CN104330556A - 森林脑炎抗体的检测试纸、试纸制备方法及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种森林脑炎抗体检测试纸，由样品垫、Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接并贴在底衬卡组成，所述Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫为固定有金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)标记磁性纳米颗粒的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜设有检测带和质控带，所述检测带包被有与森林脑炎抗原；所述质控带包被能与SPA结合的抗体。由上述检测试纸和过氧化物酶底物显色液构成用于检测森林脑炎病毒抗体的检测试剂盒。该试剂盒能有效检测森林脑炎病毒抗体，检测结果稳定、可靠、特异性强、灵敏度高，比一般胶体金检测试纸灵敏度高10-100倍，操作简单，不需要检测仪器，通过肉眼即可得到检测结果。

Description

森林脑炎抗体的检测试纸、试纸制备方法及其检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测试剂领域，特别涉及一种森林脑炎抗体的检测试纸、试纸的制备方法及其检测试剂盒。

背景技术

目前针对森林脑炎病毒抗体的检测技术主要是ELISA、化学发光等免疫学方法，其中，ELISA检测方法需要反复清洗、拍板，并要求风光光度仪器进行吸光度的检测；化学发光法中需要的荧光试剂比较昂贵，检测需要特定的荧光分析仪器；这些方法需要昂贵的仪器，操作繁琐，并且整个检测过程耗时长，还要求检测人员具有一定的专业素质。

ELISA、化学发光等免疫学检测方法最关键的一个因素是抗原抗体的选择，如果直接采用森林脑炎病毒培养液制备抗原，存在抗原成分复杂、有效抗原的含量低、杂蛋白多、免疫原性差以及生物安全风险性高等问题，而且用于免疫学检测时，容易导致阳性结果。

另外，胶体金检测方法适合现场检测，但检测灵敏度受到限制，主要是由于胶体金连接了待标记抗体或待标记蛋白之后，很不稳定，很容易因电荷的变化使得抗体脱离，造成每个胶体金的标记抗体量大大减少，从而造成灵敏度的降低。并且，胶体金试剂的制备采用氯金酸，试剂成本比较高，导致免疫层析试纸的总体成本比较高。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种快速检测森林脑炎抗体的检测试纸、试纸的制备方法及其检测试剂盒。该检测试剂盒不需要专业技术人员即可完成检测工作，也不需要专门的检测仪器即可判断检测结果，并且该检测试剂盒具有较高的灵敏度。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种森林脑炎抗体检测试纸，由样品垫、Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接并贴在底衬卡组成，所述Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫为固定有金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)标记磁性纳米颗粒的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜设有检测带和质控带，所述检测带包被有与森林脑炎抗原；所述质控带包被能与SPA结合的抗体。

如上所述的检测试纸，优选地，所述Fe₃O₄磁性纳米颗粒的粒径为5nm～500nm。

如上所述的检测试纸，优选地，所述森林脑炎抗原的基因序列如SEQ IDNO.1所示。

如上所述森林脑炎抗体检测试纸的制备方法，优选地，该方法包括：

(1)、利用森林脑炎抗原的基因序列如SEQ ID NO.1所示，制备森林脑炎抗原；

(2)、SPA标记羧基化处理的Fe₃O₄磁性纳米颗粒，喷涂于玻璃纤维膜上，制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫；

(3)、包被硝酸纤维素膜，将步骤(1)获得的森林脑炎病毒重组蛋白抗原和羊抗兔IgG分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带；

(4)、处理样品垫；

(5)、试纸条的组装：将步骤(4)处理后的样品垫、步骤(2)SPA标记的Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫、步骤(3)包被后的硝酸纤维素膜、吸水垫依次贴在底衬卡上，获得森林脑炎抗体检测试纸。

如上所述森林脑炎抗体检测试纸的制备方法，优选地，所述步骤(4)处理样品垫步骤为：将含有体积比0.5％～2％的吐温20、pH＝7.2～7.6的PBS，喷涂于样品垫上，烘干或自然干燥后待用。

