CN111398585A - 一种特异性检测基孔肯雅病毒nsp1抗原的免疫诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性检测基孔肯雅病毒NSP1抗原的免疫诊断试剂盒。该诊断试剂盒包括：包被单抗CHIKV‑M2的微孔反应板、样品处理液、结合有标记物的单抗CHIKV‑M10、阳性对照、阴性对照、浓缩洗液、显色液和终止液。该试剂盒能特异性检测基孔肯雅病毒抗原，与其他虫媒病毒抗原无交叉反应，检测基孔肯雅病毒培养上清敏感度同商品化荧光定量PCR检测试剂盒类似。

Description

一种特异性检测基孔肯雅病毒NSP1抗原的免疫诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种特异性检测基孔肯雅病毒NSP1抗原的免疫诊断试剂盒。

背景技术

基孔肯雅病毒(chikungnya virus，CHIKV)属披膜病毒科甲病毒属，是一种单股正链RNA虫媒病毒，主要传播媒介为伊蚊。可致基孔肯雅热，主要临床表现为突发高热，寒战，皮疹，关节剧烈疼痛等，部分患者转变为慢性感染，表现迁延不愈的多发性关节炎，致使感染人群丧失劳动力，从而导致严重的社会与经济损失。该病毒主要流行于非洲、南美洲、南亚和东南亚等地区，流行区域逐年增大。我国云南也是基孔肯雅病的自然疫源地，近年已发现多起输入性病例。当前我国人群普遍对CHIKV免疫力低下，而其与登革病毒(denguevirus，DV)具有相同的传播媒介伊蚊，因此，很容易发生输入性基孔肯雅病流行，在2010年我国广东省东莞和阳江报道输入性基孔肯雅热本地暴发疫情。

当前基肯雅病毒无批准的疫苗，也没有特异性的治疗性药物，虫媒控制是控制基孔肯雅病毒传播最有效的手段。同时在缺少疫苗的情况下，必须对传染病进行监测，以便早期发现早期隔离；为了达到此目的，我国已建立了积极的虫媒病毒监测计划，在虫媒传染病高发季节对发热的情况和传播虫媒进行监测，并对发热且怀疑被虫媒病毒感染的个体进行血清学和病毒学的筛选。基孔肯雅病毒所致疾病与登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒等所致的病毒性出血热症状相似，十分容易误诊。目前，存在数种诊断基孔肯雅病毒感染的检验方法。不过，为了获得可判断的结果，必须将数种方法结合起来。

病毒分离，通过敏感细胞分离或在乳鼠颅内接种或蚊虫接种等，具有如下缺点：对操作者和实验室条件要求高，依赖于早期取样及良好的保存条件；此外，耗时久，至少一周。RT/PCR检验法具有快速、敏感性和可靠性，是当前主要的诊断基孔肯雅病毒感染方法。但是同病毒分离方法类似，对操作者和实验室条件要求较高。

血清学抗体(IgM和IgG)检测也是实验室诊断CHIKV感染最常用的方法，发病3至6d后可检测到IgM，在发病3d后患者中IgM阳性率约为4％到20％，在发病1周后阳性率达到80％以上，持续存在1到3个月。而在发病6到7d后检测到IgG，通常在检测到IgM后1-2d后即可检测到IgG，IgG存在时间可达数年。单独检测急性期血清IgM和检测急性期和恢复期双份血清中IgG，比较前后IgG滴度升高4倍以上可以用于确诊CHIKV感染。对于慢性CHIKV感染患者，由于急性期病人未及时就诊，而病情持续数月后转为慢性感染，此时病毒RNA和IgM近似于消失，检测IgG或血清中和实验(neutralization test，NT)是其确诊的唯一方法。ELISA检测抗体的优点在于它成本低、易操作和对人员设备要求低，适用于初筛和基层医疗机构。其缺点是虫媒病毒间存在交叉表位，易与其他虫媒病毒发生交叉反应而产生假阳性结果。

