CN112684168A - 一种SARS-CoV-2病毒的N抗原检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，具体涉及一种SARS‑CoV‑2病毒的N抗原检测试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包括包被SARS‑CoV‑2病毒的N抗体的反应板、样品稀释液、酶标记物、显色底物液、洗涤液、阴性对照和SARS‑CoV‑2病毒N抗原阳性对照。本发明的试剂盒兼具窗口期短、灵敏度高、特异性好、取样简便、操作简单、结果容易判定等优势。适用于早期诊断，且诊断迅速、准确、对设备和人员要求低，能够批量快速处理大量样本，可以实现自动化处理。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，具体涉及一种SARS-CoV-2病毒的N抗原检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2，2019-nCOV)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)。该疾病主要通过飞沫传播，该病毒症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。具有传染性高、传播快、症状重、死亡率高、无特效药物、无疫苗预防等特点。
新型冠状病毒基因组依次编码刺突蛋白(Spike protein，简称S蛋白)、包膜蛋白(Envelope protein，简称E蛋白)、膜蛋白(Membrane protein，简称M蛋白)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，称N蛋白)。N蛋白是SARS-CoV-2的重要结构蛋白，是一种核衣壳碱性磷酸化蛋白，在病毒的包装、复制和蛋白质翻译等过程中起关键作用。
目前新冠病毒检测方法主要有：核酸检测和抗体检测。核酸检测能够早期检测到咽拭子中的病毒抗原序列，是目前检测新冠病毒的金标准；但缺点也比较明显，取样困难、医护人员高度暴露容易感染、取样不准确容易漏检、假阳性率高、检测耗时较长；需要配备较复杂的仪器、操作人员需要进行培训，导致检测成本高、操作复杂，且样品处理量有限。抗体检测操作简单方便、快速、对设备和人员要求低，适用于大量疑似病例和无症状感染者检测，最快15分钟内出结果，但是由于平台所限，其灵敏度相对较低，变异大，检测窗口期较长，不能满足对发热早期患者筛查的需要。
目前广泛采用的是核酸检测为主，抗体检测为辅的方式。核酸和抗体检测各有侧重，不能相互替代，多种检测方法联合应用，互为补充，发挥各自优势，可有效缩短检测窗口期，提高阳性检出率，为各种可能的风险人群提供双重保障。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种兼具窗口期短、诊断迅速、灵敏度高、特异性好、重复性好、取样简便、操作简单、结果容易判定等优势的试剂盒及其制备方法。
本发明的目的在于提供一种SARS-CoV-2病毒的N抗原检测试剂盒及其制备方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明所采取的技术方案为：
本试剂盒采用双抗体夹心法原理检测人血清、血浆、咽喉部分泌物中的SARS-CoV-2病毒的核衣壳蛋白抗原(以下简称“N蛋白抗原”)。预先采用SARS-CoV-2病毒的N蛋白抗体包被固相载体，加入样本后，若样本中含有SARS-CoV-2N蛋白抗原，则与固相载体结合，再与加入示踪物标记的SARS-CoV-2N蛋白抗体结合，形成固相抗体-抗原-示踪物标记抗体的夹心复合物，温育后洗涤除去未结合的样本和示踪物，加入配套底物，读数，根据临界值判断样本中是否含有SARS-CoV-2(2019-nCOV)N蛋白抗原。
根据本发明的试剂盒包括包被有SARS-CoV-2病毒的N抗体的反应板、样品稀释液、酶标记物、显色底物液、洗涤液、阴性对照和SARS-CoV-2病毒N抗原阳性对照以及其它辅助试剂。
根据本发明的试剂盒，其中，所述反应板为透明聚苯乙烯微孔板或白色不透光聚苯乙烯微孔板、黑色不透光聚苯乙烯微孔板。更优选为，透明聚苯乙烯微孔板或白色不透光聚苯乙烯微孔板。
根据本发明的试剂盒，其中，所述酶标记物为为碱性磷酸酶、吖啶酯或辣根过氧化物酶标记物。更优选为辣根过氧化物酶标记物。
根据本发明的制备SARS-CoV-2病毒的N抗原检测的试剂盒的方法包括以下步骤：
制备高亲和力N抗体；
反应板包被以及封闭，在包被缓冲液中投入SARS-CoV-2病毒的N抗体，进行包被，清洗后封闭液进行封闭；
配制样品稀释液：
(1)将0.5％Tween20加入含有0.5％BSA的0.02M PBS中，并且搅拌均匀，
