒捕获试剂，之后全部滴加在样品垫上，并且在2分钟后取50μL TMB应用液(含有TMB含量为 5mg/ml，过氧化氢的摩尔浓度为0.75m mol/L的溶液)滴加在样品垫上， 10min后判断结果。若仅质控带出现棕黄色，结果为阴性，说明待检血清样品中不含有新冠肺炎病毒抗体；若质控带和检测带均出现棕黄色，结果为阳性，说明待血清检样品中含有新冠肺炎病毒抗体；若两条带都没有显色或者只有检测带显色，则说明此检测试剂已经失效，结果无效。

在步骤(1)中制备的磁性纳米颗粒捕获试剂有两种，在步骤(3) 中制备了4中不同的硝酸纤维素检测膜，组装后有4种检测试剂卡，与磁性纳米颗粒捕获试剂中的两种分别对应用于4种检测试剂卡进行检测，这样形成8中试剂。即N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂分别对应A、B、C、D制备的硝酸纤维素检测膜，S蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂分别对应A、B、C、D制备的硝酸纤维素检测膜。

对3个阳性样品的血清，分别采用正常人血清分别进行10倍、50倍、 100倍稀释后，采用上面配对的8中试剂进行检测，结果表明，只有采用 N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂，兔抗N蛋白多克隆抗体为质控线和新冠肺炎病毒N蛋白为检测线的检测试剂条均能将10倍、 50倍、100倍稀释后的样品按照上述检测方法检测出来，其它组成的检测试剂，只能检测10倍、50倍稀释后的样品，说明新冠肺炎病毒N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂，兔抗N蛋白多克隆抗体为质控线和新冠肺炎病毒N蛋白为检测线的检测试剂条的检测效果较佳。也充分说明新冠肺炎病毒N蛋白可有效捕获感染新冠肺炎病毒的抗体。

进一步为验证检测试剂的准确性，针对N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂，兔抗N蛋白多克隆抗体为质控线和新冠肺炎病毒 N蛋白为检测线的检测试剂条组成的检测试剂(简称N蛋白试剂)与S 蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂，兔抗S蛋白多克隆抗体为质控线和新冠肺炎病毒S蛋白为检测线的检测试剂条组成的检测试剂(简称S蛋白试剂)，对20份阳性样品血清和100份正常人血清进行检测。

检测结果表明：S蛋白试剂检测的20份阳性样品血清中有2份检测结果为阴性，100份正常人血清检测结果均为阴性，说明S蛋白阳性检出率为80％；N蛋白试剂检测的20份阳性样品血清中有20份检测结果为阳性，100份正常人血清检测结果均为阴性，说明N蛋白阳性检出率为 100％。结果说明N蛋白试剂优于S蛋白试剂。

本发明制备的以新冠肺炎病毒N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂，以兔抗N蛋白多克隆抗体为质控线和新冠肺炎病毒N蛋白为检测线的检测试剂条用于检测新冠肺炎病毒抗体是检测总的抗体，包括有早期出现的IgM和晚期出现的IgG。研究表明感染新冠肺炎病毒后3 天出现新冠肺炎病毒IgM抗体，即可采用本发明的检测试剂检测出阳性，感染新冠肺炎病毒后7天左右出现新冠肺炎病毒IgG抗体，可采用本发明的检测试剂检测出阳性，采用新冠肺炎病毒N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂，以兔抗N蛋白多克隆抗体为质控线和新冠肺炎病毒N蛋白为检测线的检测试剂条，进行新冠肺炎病毒抗体的检测能有效避免了漏检。

实施例4全血、血浆样本检测

本实施例对于全血、血浆、指尖血的样本的检测采用特殊处理过的样品垫，即实施例3中的鼠抗人红细胞抗体处理方法处理过的样品垫与未经过处理的样品垫，其它处理相同，之后进行对比，结果表明未处理的样品垫进行检测时，全血、血浆、指尖血上样后会出现拖尾、滞留等现象，结果见图5，出现结合不充分、与条带上抗原结合不完全等问题，会出现将阴性结果。经过本实施例3中对样品垫的处理，可有效对血清、血浆检测，检测更方便，利于筛查，取肝素抗凝剂的全血和血浆样本、血清样本，各20份；将三份新冠肺炎病毒抗体阳性样本，分别以血清、血浆、全血10×稀释，抽取按实施例3方法制备的三个批次的新冠肺炎病毒N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂，以兔抗N蛋白多克隆抗体为质控线和新冠肺炎病毒N蛋白为检测线的检测试剂条进行依次测定，验证全血、血浆的检测结果是一致的，说明本发明制备的试剂可用于对血清、血浆、全血检测，结果是一样准确。