抗原检测是CHIKV感染的另一种诊断方法。基孔肯雅病毒基因组长度约为11kb，编码5种结构蛋白(capsid，envelope protein 3，envelopeprotein 2，6K，envelope protein1；C，E3，E2，6K，E1)和4种非结构蛋白(nonstructural protein1-4，NSP1-4)。NSP1蛋白同病毒复制有关，在病毒感染细胞早期能够检测到该蛋白，同时本实验室在感染白纹伊蚊中也检测到该蛋白，提示该蛋白可作为诊断基孔肯雅病毒感染的抗原靶标。因此，本发明提供一种可靠、快速和低成本的基孔肯雅病毒感染的早期抗原检测方法，有效用于病毒感染早期诊断和虫媒监测。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种特异性检测基孔肯雅病毒NSP1抗原的免疫诊断试剂盒。

本发明所要解决的技术问题提供一种具有高灵敏度和特异性的基孔肯雅病毒NSP1抗原免疫诊断试剂盒，它可直接检测到血液或蚊虫标本中的CHIKV NSP1抗原，实现基孔肯雅病毒感染的早期诊断和虫媒监控。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

为了解决以上技术问题，本发明提供一种检测基孔肯雅病毒NSP1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒是基于双抗体夹心ELISA方法的检测试剂盒，由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、与标记物结合的检测抗体、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液组成，其特征在于所述的捕获抗体为单抗CHIKV-M2，由保藏号为CGMCC-19391的杂交瘤细胞株CHIKV-M2(命名为SP2/0杂交瘤细胞株)分泌得到；所述的检测抗体为单抗CHIKV-M10，由保藏号为CGMCC-19392的杂交瘤细胞株CHIKV-M10(命名为SP2/0杂交瘤细胞株)分泌得到。

本发明试剂盒中，所述的单抗CHIKV-M2是IgG1亚类的免疫球蛋白,CHIKV-M10是IgG2a亚类的免疫球蛋白，两种单抗均能特异性结合基孔肯雅病毒。所述的杂交瘤细胞株CHIKV-M2和单抗CHIKV-M10是用重组的CHIKV NSP1蛋白和天然的NSP1蛋白交叉免疫Balb/c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞和商品化的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，最后用HAT培养基筛选得到。

本发明试剂盒中，所述的标记物是指能标记在抗体的非活性部位且可定量分析的物质，例如辣根过氧化物酶、胶体金、碱性磷酸酶、生物素等；而相应的显色液则含有能与所述标记物反应并产生颜色变化的物质。这些都是本领域的常识，本领域技术人员可根据这些常识轻易地选定标记物与相应的显色液，如辣根过氧化物酶及其底物过氧化氢尿素和四甲基联苯胺(简称TMB)就是ELISA试验中常用的标记物及显色液组合，也同样适用于本发明。所述的样品处理液、浓缩洗液和终止液均是双抗体夹心ELISA方法中的常用试剂，所述的阳性对照物是指基孔肯雅病毒NSP1蛋白，所述的阴性对照物是不含基孔肯雅病毒NSP1蛋白的空白对照物。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明提供的试剂盒是一种基于双抗体夹心ELISA方法的检测试剂盒，其中所述捕获抗体CHIKV-M2和检测抗体CHIKV-M10是从一组抗基孔肯雅病毒NSP1蛋白的单克隆抗体中筛选出来的，仅能特异性结合基孔肯雅病毒，因此该试剂盒能够准确、快速地检测出基孔肯雅病毒，而同其它虫媒病毒如辛德毕斯病毒、登革病毒、西尼罗河病毒以及乙型脑炎病毒均无交叉反应，且对基孔肯雅病毒具有很高的敏感度，可检测病毒滴度低5×10⁴TCID50/ml，有利于基孔肯雅病毒的早期诊断和虫媒监控。

附图说明

图1为CHIKV-NSP1重组蛋白的诱导表达图；

图2为免疫荧光法检测代表性的CHIKV NSP1单抗CHIKV-M2与常见虫媒病毒感染细胞免疫反应结果图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