(2)向溶液中加入0.2％表面活性剂3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐CHAPS搅拌均匀，
(3)向溶液中加入0.1％的Proclin300搅拌均匀，
(4)定容分装，2-8℃保存备用；
以酶标记SARS-CoV-2病毒的N抗体；
显色底物液配制；
使用方法：使用前将A液与B液按1：1比例混合后使用，现用现配；
校准品配制；
分装校准品、酶标记的SARS-CoV-2病毒的N抗体、样品稀释液、显色底物液；
组装产品。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
1、本试剂盒采用双抗体夹心法，检测SARS-CoV-2N抗原，在检测位点的设计上，选用N抗体检测N抗原，而不是N抗原检测N抗体，这种设计显著提升特异性、灵敏度、准确性，缩短窗口期。
2、本发明采用双抗体夹心法，检测SARS-CoV-2病毒的N抗原。本发明在研究过程中发现，在检测位点的设计上，选用配对N抗体夹心法检测N抗原，这种设计显著提升检测的特异性、灵敏度、准确率。因为N蛋白作为冠状病毒结构蛋白中含量最丰富和保守的蛋白质，在感染早期病人血清中出现，诱导机体产生大量特异性IgG和IgM抗体，因此成为感染早期检测病毒抗体的首选抗原。新型冠状病毒的一个重要特点是其独特的转录策略，N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，N基因同时存在于全长基因组和其他亚基因组RNA，在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用。那么，在新冠病毒转录过程中，其N基因转录合成量更高，在感染早期机体就能产生N蛋白抗原，血液样本中的N抗原含量极低，但是含有高比例的残基，其中有80％的残基位置是保守的(在其N末端存在有一高度保守的基因序列FYYLGTGP)。本发明利用N蛋白这一特点建立快速检测SARS-CoV-2N抗原方法。
3、本发明的试剂盒有助于新型冠状病毒肺炎的早期筛查。本试剂盒可实现缩短窗口期、提高检出率的目的，且具有检测结果更加准确、诊断迅速、特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性优异、可测定线性范围宽、操作简单、结果容易判定等优点。对设备和人员要求低，能够批量快速处理大量样本。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的试剂盒及其制备方法进行详细和具体的介绍，以便更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1本发明试剂盒的制备
本实施例采用酶联免疫法检测，具体操作如下：
步骤1：制备高亲和力N抗体
获得高纯N抗原：
(1)克隆新型冠状病毒COVID-19NP蛋白基因序列，连入表达载体pET-30a，构建重组表达载体pET-30a-NP(N端带有6×His标签)，将重组表达质粒转化入BL21感受态细胞，挑取单菌落于3ml含氨苄西林钠的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，次日接种于250ml新鲜的LB液体培养基中，37℃、160r/min培养4h至对数生长期，加150μl 1M的IPTG诱导液，15℃诱导13h。
(2)4℃，6000r/min离心10min收集诱导后的菌体；用25mM Tris-HCl(PH8.5)重悬菌体，然后对菌体进行冰浴超声。
(3)冰浴超声后的菌体于4℃，12000r/min离心10min后收集上清，过滤得到备用样品。
(4)Ni柱纯化备用样品，平衡后，将处理好的样品缓慢上样，待吸光度值开始上升时，收集穿过液。再次平衡后，用含25mM咪唑、25mM Tris-HCl(25mM Tris-HCl中含250mM咪唑，溶液的pH为8.5)的溶液洗脱，分别收集蛋白峰，电泳分析纯化产物，验证纯化后的目的蛋白在250mM咪唑洗脱液中。获得高纯N抗原，根据所用骨髓瘤细胞选用小鼠作为免疫动物，共5次免疫，在最后一次加强免疫后第3天取出脾细胞。
饲养细胞。取6-10周龄的BALB/c小鼠，摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，消毒3min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。用吸管注入培养液，反复冲洗，吸出冲洗液。离心5min；用20％小牛血清的培养液混悬，调整细胞数为1*105/ml，加入96孔板，100ul/孔。放入37℃恒温培养箱培养。第二天观察无污染，可使用。
细胞融合：取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，并加入饲养细胞，形成杂交瘤细胞。