需要说明的是，对于血清、血浆、全血的检测时，所用的样品为1mL，而对于同一来源的指尖血只需取样为50μL，加入0.01M的PBS 950μL进行富集反应，检测结果与血清、血浆、全血的检测结果相同。

经过实验验证证明，采用本发明制备的检测试剂，其检测灵敏度大大提高，其原因有：因现有技术中采用的是采用的血清、血浆、全血的上样量为50μL，而本申请中采用的上样量为1mL，进行富集之后，再进行的检测，这样大大提高了检测的灵敏度及检测准确性，一些隐性的携带病毒的患者，采用本发明的试剂，可比现有的胶体金的试剂提前一天，判断出是阳性的结果。

实施例5

用实施例3制备的新冠肺炎病毒N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂，以兔抗N蛋白多克隆抗体为质控线和新冠肺炎病毒N蛋白为检测线的检测试剂条快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂用于检测一份新冠肺炎病的阳性样本以正常人血清分别进行10倍、100倍、1000倍稀释后的样品，取加样量为50μL，直接加入新冠肺炎病毒N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂，进行检测，检测结果显示，三个梯度的稀释样品结果均为阳性，见如图6所示。

同时作为对比：采用实施例1制备的新冠肺炎病毒N蛋白制备胶体金层析试纸，采用常规方法制备，采用SPA标记胶体金颗粒，硝酸纤维素膜上的检测带包被有N蛋白抗原，质控带包被羊抗鼠IgG；获得的胶体金免疫层析试纸，采用正常人血清分别进行10倍、100倍、1000倍稀释的新冠肺炎病的阳性样本进行检测，取加样量为50μL，检测结果显示，可以检测10倍、100倍稀释的阳性样品，结果见如图7所示。在同等条件下，由检测结果说明本发明的磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂，比胶体金层析试纸检测灵敏度高，灵敏度提高了10 倍。

如果对于实际样品的检测，检测所用的上样量是可以采用1mL，之后进行富集后，弃去溶液，再加入50μL 0.01M的PBS重悬磁珠进行检测，这样更大大提高了检测样品的灵敏度，这是由于检测样本的用量增加，导致检测灵敏度大幅度提高，这也是本发明提供采用富集技术提高检测灵敏度的一个原因，解决了现有技术检出率低，假阴性结果高的技术问题。

实施例6特异性检测

将采用实施例3方法制备的新冠肺炎病毒N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂，以兔抗N蛋白多克隆抗体为质控线和新冠肺炎病毒N蛋白为检测线的检测试剂条与商业化新型冠状病毒(2019-nCoV) 抗体检测试剂盒(胶体金法)同时检测20份阳性标本，两种方法的检测结果均为阳性(+)的结果；同时检测50份正常人血清，两种方法的检测结果均为阴性(－)结果；同时检测特异性样本：甲型流感病毒的阳性血清、乙型流感病毒的阳性血清、腺病毒的阳性血清、呼吸道合胞病毒的阳性血清，两种方法的检测结果均为阴性(－)结果，说明本发明磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂检测，结果准确、特异性强。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 杨宇

刘艳丽

聂聪

<120> 磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂及其制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagcgata atggtccgca gaatcagcgt aatgcaccgc gtattacctt tggtggtccg 60