如上所述森林脑炎抗体检测试纸的制备方法，优选地，所述步骤(5)中吸水垫为吸水纸或纯棉绒浆滤纸。

一种森林脑炎病毒抗体检测试剂盒，该试剂盒包括，如上所述的检测试纸和辣根过氧化物酶底物。

如上所述的检测试剂盒，优选地，所述辣根过氧化物酶底物为邻苯二胺(OPD)体系、四甲基联苯胺(TMB)体系、3.3－二氨基联苯胺(DAB)体系或2,2'-边氮基-双3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸(ABTS)体系中的任一种。

上述的辣根过氧化物酶底物的体系当中均含有过氧化氢。

如上所述的检测试剂盒，优选地，所述四甲基联苯胺体系包括：四甲基联苯胺和过氧化氢，所述四甲基联苯胺的质量浓度为0.01mg/ml～10mg/ml，所述过氧化氢的摩尔浓度为0.25m mol/L～1.2m mol/L。

如上所述的检测试剂盒，优选地，所述四甲基联苯胺体系配制方法如下：a)先将四甲基联苯胺溶于二甲基亚砜，再将加入蒸馏水定容，获得A液；

b)先配制质量浓度为0.5％～30％的过氧化氢尿素溶液，之后称取柠檬酸、磷酸氢二纳，加入过所述氧化氢尿素溶液，用蒸馏水定容，所述柠檬酸的终浓度为0.1mol/L、所述磷酸氢二纳的终浓度为0.2mol/L，所述过氧化氢尿素的摩尔浓度为0.5m mol/L～2.4m mol/L，获得B液；

c)将上述A液与B液等体积混合获得TMB应用液备用。

本发明提供一种森林脑炎病毒抗体的检测试纸，首先制备获得一种森林脑炎病毒的重组抗原蛋白；其次将四氧化三铁磁性纳米颗粒经羧基化修饰后，再进行SPA的标记，标记后形成免疫磁珠，该免疫磁珠比较稳定，能有效结合待检的目标物，不会导致假阴性结果，从而避免出现漏检；利用制备的重组抗原蛋白和SPA标记的四氧化三铁磁性纳米颗粒制备森林脑炎病毒抗体免疫层析检测试纸。

利用制备的森林脑炎病毒抗体免疫层析检测试纸，进行样品的检测，判断结果时，最后加入TMB应用液，增强结果的显色功能。主要是利用Fe₃O₄磁性纳米颗粒具有辣根过氧化物酶的催化特性，加入辣根过氧化物酶的底物显色反应后，判断检测结果，底物通过四氧化三铁的催化作用，使检测条带的颜色加深，极大地放大反应效果，灵敏度大大提高，可比胶体金检测灵敏度高10-100倍的数量级，且不需要检测仪器进行结果的判定。

采用TMB作为显色底物时，只需要添加本发明配置的一种TMB应用液就可实现显色反应，比常规应用TMB溶液显色需要分别添加A液、B液使用方便，节省时间，且不需要用现用现配。

本发明制备的森林脑炎病毒抗体检测试剂盒，试剂成本低，检测试剂溶液稳定、特异性强、灵敏度高、比胶体金检测结果灵敏度高10-100倍，检测结果准确可靠，操作简单，不需要较强的专业技术就可以操作，通过肉眼观察来判断检测结果，并不需要仪器进行判断，使用方便。

附图说明

图1是本发明重组质粒的阳性克隆的电泳结果图。

图2是本发明森林脑炎病毒重组蛋白表达SDS-PAGE电泳图。

图3是本发明森林脑炎病毒抗体的检测试剂盒的检测结果。

图4是胶体金免疫层析试纸检测结果。

具体实施方式

目前在生物技术检测方面，有利用四氧化三铁纳米颗粒进行检测的应用，主要是利用其具有磁响应性的功能，对待检目的物进行富集分离的，可有效提高检测率。四氧化三铁纳米颗粒还具有辣根过氧化物酶催化底物变色的特性，但是利用这个特性进行ELISA检测鲜有报道，主要原因可能是一方面考虑到由于四氧化三铁纳米颗粒的量子化尺寸效应等，使它对某种波长的光吸收带有蓝移现象，并对各种波长光的吸收有宽化现象，认为对ELISA检测需要测量吸光度值不是很准确；另一方面，由于四氧化三铁本身具有的颜色，会对后续测定吸光度值有影响，所以认为利用四氧化三铁纳米颗粒具有辣根过氧化物酶的特性进行免疫学方法的检测，尤其是ELISA检测，结果不是很准确、可靠，有一定的技术偏见。

