CN104407131A

CN104407131A - 一种免疫磁珠底物显色试纸及其制备方法

Info

Publication number: CN104407131A
Application number: CN201410568248.8A
Authority: CN
Inventors: 杨宇; 王静; 赵婷婷; 徐宝梁
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2014-10-22
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2034-10-22
Also published as: CN104407131B

Abstract

本发明公开了一种免疫磁珠底物显色试纸及其制备方法，属于生物检测试剂领域，该试纸包括依次搭接的样品垫、Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，并贴在底衬卡上；Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫为固定有SPA标记磁性纳米颗粒载体的玻璃纤维膜；硝酸纤维素膜设有包被有待检项目抗原的检测带和包被能与SPA的特异性抗体结合的抗体IgG的质控带，本发明还公开了这种试纸条的制备方法；采用本发明的试纸条进行待检项目抗体检测操作简单，不需要特殊仪器及技术人员专业培训即可进行样品的检测，反应迅速，最快在10min内即可完成结果的检测，检测结果目测即可判断，且检测灵敏度高，比常规胶体金方法检测灵敏度提高100倍以上。

Description

一种免疫磁珠底物显色试纸及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物检测试剂领域，特别涉及一种免疫磁珠底物显色试纸及其制备方法。

背景技术

目前，一些免疫学的检测方法，如针对一些病毒性病原体抗体的检测，主要是ELISA检测方法、化学发光等方法，ELISA检测方法需要洗涤、拍板，操作繁琐，并需要有检测仪器来测吸光度值判断检测结果；化学发光法，所用的试剂昂贵，结果判断也需要的昂贵的仪器来检测荧光值，并需要检测人员具有一定的专业素质。

现有快速检测方法，操作简单，如胶体金检测方法虽然不需要特殊设备和试剂、结果判断直观从而对检测人员的技术水平要求不高、而且适合现场检测等优点，但是胶体金结合抗原或抗体后，很不稳定，很容易因电荷的变化使得抗体或标记的蛋白脱离，造成每个胶体金的标记抗体量大大减少，从而造成灵敏度的降低。

发明内容

本发明针对上述存在的问题，提供一种检测灵敏度高的免疫磁珠底物显色试纸。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种免疫磁珠底物显色试纸，该试纸包括样品垫、Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底衬卡，所述样品垫、Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接并贴在底衬卡上；所述Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫为固定有SPA标记磁性纳米颗粒载体的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜设有检测带和质控带，所述检测带包被有与待检项目结合的抗原；所述质控带包被能与SPA结合的抗体IgG。

该试纸在加入样品后，再加入过氧化物酶底物进行显色反应。

如上所述的免疫磁珠底物显色试纸，优选地，所述Fe₃O₄磁性纳米颗粒的粒径为5nm～500nm。

如上所述的免疫磁珠底物显色试纸，优选地，所述样品垫为玻璃纤维素膜，所述吸水垫为吸水纸或纯棉绒浆滤纸。

利用如上所述的免疫磁珠底物显色试纸的进行检测，优选地，待检样品加入样品垫后，再加入过氧化物酶底物进行显色后判断检测结果。

本发明主要是利用制备免疫磁珠的四氧化三铁材料具有过氧化物酶活性的特点，可使含有过氧化氢和邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)和2.2'-边氮基-双3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸(ABTS)等过氧化物酶底物显色，样品中待检项目的抗体结合SPA免疫磁珠复合物后，再与检测线上的特异性抗原结合，然后经底物显色加强信号，可比普通胶体金方法灵敏度提高更多。