agcgatagca ccggtagcaa tcagaatggt gaacgtagcg gtgcacgtag caaacagcgt 120

cgtccgcagg gtctgccgaa taataccgca agctggttta ccgcactgac ccagcatggt 180

aaagaagatc tgaaatttcc gcgtggtcag ggtgttccga ttaataccaa tagcagtccg 240

gatgatcaga ttggttatta tcgtcgtgca acccgtcgta ttcgtggtgg tgatggtaaa 300

atgaaagatc tgagtccgcg ttggtatttc tattatcttg gcaccggtcc ggaagcaggt 360

ctgccgtatg gtgcaaataa agatggtatt atttgggttg ccaccgaagg tgcactgaat 420

accccgaaag atcatattgg cacccgtaat ccggcaaata atgcagcaat tgttctgcag 480

ctgccgcagg gtacaaccct gccgaaaggt ttttatgccg aaggtagccg tggtggtagc 540

caggcaagca gccgtagcag cagccgttca cgtaatagta gccgtaatag cacaccgggt 600

agcagccgtg gcacctcacc ggcacgtatg gcaggtaatg gcggtgatgc agcactggca 660

ctgctgctgc tggatcgtct gaatcagctg gaaagcaaaa tgagcggtaa aggtcagcag 720

caacagggtc agaccgttac caaaaaaagc gcagcagaag caagcaaaaa accgcgtcag 780

aaacgtaccg caaccaaagc atataatgtt acccaggcat ttggtcgtcg tggtccggaa 840

cagacccagg gtaattttgg tgatcaagaa ctgattcgtc agggcaccga ttataaacat 900

tggcctcaga ttgcacagtt tgcaccgagc gcaagtgcat tttttggcat gagccgtatt 960

ggtatggaag ttaccccgag cggcacctgg ctgacctata caggtgcaat taaactggat 1020

gataaagatc cgaacttcaa ggatcaggtg attctgctga acaaacatat cgatgcctat 1080

aaaacatttc cgcctaccga accgaaaaaa gataaaaaga aaaaggccga tgaaacccag 1140

gcactgccgc agcgccagaa aaaacagcag acagttaccc tgctgcctgc agcagatctg 1200

gatgatttta gtaaacagct gcagcaaagc atgagcagcg cagatagcac ccaggcatga 1260

<210> 2

<211> 419

<212> PRT

<213> N蛋白(Nucleocapsid protein)

<400> 2

Met Ser Ala Ala Gly Pro Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ile Thr

1 5 10 15

Pro Gly Gly Pro Ser Ala Ser Thr Gly Ser Ala Gly Ala Gly Gly Ala

20 25 30

Ser Gly Ala Ala Ser Leu Gly Ala Ala Pro Gly Gly Leu Pro Ala Ala

35 40 45

Thr Ala Ser Thr Pro Thr Ala Leu Thr Gly His Gly Leu Gly Ala Leu

50 55 60

Leu Pro Pro Ala Gly Gly Gly Val Pro Ile Ala Thr Ala Ser Ser Pro

65 70 75 80

Ala Ala Gly Ile Gly Thr Thr Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ile Ala Gly

85 90 95

Gly Ala Gly Leu Met Leu Ala Leu Ser Pro Ala Thr Thr Pro Thr Thr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Gly Ala Gly Leu Pro Thr Gly Ala Ala Leu Ala

115 120 125

Gly Ile Ile Thr Val Ala Thr Gly Gly Ala Leu Ala Thr Pro Leu Ala

130 135 140

His Ile Gly Thr Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ile Val Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Gly Gly Thr Thr Leu Pro Leu Gly Pro Thr Ala Gly Gly Ser

165 170 175

Ala Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ala

180 185 190

Ser Ser Ala Ala Ser Thr Pro Gly Ser Ser Ala Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Ala Met Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Ala Ala Leu Ala Gly Leu Gly Ser Leu Met Ser Gly Leu Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Thr Val Thr Leu Leu Ser Ala Ala Gly Ala Ser Leu

245 250 255

Leu Pro Ala Gly Leu Ala Thr Ala Thr Leu Ala Thr Ala Val Thr Gly

260 265 270

Ala Pro Gly Ala Ala Gly Pro Gly Gly Thr Gly Gly Ala Pro Gly Ala

275 280 285

Gly Gly Leu Ile Ala Gly Gly Thr Ala Thr Leu His Thr Pro Gly Ile

290 295 300

Ala Gly Pro Ala Pro Ser Ala Ser Ala Pro Pro Gly Met Ser Ala Ile

305 310 315 320

Gly Met Gly Val Thr Pro Ser Gly Thr Thr Leu Thr Thr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Leu Leu Ala Ala Leu Ala Pro Ala Pro Leu Ala Gly Val Ile Leu

340 345 350

Leu Ala Leu His Ile Ala Ala Thr Leu Thr Pro Pro Pro Thr Gly Pro

355 360 365

Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Thr Gly Ala Leu Pro Gly

370 375 380

Ala Gly Leu Leu Gly Gly Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Ala Leu

385 390 395 400

Ala Ala Pro Ser Leu Gly Leu Gly Gly Ser Met Ser Ser Ala Ala Ser

405 410 415

Thr Gly Ala

<210> 3

<211> 227

<212> PRT

<213> S蛋白(S protein)

<400> 3

Ala Val Gly Pro Thr Gly Ser Ile Val Ala Pro Pro Ala Ile Thr Ala

1 5 10 15

Leu Cys Pro Pro Gly Gly Val Pro Ala Ala Thr Ala Pro Ala Ser Val

20 25 30

Thr Ala Thr Ala Ala Leu Ala Ile Ser Ala Cys Val Ala Ala Thr Ser

35 40 45

Val Leu Thr Ala Ser Ala Ser Pro Ser Thr Pro Leu Cys Thr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Leu Leu Ala Ala Leu Cys Pro Thr Ala Val Thr Ala Ala

65 70 75 80

Ser Pro Val Ile Ala Gly Ala Gly Val Ala Gly Ile Ala Pro Gly Gly

85 90 95

Thr Gly Leu Ile Ala Ala Thr Ala Thr Leu Leu Pro Ala Ala Pro Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Thr Ala Ser Ala Ala Leu Ala Ser Leu Val Gly