1、所述的单抗CHIKV-M2和CHIKV-M10的制备方法和鉴定结果：

(1)免疫抗原的制备

本发明用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组CHIKV NSP1蛋白和已灭活天然的病毒抗原。基因重组CHIKV NSP1蛋白是用一种携带CHIKV NSP1基因的工程菌株制备的，其制备按常规方法进行，经用镍-次氮基三醋酸金属亲和层析的方法进行纯化获得NSP1抗原。将NSP1蛋白纯化后，以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂定量(结果如图1所示)。已灭活天然的病毒抗原，是从CHIKV感染的病毒宿主细胞(C6/36，一种白蚊伊蚊细胞)获得。图1中的1为复性后CHIKV-NSP1重组蛋白；2为NI-NTA层析纯化后的CHIKV NSP1蛋白；3为诱导前菌液；4为IPTG诱导后菌液；5为NI-NTA层析纯化前的CHIKV NSP1蛋白。

(2)免疫小鼠

取4-6周龄雌性BALB/c小鼠，免疫原为原核表达的重组CHIKV NSP1蛋白和天然CHIKV NSP1蛋白。第一次采用弗氏完全佐剂与等体积CHIKV NSP1抗原混匀乳化，每只小鼠皮下多点注射50μg，以后每10天以弗氏不完全佐剂与天然的CHIKV NSP1或重组的CHIKVNSP1抗原交替免疫共4次后，于融合前3天每只小鼠腹腔注射CHIKV NSP1抗原100μg进行加强免疫。

(3)杂交瘤细胞的制备和鉴定

按1:10比例将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫小鼠脾脏细胞均匀混合后加入融合槽中，利用电融合仪器(日本NEPA GENE)按照操作说明进行融合。融合产物加入10ml含15wt％胎牛血清的RPMI-1640培养基，室温800rpm离心5min，弃上清，用60ml含15％胎牛血清的RPMI-1640培养基悬起细胞。将此细胞悬液加入10块96孔培养板上，在37℃、5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养。次日于融合细胞中加入120μl 2×HAT培养基。以后每3天用1×HAT培养基换液一次，当克隆长至占孔底面积的1/10时，取培养上清经间接ELISA法用NSP1蛋白和CHIKV病毒进行双筛选。阳性克隆转至24孔培养板中扩大培养，经ELISA和免疫荧光(CHIKV感染细胞抗原片)复测仍为强阳性的克隆用有限稀释法进行克隆化。克隆化2-3次至阳性率达100％，选择分泌抗体效价高的两个细胞株扩增培养后置液氮保存，记为杂交瘤细胞株CHIKV-M2和杂交瘤细胞株CHIKV-M10，并于于2020年3月16号在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏登记号分别为CGMCC-19391和CGMCC-19392。

(4)抗CHIKV NSP1蛋白单克隆抗体亚类检测

分别利用1μg/mL的IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体(Sigma，美国)包被的酶标板对CHIKV NSP1单克隆抗体的亚型进行鉴定，详细操作如下：包被的微孔板中加入本发明发明的杂交瘤细胞培养上清液，37℃孵育1h，加入1∶1000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG(Sigma，Inc)，100μl/孔37℃孵育30min，加TMB显色液室温避光显色10min，加1M H₂SO₄终止反应，测450nm吸光值(A450)，OD值最高的酶标板类型即为该单克隆抗体的亚型。检测结果显示，上述杂交瘤细胞CHIKV-M2的培养上清为IgG1阳性，杂交瘤细胞CHIKV-M10的培养上清为IgG2a阳性。即说明杂交瘤细胞CHIKV-M2分泌的单克隆抗体为IgG1阳性，杂交瘤细胞CHIKV-M10分泌的单克隆抗体为IgG2a阳性。

(5)单克隆抗体腹水制备和纯化

腹水制备：采用体内诱生法制备本发明中单克隆抗体，即在小鼠体内接种杂交瘤细胞制备腹水。具体方法如下：每只小鼠腹腔内注射0.5ml弗氏不完全佐剂(Sigma公司)，使瘤细胞能以腹水瘤形式在腹腔内生长。小鼠腹腔注射佐剂大约1-2周后，将约1×106个对数生长期的杂交瘤细胞悬浮于无血清RPMI 1640培养基中，注入小鼠腹腔。约1-2周后，用7号针头放腹水，离心后收集腹水上清，立即加入叠氮钠至终浓度为0.1wt％，存放于4℃备用。