本发明的另一个目的，在于提供一种免疫磁珠底物显色试纸的制备方法，采用的技术方案为，包括以下步骤：

A.SPA标记Fe₃O₄磁性纳米颗粒，将该标记好的磁性纳米颗粒喷涂于玻璃纤维膜上，制备成磁性纳米颗粒载体垫；

B.包被硝酸纤维素膜：将待检项目的抗原和抗体分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带；

C.样品垫处理；

D.组装试纸条。

如上所述的制备方法，其特征在于，所述Fe₃O₄磁性纳米颗粒在标记前，进行氨基化或羧基化处理。

如上所述的制备方法，其特征在于，所述样品垫处理步骤为：将含有体积比0.5％～2％的吐温20、pH＝7.2～7.6的PBS，喷涂于样品垫上，烘干或自然干燥后待用。

作为优选的技术方案，组装试纸条后，还包括试纸条的验证步骤，验证方法为：

将阴性血清滴加在样片垫上，质控带显色，取TMB应用液液滴加在样品垫上，质控带的颜色加深，质控带显色，检测带未显色；将待检项目的阳性血清滴加在另一试纸的样片垫上，应仅质控带和检测条均显色，并取TMB应用液滴加在样品垫上，质控带和阳性检测条带颜色均加深，质控带和检测带均显现颜色的条带，试纸条合格，可进行待检项目抗体的检测。

如上所述的TMB应用液包括TMB和过去氧化氢，其中TMB含量在0.01mg/ml～10mg/ml，过氧化氢的摩尔浓度为0.25m mol/L～1.2m mol/L。

优选地，配制TMB应用液的方法如下：

1.底物液A：TMB200mg，溶于二甲基亚砜100ml，加蒸馏水水至1000ml。

2.底物B：先配制浓度为1％过氧化氢尿素待用，称取Na2HPO414.21g，柠檬酸9.607g，加入1％过氧化氢尿素2.4ml，加蒸馏水水至500ml；

3.将底物液A和底物B按1：1混合即成TMB应用液。

本发明还提供一种检测森林脑炎抗体的免疫磁珠底物显色试纸，作为优选方案，如上所述的显色试纸，其检测带包被有森林脑炎重组抗原，所述森林脑炎重组抗原的核苷酸序列如下所示：GGTTTGACCTACACCATGTGCGACAAAACCAAGTTCACCTGGAAGCGTATCCCTACCGACTCTGGTCACGACACCGTTGTTATGGAAGTTGCTTTCTCTGGTACCAAGCCATGTCGTATCCCTGTTCGTGCTGTTGCTCACGGTTCTCCTGACGTTAACGTTGCTATGCTGATGACCCCAAACCCAACCATCGAAAACAACGGTGGTGGTTTCATCGAAATGCAACTGCCACCAGGTGACAACATCATCTACGTTGGTGAATTGTCTCACCAGTGGTTCCAGAAGGGTTCTTCTATCGGT。

本发明的原理为：用SPA(金黄色葡萄球菌A蛋白)标记Fe₃O₄制备的磁性纳米颗粒，固定于玻璃纤维膜，作为捕获抗体的载体；再将待检项目的抗原蛋白和能与SPA结合的抗体IgG分别固定于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带；待检样品血清中如果有待检项目的抗体存在，将与SPA标记的磁性纳米颗粒结合形成结合物，检测溶液携带结合物渗透到检测带时与检测带待检项目的抗原蛋白特异性结合，检测带显示颜色，说明待检样品中存在有待检项目的抗体，检测溶液中未被结合的SPA标记的磁性纳米颗粒等溶液，将继续向吸水垫方向渗透，当到达质控带时，未结合的SPA标记的磁性纳米颗粒与质控带的抗体IgG结合，在质控带显示磁性纳米颗粒的颜色。然后加入显色底物，利用磁性纳米颗粒的Fe₃O₄过氧化物酶活性使底物显色，增强检测效果。无论检测样品中是否存在待检测的抗体，质控带均应显色，当在检测样品时，质控带未显色，说明试纸条失效，检测结果不可信，应重新取试纸条进行检测，或重新制备试纸条进行检测。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明制备的免疫磁珠底物显色试纸，成本低廉，肉眼可以直接观察检测结果，不需要仪器即可判断检测结果，加入底物显色后，检测灵敏度可提高10-100倍，当然也可应用磁性探测仪器进行检测结果的判断，且可实现定量的检测；