115 120 125

Gly Ala Thr Ala Thr Leu Thr Ala Leu Pro Ala Leu Ser Ala Leu Leu

130 135 140

Pro Pro Gly Ala Ala Ile Ser Thr Gly Ile Thr Gly Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Ala Gly Val Gly Gly Pro Ala Cys Thr Pro Pro Leu Gly Ser

165 170 175

Thr Gly Pro Gly Pro Thr Ala Gly Val Gly Thr Gly Pro Thr Ala Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Pro Gly Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Leu Leu Ser Thr Ala Leu Val Leu Ala Leu Cys Val Ala Pro Ala

210 215 220

Pro Ala Gly

225

<210> 4

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtgttcagc cgaccgaaag cattgttcgt tttccgaata tcaccaatct gtgtccgttt 60

ggcgaagttt ttaatgcaac ccgttttgca agcgtttatg cctggaatcg taaacgtatt 120

agcaattgcg ttgccgatta tagcgttctg tataatagcg caagcttcag cacctttaaa 180

tgctatggtg ttagcccgac caaactgaat gatctgtgtt ttaccaatgt gtatgccgat 240

agctttgtga ttcgtggtga tgaagttcgt cagattgcac cgggtcagac cggtaaaatt 300

gcagattata actataaact gccggatgat tttacgggtt gtgttattgc atggaatagc 360

aataacctgg atagcaaagt tggtggcaac tataactatc tgtatcgcct gtttcgtaag 420

agcaatctga aaccgtttga acgtgatatt agcaccgaaa tttatcaggc aggtagcacc 480

ccgtgcaatg gtgttgaagg ttttaattgt tattttccgc tgcagagcta tggttttcag 540

cctaccaatg gtgtgggtta tcagccgtat cgtgttgttg ttctgtcatt tgaactgctg 600

catgcaccgg caaccgtttg tggtccgaaa aaaagtacca atctggtgaa aaacaagtgc 660

gtgaacttta actttaatgg ttga 684

Claims

1.一种磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂，其特征在于，其包括由加样垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素检测膜及吸水垫依次搭接并贴在底衬卡构成的免疫层析试纸和磁性纳米颗粒捕获试剂，其中，所述硝酸纤维素检测膜上包被有兔抗N蛋白多克隆抗体的质控线和新冠肺炎病毒N蛋白的检测线，所述磁性纳米颗粒捕获试剂为新冠肺炎病毒N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米磁颗粒。

2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述新冠肺炎病毒N蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述新冠肺炎病毒N蛋白的表达采用如SEQID NO.1所示基因序列进行。

4.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述加样垫为含鼠抗人红细胞抗体的处理液进行浸泡处理后的玻璃纤维膜。

5.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述玻璃纤维垫为经含有重量百分比为0.1％的Tris碱、1％的BSA和5％的蔗糖溶液浸泡过的玻璃纤维膜。

6.一种磁性纳米颗粒免疫层析快速检测新冠肺炎病毒抗体的试剂的制备方法，其特征在于，所述其包括如下步骤：

S1、将四氧化三铁磁性纳米磁颗粒羧基化后，加入新冠肺炎病毒N蛋白进行标记，获得新冠肺炎病毒N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米磁颗粒捕获试剂；

S2、将玻璃纤维膜经重悬液浸泡后，干燥获得玻璃纤维垫；

S3、硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线，质控线上包被有兔抗N蛋白多克隆抗体，检测线上包被有新冠肺炎病毒N蛋白，获得硝酸纤维素检测膜；

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述四氧化三铁磁性纳米磁颗粒的粒径大小为15nm，羧基化采用质量分数25％的戊二醛溶液进行；

所述新冠肺炎病毒N蛋白标记的浓度为2mg/mL，标记时反应时间为3h，磁吸附后弃去溶液，再加入0.5％BSA溶液，摇晃30分钟，进行封闭；磁吸附后弃去溶液，加入含0.01％吐温-20浓度为0.01mol/L的PBS，洗涤；在加入重悬液，获得N蛋白标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒捕获试剂溶液，其中，重悬液中含有重量百分比为0.1％的Tris碱、1％的BSA和5％的蔗糖。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述新冠肺炎病毒N蛋白的获得采用基因序列如SEQ ID NO.1进行表达制备。

9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述重悬液为含有重量百分比为0.1％的Tris碱、1％的BSA和5％的蔗糖溶液。

10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述兔抗N蛋白多克隆抗体的包被浓度为1.2mg/mL和新冠肺炎病毒N蛋白的包被浓度为2mg/mL。