本发明利用四氧化三铁具有辣根过氧化物酶催化的特性，即能催化邻苯二胺体系即含有过氧化氢和邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺体系即含有过氧化氢和四甲基联苯胺(TMB)的溶液、3.3－二氨基联苯胺即含有过氧化氢和3.3－二氨基联苯胺(DAB)的溶液，或2.2'-边氮基-双3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸(ABTS)即含有过氧化氢和2.2'-边氮基-双3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸(ABTS)的溶液显色的特点，首次将四氧化三铁纳米颗粒利用到免疫层析试纸上进行抗原抗体的检测，利用四氧化三铁可使辣根过氧化物酶底物显色的特性，极大地增强检测信号，使本发明的制备的免疫层析试纸检测灵敏度大大提高，也使四氧化三铁具有辣根过氧化物酶催化的特性，能用于免疫学方法检测成为可能。

本发明利用四氧化三铁磁性纳米颗粒制备检测试纸还有效解决了，采用胶体金材料制备试纸时，胶体金包被不稳定性，使灵敏度降低的问题。主要是，本发明制备检测试纸时，对四氧化三铁颗粒进行了羧基化处理，有利于包被反应，且与包被物形成稳定的结构，并且包被后不会影响包被物的免疫学特性。

本发明采用磁性纳米颗粒包被SPA制备检测试纸时，对所用的磁性纳米颗粒粒径的选择做了研究，研究结果表明磁性纳米颗粒粒径优选在5nm～500nm范围内，粒径小于5nm，颗粒太小，抗原或抗体很难包被，粒径大于500nm时，磁性纳米颗粒容易聚集，导致沉淀从而不适宜用于制备检测试纸。

另外，通过对样品垫的处理方式进行了研究，发现采用本发明的处理方法，可有效地避免非特异性反应，降低假阳性的检出率。

本发明还对辣根过氧化物酶显色的底物做了进一步的研究，研究表明，含有双氧水的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、3.3－二氨基联苯胺(DAB)或2.2'-边氮基-双3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸(ABTS)等溶液均可使四氧化三铁纳米颗粒制备的检测试纸显色加强。

本发明对TMB应用液中TMB的含量和H₂O₂的含量，进行了进一步的研究，研究表明TMB含量在0.01mg/ml～10mg/ml，过氧化氢的摩尔浓度为0.25m mol/L～1.2m mol/L，四氧化三铁纳米颗粒制备的检测试纸显色效果较佳。

常规ELISA采用的底物为TMB显色液，反应时，首先需要加入含有TMB的A液，再加入含有H₂O₂的B液，进行反应，一般A液与B液是分开存放或是现用现配，因TMB溶液与单独的H₂O₂溶液混合一起后，存放一段时间容易产生浑浊或沉淀，长期存放会影响检测结果，一般采用H₂O₂溶液时最好现配现用。

本发明对TMB应用液的配制方法进一步进行改进，研究发现采用过氧化氢水溶液和过氧化氢尿素的效果相同，但采用采用过氧化氢尿素配制的溶液比采用H₂O₂配制的溶液更加稳定，过氧化氢尿素的水溶液具有尿素和H₂O₂性质。