(2)采用本发明制备的免疫磁珠底物显色试纸，Fe₃O₄磁性纳米颗粒包被有抗体后，结构稳定，检测结果可靠；

(3)采用本发明提供的免疫磁珠底物显色试纸进行多种抗体比如森林脑炎抗体检测，操作简单，不需要技术人员即可进行样品的检测，检测结果容易判断；

(4)本发明提供的免疫磁珠底物显色试纸，反应迅速，最快在10min内即可完成结果的检测，且检测特异性强，灵敏度高，比如对于森林脑炎抗体的检测，最低可检测到20pg/ml。

附图说明

图1是实施例1的重组质粒的PCR鉴定电泳结果图。

图2是实施例1的重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果图。

图3是实施例2制得的试纸条的结构图，图中：a为样品垫，b为磁性纳米颗粒载体垫，c为硝酸纤维素膜，c1为质控带，c2为检测带，d为吸水垫，e为底衬卡。

图4是实施例3中胶体金层析的检测结果图。

图5是实施例3中纳米磁性免疫层析试纸条的检测结果图。

图6是试纸特异性检测结果。

其中图4和图5中：C为质控带；T为检测带；条带1-6依次表示森林脑炎阳性血清稀释浓度为1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000；条带7为阴性对照。

具体实施方式

目前利用四氧化三铁纳米颗粒进行检测的应用，主要是利用其具有磁响应性的功能，对待检目的物进行富集分离的，可有效提高检测率。四氧化三铁纳米颗粒还具有辣根过氧化物酶催化底物变色的特性，但是利用这个特性进行ELISA检测鲜有报道，主要原因可能是一方面考虑到由于四氧化三铁纳米颗粒的量子化尺寸效应等，使它对某种波长的光吸收带有蓝移现象，并对各种波长光的吸收有宽化现象，认为对ELISA检测需要测量吸光度值不是很准确；另一方面，由于四氧化三铁本身具有的颜色，会对后续测定吸光度值有影响，所以认为利用四氧化三铁纳米颗粒具有辣根过氧化物酶的特性进行免疫学方法的检测，尤其是ELISA检测，结果不是很准确、可靠，有一定的技术偏见。

本发明采用磁性纳米颗粒包被SPA制备检测试纸时，对所用的磁性纳米颗粒粒径的选择做了研究，研究结果表明磁性纳米颗粒粒径优选在5nm～500nm范围内，粒径小于5nm，颗粒太小，抗原或抗体很难包被，粒径大于500nm时，磁性纳米颗粒容易聚集，导致沉淀从而不适宜用于制备检测试纸。

本发明制备检测试纸时，对四氧化三铁颗粒进行了羧基化处理，有利于包被，且与包被物形成稳定的结构，并且包被后不会影响包被物的免疫学特性；另外，通过研究对样品垫进行了处理方式，本发明利用的处理方法，有效地避免非特异性反应，降低假阳性的检出率。

本发明还对辣根过氧化物酶显色的底物做了进一步的研究，研究表明，含有过氧化氢的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、3.3－二氨基联苯胺(DAB)或2.2'-边氮基-双3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸(ABTS)等溶液均可使四氧化三铁纳米颗粒制备的检测试纸显色加强。

常规ELISA采用的底物为TMB显色液，反应时，首先需要加入含有TMB的A液，再加入含有H₂O₂的B液，进行反应，一般A液与B液是分开存放或是现用现配，因TMB溶液与单独的H₂O₂溶液混合一起后，存放一段时间容易产生浑浊或沉淀，长期存放会影响检测结果，一般采用H₂O₂溶液时最好现配现用。

本发明还对TMB应用液中TMB的含量和H₂O₂的含量，进行了进一步的研究，研究表明TMB含量在0.01mg/ml～10mg/ml，过氧化氢的摩尔浓度为0.25mmol/L～1.2m mol/L，四氧化三铁纳米颗粒制备的检测试纸显色效果较佳。

本发明的发明人对TMB应用液的配制方法进一步进行改进，研究发现采用过氧化氢尿素与过氧化氢的效果相同，但采用过氧化氢尿素配制的溶液比采用H₂O₂配置的溶液更加稳定，可长期存放，过氧化氢尿素的水溶液具有尿素和H₂O₂性质。