克隆化：在得到杂交瘤细胞以后，采用有限稀释法经3-4次亚克隆，直至单个细胞形成的克隆培养物上清液抗体阳性，测定上清效价，用间接ELISA法测定上清效价，获得稳定分泌抗体的单克隆细胞株。
动物体内生产单抗：成年BALB/c小鼠腹腔接种降植烷或液体石蜡，7-10天后腹腔接种用PBS稀释的杂交瘤细胞，间隔5天，每天观察小鼠腹水产生情况，适时采集腹水，将腹水离心(2000r/min 5分钟)，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装。
单克隆抗体的纯化：采用辛酸-硫酸铵沉淀法，用紫外可见分光光度计检测蛋白含量，SDS-PAGE检测抗体纯度。
单克隆抗体亲和力测定。制备得到的抗体亲和力较市面上常用的对照N抗体亲和力提高了5000倍以上，相对于未进行细胞因子递送的免疫小鼠制备得到的普通抗体亲和力有更加明显的提高。
表1本发明制备的抗体与普通抗体亲和力对比
| 检测方法 | 本发明试剂盒 | 北京某厂家 |
| ELISA检测 | 0.22pg | 1000pg |
步骤2：反应板包被以及封闭
在包被缓冲液中投入SARS-CoV-2病毒的N抗体，使其包被浓度分别在1μg/ml，包被缓冲液为0.05M pH 9.6的碳酸盐缓冲液。每孔100ul包被，包被温度为4℃，包被时间为24±2小时；用PBST洗板两次后，封闭液150ul/孔封闭，封闭温度为4℃，封闭时间为20±2小时，封闭完成后将板孔内的封闭液甩干后干燥间干燥24±2小时，置于铝箔袋中加入干燥剂密封4℃保存。
封闭液配方：0.02MPBS+1％BSA+0.2％酪蛋白钠盐，然后将所配封闭液加入上述洗涤后的微孔板内。
步骤3：配制样品稀释液
(1)将0.5％Tween20加入含有0.5％BSA的0.02M PBS中，并且搅拌均匀；
(2)向溶液中加入0.2％表面活性剂3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐CHAPS搅拌均匀；
(3)向溶液中加入0.1％的Proclin300搅拌均匀。
(4)定容分装，2-8℃保存备用。
步骤4：HRP标记SARS-CoV-2病毒的N抗体
采用高碘酸钠法，包括以下步骤：
(1)取4mg HRP溶于0.4ml蒸馏水；
(2)向溶液中加入高碘酸钠溶液0.4ml，2～8℃反应30分钟，溶液颜色由棕红变为绿色；
(3)向溶液中加入无水乙醇溶液0.4ml，室温(20℃)下轻微搅拌作用30分钟，溶液颜色由绿色变为棕红色；
(4)取出活化后的HRP溶液共1.2ml，向N抗体2mg中加入0.6ml活化后的HRP溶液；
(5)将上述两份标记物分别装入透析袋，置于pH9.6的碳酸盐缓冲液中，2～8℃反应12小时±2小时；
(6)向两个透析袋中分别加入4mg/ml硼氢化钠溶液80μl，置于2～8℃反应2小时；
(7)向每个透析袋中加入等体积的饱和硫酸铵溶液，置2～8℃静置30分钟，10000r/min离心30min，去上清；
(8)将沉淀物溶于0.02MoL/LpH7.4的PBS中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6-12h，换液3次；
(9)在结合物内加入一倍体积的甘油，即为酶标记物，测定工作效价后，小量分装，-20℃保存备用。
步骤5：TMB显色底物液配制
使用方法：使用前将A液与B液按1：1比例混合后使用，现用现配。
步骤6：校准品配制
校准品A(阴性校准品)配制：
将正常人血清用稀释液稀释后，加入防腐剂、色素，得阴性校准品。
校准品B(SARS-CoV-2N蛋白阳性校准品)配制：
将重组SARS-CoV-2N蛋白，用稀释液稀释后得SARS-CoV-2病毒的N抗原阳性校准品。
步骤7：分装校准品、HRP标记的SARS-CoV-2病毒的N抗体、样品稀释液、TMB显色底物液。
步骤8：组装产品。
实施例2本发明试剂盒的使用方法
步骤1：加样：取SARS-CoV-2病毒的N抗体微孔板，平衡至室温后，每次实验设阴性对照3孔，SARS-CoV-2N抗体阳性对照2孔，每孔分别加入50ul，样品孔中每孔加入样品50ul，再加入样品稀释液50ul，混匀，贴上封板膜，置37℃温育60分钟；
步骤2：洗板：甩去反应液，用稀释后的洗涤液洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干；
步骤3：加酶：除空白孔外，每孔加入含有辣根过氧化物酶标记的SARS-CoV-2N抗体，贴上封板膜，静置37℃30分钟
步骤4：方法同步骤2。
步骤5：使用前将TMB显色底物液A和B以1∶1混合，加入板孔中，置37℃反应15分钟。
步骤6：在酶标仪上测量各孔的OD值。
步骤7：根据待测样本的OD值与Cutoff值判断，若样本测≥Cutoff值，则为阳性反应，说明样本中含有N蛋白抗原；若OD值＜Cutoff值，则为阴性反应，说明样本中不含有N蛋白抗原。