本发明配制的TMB应用液可直接使用，但需要4℃避光存放。优选地，配制的方法如下：

1.底物液A：TMB200mg，溶于二甲基亚砜100ml，加双蒸水至1000ml。

2.底物B：先配制重量浓度为1％过氧化氢尿素待用，称取Na₂HPO₄14.21g，柠檬酸9.607g，加入1％过氧化氢尿素2.4ml，加双蒸水至500ml。

3.将底物液A和底物B按1：1混合即成TMB应用液。

这种方法简单、方便、节约试剂，同时过氧化氢尿素较过氧化氢稳定，更能够确保试验的准确性。

本发明中所指的蒸馏水可以是一次蒸馏水，也可以是二次蒸馏水、三次蒸馏水或超纯水。

下面对本发明的技术方案作详细的说明。以下具体优选地实施例中所用的所用试剂如无特别说明均为常规试剂，所述百分比如无特别说明均为重量百分比含量。

实施例1森林脑炎抗原的制备

制备森林脑炎抗原具体步骤如下：

a、重组质粒的构建

对森林脑炎抗原的选择，本发明发明人进行多次试验，最终确定选择森林脑炎(TBE)外膜蛋白，其核苷酸序列(GenBank序列号：HM133639.1)，依据大肠杆菌Escherichia coli O127:H6偏爱密码子对基因序列进行改造，并通过生物信息学对重组蛋白二级结构筛选，(筛选方案见实质审查参考资料，在此不做赘述)，并经多次实验验证，最终确定的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

按照SEQ ID NO.1所示的序列委托上海英俊公司合成，连接入表达载体PGEX-4T-2，获得连接产物即重组质粒，转化于DH5α感受态细胞；用PCR和双酶切鉴定重组质粒，筛选阳性克隆送上海英俊公司测序，将测序正确的重组质粒命名为PGEX-4T-2-TBE，阳性克隆的电泳结果见图1，图1中，从左至右四条条带的上样样品依次为：诱导菌液上清、诱导4h菌沉淀、诱导6h菌沉淀、分子量标准M。

b、重组蛋白的表达及鉴定

将测序正确的重组质粒PGEX-4T-2-TBE转化大肠杆菌BL21，将鉴定正确的单菌落接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜，次日按1:100接种于新的含氨苄青霉素的LB液体培养基中震荡培养至OD600达0.5-0.8后，冷却菌液温度至22℃，加入终浓度为0.8mM的IPTG，在22℃进行诱导表达；并分别于1、2、3、4、5、6小时时吸取1mL菌液，超声裂解，收集菌液，100℃煮沸10min，4℃、12000r/min离心3min，冰上放置，吸取上清进行SDS-PAGE电泳检测；电泳结束后，胶用考马斯亮兰染色80min，再脱色2h后观察蛋白诱导表达情况；从诱导后1h起就有分子量约为28KD的目的蛋白表达，6h时产量最高。结果如图2所示，其中，条带1-3上样的样品分别为诱导菌液上清、4小时诱导、6小时诱导测得的结果，M为蛋白分子量标准。

C、重组蛋白的提取纯化

吸取2ml诱导表达6小时的菌液做SDS-PAGE，初步确定蛋白是否表达，及其表达量，4℃，12000r/min离心30分钟，收集细胞沉淀，用0.01M pH7.4的PBS洗涤三次，加入pH8.0裂解液(Tris-Nacl)悬浮，超声，离心后分别取10μl上清和沉淀做SDS-PAGE，电泳后用考马斯亮蓝R-250进行凝胶染色，脱色液进行脱色后检查特异性目的蛋白条带。结果表明重组蛋白以包涵体的形式表达，收集超声离心后的细胞沉淀(主要含有一些细胞碎片和包涵体)，加入pH8.0浓度为8M的尿素悬浮，置于冰上摇2小时溶解包涵体，12000r/min，离心30分钟，上清液经0.22μm的滤膜过滤后用His TrapTMHP(组氨酸)亲和吸附柱纯化系统进行纯化，SDS-PAGE鉴定纯度，最后将纯化的蛋白透析到0.01M，pH7.4的PBS中，PEG-20000浓缩，得到分子量约28KD的纯化重组蛋白；取2mg纯化的重组蛋白制备多抗，采用常规方法进行免疫大白兔，获得阳性兔血清。