本发明配制的TMB应用液可直接使用但需要4℃避光存放。优选地，配制的方法如下：

2.底物B：先配制浓度为1％过氧化氢尿素待用，称取Na₂HPO₄14.21g，柠檬酸9.607g，加入1％过氧化氢尿素2.4ml，加蒸馏水水至500ml。

3.将底物液A和底物B按1：1混合即成TMB应用液。

这种方法简单、方便、节约试剂，同时过氧化氢尿素较过氧化氢稳定，更能够确保试验的准确性。

本发明所用的蒸馏水可采用一次蒸馏水、二次蒸馏水、三次蒸馏水、或超纯水等。

下面对本发明作详细的说明。以下具体实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂如无特别说明均为常规试剂。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

森林脑炎抗原的制备

制备森林脑炎抗体重组抗原具体步骤如下：

a、重组质粒的构建

参照森林脑炎(TBE)外膜蛋白核苷酸序列(GenBank序列号：gbHM133639.1)依据大肠杆菌Escherichia coli O127:H6偏爱密码子对基因序列进行改造，通过生物信息学对重组蛋白二级结构筛选，并经多次实验验证，最终确定的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

GGTTTGACCTACACCATGTGCGACAAAACCAAGTTCACCTGGAAGCGTATCCCTACCGACTCTGGTCACGACACCGTTGTTATGGAAGTTGCTTTCTCTGGTACCAAGCCATGTCGTATCCCTGTTCGTGCTGTTGCTCACGGTTCTCCTGACGTTAACGTTGCTATGCTGATGACCCCAAACCCAACCATCGAAAACAACGGTGGTGGTTTCATCGAAATGCAACTGCCACCAGGTGACAACATCATCTACGTTGGTGAATTGTCTCACCAGTGGTTCCAGAAGGGTTCTTCTATCGGT

委托上海英俊公司合成，连接入表达载体PGEX-4T-2，获得连接产物即重组质粒，转化于DH5α感受态细胞；用PCR和双酶切鉴定重组质粒，筛选阳性克隆送上海英俊公司测序，将测序正确的重组质粒命名为PGEX-4T-2-TBE，阳性克隆的电泳结果见图1，图1中，从左至右四条条带的上样样品依次为：诱导菌液上清、诱导4h菌沉淀、诱导6h菌沉淀、分子量标准M；

b、重组蛋白的表达及鉴定

将测序正确的重组质粒PGEX-4T-2-TBE转化大肠杆菌BL21，将鉴定正确的单菌落接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜，次日按1:100接种于新的含氨苄青霉素的LB液体培养基中震荡培养至OD600达0.5-0.8后，冷却菌液温度至22℃，加入终浓度为0.8mM的IPTG，在22℃进行诱导表达；并分别于1、2、3、4、5、6小时时吸取1mL菌液，超声裂解，收集菌液，100℃煮沸10min，4℃、12000r/min离心3min，冰上放置，吸取上清进行SDS-PAGE电泳检测；电泳结束后胶用考马斯亮兰染色80min，再脱色2h后观察蛋白诱导表达情况；从诱导后1h起就有分子量约为28KD的目的蛋白表达，6h时产量最高。结果如图2所示，其中，条带1-3上样的样品分别为诱导菌液上清、4小时诱导、6小时诱导测得的结果，M为蛋白分子量标准；

C、重组蛋白的提取纯化

吸取2ml诱导表达6小时的菌液做SDS-PAGE，初步确定蛋白是否表达，及其表达量，4℃，12000r/min离心30分钟，收集细胞沉淀，用0.01M pH7.4的PBS洗涤三次，加入pH8.0裂解液(Tris-Nacl)悬浮，超声，离心后分别取10μl上清和沉淀做SDS-PAGE，电泳后用考马斯亮蓝R-250进行凝胶染色，脱色液进行脱色后检查特异性目的蛋白条带。结果表明重组蛋白以包涵体的形式表达，收集超声离心后的细胞沉淀(主要含有一些细胞碎片和包涵体)，加入pH8.0浓度为8mol/L的尿素悬浮，置于冰上摇2小时溶解包涵体，12000r/min，离心30分钟，上清液经0.22μm的滤膜过滤后用His Trap TMHP(组氨酸)亲和吸附柱纯化系统进行纯化，SDS-PAGE鉴定纯度，最后将纯化的蛋白透析到0.01M，pH7.4的PBS中，PEG-20000浓缩，得到分子量约28KD的纯化重组蛋白；取2mg纯化的蛋白制备多抗，采用常规方法进行免疫，获得阳性兔血清。