单抗纯化：采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水中的抗体，操作方法如下：腹水用60mM、pH5.0醋酸缓冲液稀释2倍，室温下于30分钟内边搅拌边逐滴缓慢加入辛酸，为每毫升稀释前腹水加33μl辛酸，出现大量沉淀，4℃静置2小时，10000g，4℃离心30分钟，取上清，加入1/10体积的pH7.4100mM磷酸盐缓冲液，并用1N氢氧化钠调pH值至7.4，冰浴搅拌下加入硫酸铵，为每毫升液体加入0.277硫酸铵即为45％饱和度，4℃静置过夜(14小时)，10000g、4℃离心30分钟，弃上清，沉淀溶于适量10mM磷酸盐缓冲液，用同样的液体，4℃透析过夜(14小时)，换液三次。以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERCE)定量。测定浓度后的抗体加入终浓度50％的甘油于-80℃保存。

(6)间接免疫荧光鉴定单克隆抗体的特异性

分别用四个血清型DV、JEV、YFV-17D、WNV、SINV和CHIKV感染C6/36细胞，当有2/3细胞出现病变时，收集细胞，用预冷的1×PBS洗细胞二遍，然后将细胞滴于无菌干燥的玻片上，干燥后，制备成涂片，充分干燥，用冷丙酮固定10分钟后吹干，分别与阳性杂交瘤细胞培养上清和FITC标记的羊抗小鼠IgG孵育，并设立未感染病毒的C6/36细胞抗原片作为阴性对照，最后用0.25％的伊文氏蓝染色后，荧光显微镜下观察荧光图像，以荧光的强度和染色形态进行结果判定，检测抗体强度以(+～++++)计为阳性，抗体强度(±)和(-)计为阴性。利用常规方法制备DV 1-4、WNV、JEV、YFV-17D和CHIKV病毒感染C6/36细胞涂片，细胞涂片经丙酮固定风干后，每孔加入相应阳性克隆培养上清，37℃孵育1h；0.1％的PBS-T洗涤5min×3次，加入工作浓度的FITC-羊抗小鼠IgG(博士德，中国)20μl/孔，37℃孵育30min，避光洗涤5min×6次；用0.25％伊文氏蓝37℃复染10min，30％甘油封片，荧光显微镜观察结果并拍照保存，并以未感染的C6/36细胞抗原片为阴性对照。结果显示，本发明的单克隆抗体与CHIKV抗原特异性结合，而与其它虫媒病毒均无交叉反应(结果如图2所示)。图2中的A表示CHIKV；B表示DV1；C表示DV2；D表示DV3；E表示DV4；F表示JEV；G表示WNV；H表示YFV；I表示SIND；J表示C6/36。

2、本发明实施例试剂盒的组成和制备

(1)所用试剂的配制

a.浓缩洗液：含有2％Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH₂PO₄，58.02gNa₂HPO₄·12H₂O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌后，加入20ml Tween-20搅匀，使用时20倍稀释；

b.阳性对照：CHIKV天然NSP1抗原1∶1000稀释液；

c.阴性对照：含0.1wt％Tween-20的10mM PH7.4 PBS，制备方法如下：将4.56gNaH₂PO₄、58.02g Na₂HPO₄·1 2H₂O和175.3g NaCl用水溶解并定量至1升，15磅20min高压灭菌，稀释20倍后加入0.1％Tween-20；

d.显色液：由显色液A和B组成，使用时取二者等量混匀使用。其中显色液A、B的制备方法如下：

将0.89g柠檬酸和0.16g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃高压30min，降至90℃后加TMB 0.25g，摇匀后得显示液A，于4℃闭光保存；