实施例2制备森林脑炎病毒抗体的检测试纸条

A、SPA标记磁性纳米颗粒，并制备磁性纳米颗粒载体垫：

取100μl四氧化三铁磁性纳米颗粒溶液(四氧化三铁颗粒粒径优选为12nm)，加700μl水，200μl 25％的戊二醛溶液，摇晃3h；1ml水洗1-2次，在PBS洗2次，即将四氧化三铁磁性纳米颗粒进行羧基化处理；加入500μl，2mg/ml的SPA，摇晃3h，pH值7.6；加入500μl，0.5％BSA，摇晃30分钟，进行封闭；加入含0.01％吐温-20浓度为0.01M的PBS，，洗3-4次；加入1mL重悬液，其中重悬液中含有重量百分比为0.1％的Tris碱、1％的BSA和5％的蔗糖，混匀，喷涂于玻璃纤维膜上，37℃干燥4h；

B、包被硝酸纤维素膜：将实施例1制备的森林脑炎病毒重组蛋白抗原和羊抗兔IgG用PBS溶液分别稀释至1mg/mL和0.8mg/mL，用喷膜机将稀释后的森林脑炎重组抗原和羊抗兔IgG包被于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带，置于37℃干燥过夜；

C、样品垫处理：1％(v/v)吐温20的PBS，pH＝7.4，喷涂于玻璃纤维膜上；

D、试纸条的组装：，将玻璃纤维素膜制成的样品垫、SPA标记的磁性纳米颗粒结合垫、包被后的硝酸纤维素膜、吸水纸制成的吸水垫依次贴在底衬卡上，切成宽度为0.4cm的条，装壳；

E、试纸条的验证：将阴性兔血清取80μL滴加在样品垫上仅质控带出现棕黄色；并且在2分钟后取上述配制的50μL TMB应用液滴加在样品垫上，仅质控带的颜色加深，10min后判断结果，结果表明，仅质控带显色；将森林脑炎抗原免疫的阳性兔血清取80μL滴加在样品垫上，质控带和检测带均出现棕黄色；并且在2分钟后取50μL TMB应用液滴加在样品垫上，质控带和阳性检测条带30s内加深，10min后判断结果，质控带和检测带均出现棕黄色条带，试纸条合格，可进行森林脑炎抗体的检测。

在进行森林脑炎病毒抗体的检测时，取80μL血清样品滴加在样品垫上，并且在2分钟后取50μL TMB应用液滴加在样品垫上，10min后判断结果。若仅质控带出现棕黄色，结果为阴性，说明待检血清样品中不含有森林脑炎病毒抗体；若质控带和检测带均出现棕黄色，结果为阳性，说明待血清检样品中含有森林脑炎病毒抗体；若两条带都没有显色或者只有检测带显色，则说明此试纸条已经失效，结果无效。

实施例3本发明制备的森林脑炎抗体的检测试纸和胶体金免疫层析试纸的灵敏度检测

其中，本发明制备的森林脑炎抗体的检测试纸的制备方法见实施例2；

胶体金免疫层析试纸的制备方法：

采用常规方法制备胶体金免疫层析试纸，其中采用SPA标记胶体金颗粒，硝酸纤维素膜上的检测带包被有森林脑炎病毒重组抗原，质控带包被羊抗兔IgG。

采用实施例2制备的试纸条分别检测森林脑炎抗体血清，用胎牛血清稀释为1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000，同时将胎牛血清作为阴性对照，取80μL血清样品加样孔内，并且在2分钟后取50μLTMB应用液滴加在样品垫上，10min判断结果，比较纳米磁珠免疫层析试纸及对比例1制备的胶体金免疫层析试纸条的灵敏性。

试验结果表明，作为阴性对照的胎牛血清均为阴性，制备的纳米磁珠免疫层析试纸可检测出稀释至1:100000的森林脑炎抗体，而胶体金免疫层析试纸仅可检测出稀释至1:10000的森林脑炎抗体，灵敏度相差10倍。纳米磁珠免疫层析试纸检测结果如图3所示，图4为胶体金免疫层析试纸检测结果，其中图中：C为质控带；T为检测带；1-6分别为森林脑炎阳性血清稀释浓度：1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000；7为阴性对照。