实施例2

森林脑炎抗体的磁性纳米颗粒免疫层析试纸条的制备

A、SPA标记磁性纳米颗粒，并制备磁性纳米颗粒载体垫：

取100μl Fe₃O₄磁性纳米颗粒溶液(优选地，Fe₃O₄磁性纳米颗粒粒径为12nm)，加700μl水，200μl 25％的戊二醛溶液，摇晃3h；1ml水洗1-2次，在PBS洗2次；加入500μl，2mg/ml的SPA，摇晃3h，pH值7.6；加入500μl，0.5％BSA，摇晃30分钟，进行封闭；加入含0.01％吐温-20浓度为0.01M的PBS，洗3-4次；加入1mL重悬液，其中重悬液中含有重量百分比为0.1％的Tris碱、1％的BSA和5％的蔗糖，混匀，喷涂于玻璃纤维膜上，37℃干燥4h；

B、包被硝酸纤维素膜：将实施例1制备的森林脑炎重组抗原和羊抗兔IgG用PBS溶液分别稀释至1mg/mL和0.8mg/mL，用喷膜机将稀释后的森林脑炎重组抗原和羊抗兔IgG包被于硝酸纤维素膜上作为检测带c2和质控带c1，置于37℃干燥4h；

C、样品垫处理：1％吐温20的PBS，pH＝7.4，喷涂于玻璃纤维膜上；

D、试纸条的组装：将玻璃纤维素膜制成的样品垫a、SPA标记的磁性纳米颗粒结合垫b、包被后的硝酸纤维素膜c、吸水纸制成的吸水垫d依次贴在底衬卡e上，切成宽度为0.4cm的条，装壳，所制得的试纸条结构图如图3所示；

E、试纸条的验证：将阴性兔血清取80μL滴加在样品垫上仅质控带出现棕黄色；并且在2分钟后取50μL本发明制备TMB应用液滴加在样品垫上，仅质控带的颜色加深，10min后判断结果，仅质控带显色；将森林脑炎抗原免疫的阳性兔血清取80μL滴加在样品垫上，质控带和检测带均出现棕黄色；并且在2分钟后取50μL TMB应用液滴加在样品垫上，质控带和阳性检测条带30s内加深，10min后判断结果，质控带和检测带均出现棕黄色条带，试纸条合格，可进行森林脑炎抗体的检测。

在进行森林脑炎抗体的检测时，取80μL血清样品滴加在样品垫上，并且在2分钟后取50μL TMB应用液滴加在样品垫上，10min后判断结果。若仅质控带出现棕黄色，结果为阴性，说明待检血清样品中不含有森林脑炎抗体；若质控带和检测带均出现棕黄色，结果为阳性，说明待血清检样品中含有森林脑炎抗体；若两条带都没有显色或者只有检测带显色，则说明此试纸条已经失效，结果无效。

实施例3

森林脑炎抗体的纳米磁珠免疫层析试纸及胶体金免疫层析试纸的灵敏度检测

用实施例2制备好的试纸条，和中国检验检疫科学研究卫生检疫研究所采用相同抗原抗体自制的胶体金免疫层析试纸，分别检测森林脑炎抗体血清，用胎牛血清稀释为1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000，同时将胎牛血清作为阴性对照，取80μL血清样品加样孔内，并且在2分钟后取50μLTMB显色液滴加在样品垫上，10min后判断结果，比较纳米磁珠免疫层析试纸及胶体金免疫层析试纸条的灵敏性。