将9.33g柠檬酸和14.6g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃高压30min后，降至90℃后加0.75％过氧化氢尿素12.8ml，摇匀后得显示液B，于4℃闭光保存；

f.终止液：1M H₂SO₄。

(2)所述包被单抗CHIKV M2的微孔反应板的制备方法如下：将本发明单抗CHIKVM2用10mMpH7.6的磷酸盐缓冲液稀释至10μg/ml，用150μl/孔包被聚苯乙烯96孔微孔板，于4℃过夜(14小时)。拍干后，每孔加入200μl/孔的0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液，于4℃过夜(14小时)以封闭非特异性结合位点。甩干板条，真空干燥12-24h，用铝膜袋真空包装4℃保存备用。

(3)所述辣根过氧化物酶标记的单抗CHIKV M10的制备方法如下：

采用改良过碘酸钠法，操作方法如下：将5mg HRP搅拌溶解于1mL双蒸水中，加入0.2mL新配0.1M过碘酸钠避光室温搅拌30min，置1mM pH4.4醋酸钠缓冲液中，4℃透析过夜(14小时)；次日加入0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液使PH值达9.0-9.5后，与预先调节pH至9.5的抗体10mg混合，在室温避光轻轻搅拌2-3小时，然后加入100μl新配4mg/mL硼氢化钠，4℃避光轻搅过夜；次日将过夜的抗体溶液用1×PBS稀释5-10倍，冰浴搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵(硫酸铵用前先用氨水调pH至7.4)，置4℃避光过夜(14小时)；12000rpm 4℃离心30min，弃上清，沉淀溶于适量1×PBS缓冲液，并置1×PBS中4℃透析过夜(14小时)，换液三次。收集结合物加入终浓度50％的2％BSA甘油-PBS保护剂，最后用磷酸盐缓冲液稀释1000倍，即为工作液。

3、应用本发明试剂盒检测样品中NSP1抗原

(1)检测方法

取待测的样品100μl加入CHIKV M2包被的聚苯乙烯96孔微量测试板中，同时设阴性对照和阳性对照，37℃温育1h，浓缩洗涤液20倍稀释后洗涤板条，洗板6次后，加入1：1000稀释的HRP标记的单抗CHIKV M10，100μl/孔，37℃温育30min，同上洗板8次后，加显色液(显色液A和B等量混合，现用现配)，100μl/孔，室温避光显色10min后，加入终止液，100μl/孔，终止反应。

(2)结果判定：以空白孔调零，于450nm波长测定吸光度(A值)。阳性对照平均值≥0.50，阴性对照平均值≤0.15，实验成立。样品A值≥阴性对照A值平均值×2.1，则判为阳性，反之为阴性。

(3)样品选取及制备：

CHIKV、四个血清型DV、SINV、YFV17D病毒液、JEV病毒液采用微孔滴定法(Li J,HuDM,Ding XX,Chen Y,Pan YX,et al.(2011)Enzyme-linked immunosorbent assay-formattissue culture infectious dose-50 test for titrating dengue virus.PLoS One 6:e22553.)实验确定病毒感染性滴度为4.72×109TCID₅₀/mL、3.16×109TCID₅₀/mL、3.16×109TCID₅₀/mL、1.58×109TCID₅₀/mL、1.58×109TCID₅₀/mL、2.16×109TCID₅₀/mL和4.78×109TCID₅₀/mL。上述病毒液灭活后从1×109TCID₅₀/mL开始十倍稀释多个梯度进行检测，同时上述稀释样品取200μl利用RNAiso Plus(TaKaRa,中国)，提取RNA。

白纹伊蚊(广州株)，在温度(26±0.5)℃、相对湿度(75±5)％、光照时间L:D＝14:10条件下，饲养至羽化，待羽化后5-7天，蚊群出现交尾现象后禁食和水17小时，喂食由昆明小鼠全血、10％葡萄糖溶液、CHIKV病毒液1：1：1组成的人工感染性血液(用高压灭菌棉球浸透，置于平皿中放入蚊笼，病毒滴度为4.72×109TCID₅₀/mL)，蚊虫吸食人工感染性血液2小时，-20℃冻麻后挑取饱血蚊虫饲养，约500只。感染14天随机吸取蚊虫约50只，-80℃冷冻待检。单只蚊虫采用500μlPBS溶液研磨，取上清待用。其中200μl利用RNAiso Plus(TaKaRa,中国)，提取蚊虫RNA。同时取未吸食感染性血液的白纹伊蚊100只采用500μl PBS溶液研磨后取上清待用。