实施例4森林脑炎抗体检测试纸的特异性检测

采用实施例2制备的森林脑炎抗体检测试纸进行森林脑炎抗体的检测时，取80μL血清样品滴加在检测试纸的样品垫上，并且在2分钟后取50μL TMB应用液滴加在样品垫上，10min判断结果。若仅质控带出现棕黄色，结果为阴性，说明待检血清样品中不含有森林脑炎抗体；若质控带和检测带均出现棕黄色，结果为阳性，说明待血清检样品中含有森林脑炎抗体；若两条带都没有显色或者只有检测带显色，则说明此试纸条已经失效，结果无效。

通过对森林脑炎病毒重组蛋白阳性血清、土拉热抗体阳性血清、禽流感病毒抗体阳性血清、西尼罗病毒抗体阳性血清的检测，检测结果表明只有森林脑炎阳性血清为阳性结果，其余样品为阴性结果，说明本发明的森林脑炎抗体检测试纸的特异性强，结果准确可靠。

实施例5本发明检测试纸的应用

应用实施例2中制备的试纸条检测吉林省林区采集的鼠血清样本25份，取80μL鼠血清样品加样孔内，并且在2分钟后取50μL TMB应用液滴加在样品垫上，10min后判断结果，均为阴性，和ELISA检测结果一致，其中，ELISA检测所用试剂盒为购自德国IBL公司的TBEV/FSME IgG ELISA试剂盒。

在以上实施列中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种森林脑炎抗体检测试纸，由样品垫、Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接并贴在底衬卡组成，所述Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫为固定有金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)标记磁性纳米颗粒的玻璃纤维膜；所述硝酸纤维素膜设有检测带和质控带，所述检测带包被有与森林脑炎抗原；所述质控带包被能与SPA结合的抗体。

2.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述Fe₃O₄磁性纳米颗粒的粒径为5nm～500nm。

3.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述森林脑炎抗原的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种森林脑炎抗体检测试纸的制备方法，其特征在于，该方法包括：

(1)、利用森林脑炎抗原的基因序列如SEQ ID NO.1所示制备森林脑炎抗原；

(2)、SPA标记羧基化处理的Fe₃O₄磁性纳米颗粒，喷涂于玻璃纤维膜上，制备Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫；

(3)、包被硝酸纤维素膜，将步骤(1)获得的森林脑炎病毒重组蛋白抗原和羊抗兔IgG分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带；

(4)、处理样品垫；

(5)、试纸条的组装：将步骤(4)处理后的样品垫、步骤(2)SPA标记的Fe₃O₄磁性纳米颗粒载体垫、步骤(3)包被后的硝酸纤维素膜、吸水垫依次贴在底衬卡上，获得森林脑炎抗体检测试纸。

5.如权利要求4所述森林脑炎抗体检测试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)处理样品垫步骤为：将含有体积比0.5％～2％的吐温20、pH＝7.2～7.6的PBS，喷涂于样品垫上，烘干或自然干燥后待用。

6.如权利要求4所述森林脑炎抗体检测试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中吸水垫为吸水纸或纯棉绒浆滤纸。

7.一种森林脑炎病毒抗体检测试剂盒，该试剂盒包括，如权利要求1-3中任一所述的检测试纸和辣根过氧化物酶底物。

8.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶底物为邻苯二胺(OPD)体系、四甲基联苯胺(TMB)体系、3.3－二氨基联苯胺(DAB)体系或2.2'-边氮基-双3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸(ABTS)体系中的任一种。

9.如权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述四甲基联苯胺体系包括：四甲基联苯胺和过氧化氢，所述四甲基联苯胺的质量浓度为0.01mg/ml～10mg/ml，所述过氧化氢的摩尔浓度为0.25m mol/L～1.2mmol/L。

10.如权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述四甲基联苯胺体系配制方法如下：a)先将四甲基联苯胺溶于二甲基亚砜，再将加入蒸馏水定容，获得A液；

b)先配制质量浓度为0.5％～30％的过氧化氢尿素溶液，之后称取柠檬酸、磷酸氢二纳，加入过所述氧化氢尿素溶液，用蒸馏水定容，所述柠檬酸的终浓度为0.1mol/L、所述磷酸氢二纳的终浓度为0.2mol/L，所述过氧化氢尿素的摩尔浓度为0.5m mol/L～2.4m mol/L，获得B液；

c)将上述A液与B液等体积混合获得TMB应用液备用。