综上所述，通过双抗体夹心法检测试剂，验证了建立的方法在实际应用中的效果，为进一步快速准确的检验新冠患者的感染风险提供新的检测方法。
实施例3本发明的试剂盒的临床实验比对
1、本发明试剂盒的临床实验比对，实验结果见下表：
表2本发明试剂盒检测血清样品与ELISA、胶体金测定结果比较
表3本发明试剂盒与ELISA、胶体金灵敏度及特异性评价
| 本试剂盒 | ELISA | 胶体金 | |
| 灵敏度 | 100％ | 80.0％ | 66.7％ |
| 特异性 | 100％ | 100％ | 98.3％ |
结果表明，本发明的试剂盒的灵敏度和特异性均高于ELISA总抗体和胶体金法测IgM和IgG抗体检测试剂。
2、不同试剂盒对不同病程样本的灵敏度评估
为了评估各检测试剂原料在新冠肺炎不同病程样本中的灵敏度，将样本按疾病进行分组：早期阶段为发病14天内12份样本；中晚期阶段为发病后≥15天12份样本。
本发明检测试剂盒14天内样本的灵敏度为100％(12/12)，在发病后≥15天样本的灵敏度为100％(12/12)；对比厂家选用ELISA测定总抗体的检测试剂，其早期样本的灵敏度为41.7％(5/12)，中晚期样本的灵敏度为100％(12/12)。由此可见，本发明的双抗体夹心法检测可以有效的检出窗口期的样本。
实施例4与本发明相反的检测位点试剂盒与本发明试剂盒检测血清样品测定结果比较
采用与本发明相反的检测位点，双抗原夹心法，即N抗原检测N抗体，制备方法、使用方法同本发明。对该实验进行灵敏度、特异性的检验。
表4与本发明相反的检测位点试剂盒与本发明试剂盒检测血清样品测定结果比较
表5与本发明相反的检测位点试剂盒与本发明试剂盒灵敏度及特异性评价
| 本试剂盒 | 与本发明相反的检测位点试剂盒 | |
| 灵敏度 | 100％ | 33％ |
| 特异性 | 100％ | 90％ |
本发明的试剂盒采用双抗体夹心法测N抗原，具有更高的灵敏度和特异性。兼具窗口期短、灵敏度高、特异性好、取样简便、操作简单、结果容易判定等优势。适用于早期诊断，且诊断迅速、准确、对设备和人员要求低，能够批量快速处理大量样本，可以实现自动化处理等优点。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种SARS-CoV-2病毒的N抗原检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被SARS-CoV-2病毒的N抗体的反应板、样品稀释液、酶标记物、发光底物液、洗涤液、阴性对照和SARS-CoV-2病毒的N抗原阳性对照。
2.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2病毒的N抗原检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液的配方为：0.5％BSA的PBS，0.5％Tween20，0.2％表面活性剂3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐CHAPS，0.1％Proclin300。
3.根据权利要求1所述的SARS-CoV-2病毒的N抗原检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记物为碱性磷酸酶、吖啶酯或辣根过氧化物酶标记物。
4.一种制备SARS-CoV-2病毒的N抗原检测的试剂盒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
制备高亲和力N抗体；
反应板包被以及封闭，在包被缓冲液中投入SARS-CoV-2病毒的N抗体，进行包被，清洗后，以封闭液封闭；
配制样品稀释液；
酶标记SARS-CoV-2病毒的N抗体；
配制显色底物液；
校准品配制；
分装校准品、酶标记的SARS-CoV-2病毒的N抗体，显色底物液；
组装产品。
5.根据权利要求4所述的制备SARS-CoV-2病毒的N抗原检测试剂盒的方法，其特征在于，通过以下步骤配制样品稀释液：
(1)将0.5％Tween20加入含有0.5％BSA的0.02M PBS中，并且搅拌均匀；
(2)向溶液中加入0.2％表面活性剂3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐CHAPS搅拌均匀；
(3)向溶液中加入0.1％的Proclin300搅拌均匀；
(4)定容分装。
6.根据权利要求4所述的制备SARS-CoV-2病毒的N抗原检测试剂盒的方法，其特征在于，以碱性磷酸酶、吖啶酯或辣根过氧化物酶标记SARS-CoV-2病毒的N抗体。
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