(4)本发明试剂盒检测相关病毒的特异性和灵敏度分析

采用上述建立的方法检测上述样品。同时上述样品提取RNA，以检测CHIKV的商品化基孔肯雅病毒核酸检测试剂盒(上海之江，荧光PCR法)进行同步检测比较，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

采用本发明试剂盒检测系列稀释的灭活的CHIKV病毒液、四个血清型DV、WNV、JEV病毒液，本发明试剂盒的检测结果显示对CHIKV病毒液的检测灵敏度高达1000TCID50/ml，与其余6种黄病毒属病毒病毒培养液无交叉反应。如表1，表2所示。

表1本发明试剂盒检测倍比稀释CHIKV病毒培养液敏感性

表注^a：本发明试剂盒的结果判定如下：样品检测值≥阴性对照平均值的2.1倍(计算为0.014×2.1＝0.3)为阳性，反之为阴性。基孔肯雅病毒核酸检测试剂盒(上海之江，荧光PCR法)结果判定如下：样品检测值≦36为阳性

表2本发明试剂盒检测常见虫媒病毒的特异性

表注^a：本发明试剂盒的结果判定如下：样品检测值≥阴性对照平均值的2.1倍(计算为0.014×2.1＝0.3)为阳性，反之为阴性。

商品化的基孔肯雅病毒核酸检测试剂盒(上海之江，荧光PCR法)检测梯度对比稀释的灭活CHIKV病毒液Ct值详见表1结果。商品化基孔肯雅核酸试剂盒(荧光PCR法)对CHIKV培养上清的检测灵敏度为1000TCID50/ml，同本发明的试剂盒检测类似CHIKV培养上清的灵敏度。本发明实施例提供的试剂盒按上述判读方式检测都没有出现假阳性，说明本发明试剂盒的阳性标准是可靠的，同时也进一步证明本发明试剂盒具有比现有技术更好的灵敏度和特异性。

(5)本发明试剂盒虫媒样品检测实验

50例CHIKV感染性血餐后白纹伊蚊中采用商品化基孔肯雅病毒核酸检测试剂盒(上海之江，荧光PCR法)检测阳性蚊虫43只(Ct值<36)，阴性7只(表3)。采用本发明试剂盒检测阳性蚊虫43例(平均值和标准差为1.12±0.95)，阴性蚊虫7例(平均值和标准差为0.14±0.068)，同商品化核酸检测试剂盒一致。检测未吸食感染性血液蚊虫100只，均为阴性(平均值和标准差为0.11±0.07)。

表3本发明试剂盒检测50只吸食含CHIKV感染性血餐蚊虫同核酸检测试剂盒结果比较

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种特异性检测基孔肯雅病毒 NSP1 抗原的免疫诊断试剂盒，包括：用于包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、与标记物结合的检测抗体、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液；其特征在于，所述捕获抗体为CHIKV-M2，由保藏号为 CGMCC NO ：19391 的杂交瘤细胞株CHIKV-M2分泌得到；所述的检测抗体为CHIKV-M10，由保藏号为CGMCC NO ：19392 的杂交瘤细胞株CHIKV-M10分泌得到。

2.根据权利要求1所述的特异性检测基孔肯雅病毒 NSP1 抗原的免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶。

3.根据权利要求1所述的特异性检测基孔肯雅病毒 NSP1 抗原的免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述阳性对照物为基孔肯雅病毒 NSP1蛋白。

4.根据权利要求1所述的特异性检测基孔肯雅病毒 NSP1 抗原的免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述阴性对照物为不含基孔肯雅病毒 NS1 蛋白的空白对照物。

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