试验结果如图4(胶体金层析的检测结果图)和图5(纳米磁性免疫层析试纸条的检测结果图)所示，从图4和图5可以看出，作为阴性对照的胎牛血清均为阴性，制备的纳米磁珠免疫层析试纸可检测出稀释至1:100000的森林脑炎抗体，而胶体金免疫层析试纸仅可检测出稀释至1:10000的森林脑炎抗体，可见，灵敏度相差10倍。

实施例4试纸的特异性检测

用实施例2制备的试纸条，分别检测森林脑炎阳性血清、土拉热抗体阳性血清、禽流感病毒抗体阳性血清、西尼罗病毒抗体阳性血清，其中上述血清由中国检验检疫科学研究卫生检疫研究所提供。

结果如图6所示，条带1-4依次分别为森林脑炎阳性血清检测结果、土拉热抗体阳性血清检测结果、禽流感病毒抗体阳性血清检测结果和西尼罗病毒抗体阳性血清检测结果。结果显示，试纸条与土拉热抗体阳性血清、禽流感病毒抗体阳性血清、西尼罗病毒抗体阳性血清均无反应，说明本发明制备的试纸条特异性强，与其它病毒的血清无交叉反应。

实施例5样品的检测

应用实施例2中制备的试纸条检测采集的鼠血清样本25份，取80μL鼠血清样品加样孔内，并且在2分钟后取50μL TMB显色液滴加在样品垫上，10min后判断结果，均为阴性，和ELISA检测结果一致。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种免疫磁珠底物显色试纸，该试纸包括样品垫、Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底衬卡，所述样品垫、Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接并贴在底衬卡上；所述Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫为固定有SPA标记磁性纳米颗粒载体的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜设有检测带和质控带，所述检测带包被有与待检项目结合的抗原；所述质控带包被能与SPA结合的抗体IgG。

2.如权利要求1所述的免疫磁珠底物显色试纸，其特征在于，所述Fe₃O₄磁性纳米颗粒的粒径为5nm～500nm。

3.如权利要求1所述的免疫磁珠底物显色试纸，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维素膜，所述吸水垫为吸水纸或纯棉绒浆滤纸。

4.一种免疫磁珠底物显色试纸的制备方法，采用的技术方案为，包括以下步骤：

C.样品垫处理；

D.组装试纸条。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述Fe₃O₄磁性纳米颗粒在标记前，进行氨基化或羧基化处理。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述样品垫处理步骤为：将含有体积比0.5％～2％的吐温20、pH＝7.2～7.6的PBS，喷涂于样品垫上，烘干或自然干燥后待用。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，组装试纸条后，还包括试纸条的验证步骤，验证方法为：

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述TMB应用液包括TMB和过去氧化氢，其中TMB含量在0.01mg/ml～10mg/ml，过氧化氢的摩尔浓度为0.25m mol/L～1.2m mol/L。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述TMB应用液的配制方法如下：

(1).底物液A：TMB200mg，溶于二甲基亚砜100ml，加蒸馏水水至1000ml。

(2).底物B：先配制浓度为1％过氧化氢尿素待用，称取Na2HPO414.21g，柠檬酸9.607g，加入1％过氧化氢尿素2.4ml，加蒸馏水水至500ml；

(3).将底物液A和底物B按1：1混合即成TMB应用液。

10.一种检测森林脑炎抗体的免疫磁珠底物显色试纸，其特征在于，如权利要求1所述的免疫磁珠底物显色试纸中，所述检测带包被有森林脑炎重组抗原，所述森林脑炎重组抗原的核苷酸序列如下所示：

GGTTTGACCTACACCATGTGCGACAAAACCAAGTTCACCTGGAAGCGTATCCCTACCGACTCTGGTCACGACACCGTTGTTATGGAAGTTGCTTTCTCTGGTACCAAGCCATGTCGTATCCCTGTTCGTGCTGTTGCTCACGGTTCTCCTGACGTTAACGTTGCTATGCTGATGACCCCAAACCCAACCATCGAAAACAACGGTGGTGGTTTCATCGAAATGCAACTGCCACCAGGTGACAACATCATCTACGTTGGTGAATTGTCTCACCAGTGGTTCCAGAAGGGTTCTTCTATCGGT。