CN115541882A - 一种提高人类免疫缺陷病毒抗体检测试纸条的制备方法、试剂盒 - Google Patents

一种提高人类免疫缺陷病毒抗体检测试纸条的制备方法、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测领域，公开了一种提高人类免疫缺陷病毒抗体检测试纸条的制备方法、试剂盒；一种病毒抗体检测试纸条的制备方法，胶体金标记抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原的方法如下：将胶体金溶液与碳酸钾溶液混合；将gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原和稳定剂进行混合；将两种混合液中混合；加入甘氨酸进行混合，得到胶体金标记的抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原；本申请公开的人类免疫缺陷病毒抗体胶体金检测试剂盒灵敏度提高了10‑100倍，同时在整个生产过程中具有操作简单，特异性强等特点，在使用方面具有操作快速简便、结果准确、经济适用，可以用于家庭自检等优点。

Description

一种提高人类免疫缺陷病毒抗体检测试纸条的制备方法、试 剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及一种提高人类免疫缺陷病毒抗体检测试纸条的制备方法、试剂盒。
背景技术
人类免疫缺陷综合征，又称艾滋病（AIDS），是由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染所引起的一种免疫缺陷病毒，由于该病毒目前尚无有效的治疗方案和预防疫苗，目前正在以大约1.4万人受感染的速度扩大流行。HIV感染诊断具有识别早期感染的人群的能力，因而是AIDS预防控制工作的首要任务，因此，建立高敏感实用的检测方法对于检测、诊断或血液筛查，控制艾滋病的流行就显得非常重要。
现在检测HIV的方法有聚合酶链式反应、HIV抗体ELISA检测、HIV免疫印迹法检测、荧光定量检测。其缺点是这些检测需要使用相关的仪器设备，而且需要专业的技术人员进行检测，普通人无法进行自检操作，同时目前市面上的HIV检测试纸条又存在灵敏度不足，会出现假阴性或者假阳性情况，因此，急需一款可以提高灵敏度而且操作简单，不需要专业人员就可以完成检测的试剂盒，这样可以对可疑人员进行及早的确定，防止出现漏检情况。
发明内容
针对现有技术的不足，本申请提供了一种提高人类免疫缺陷病毒抗体检测试纸条的制备方法、试剂盒。
第一方面，本申请提供一种病毒抗体检测试纸条的制备方法，采用如下的技术方案：
一种病毒抗体检测试纸条的制备方法，所述试纸条包括底板、样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫，所述样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫按层析方向顺次搭接粘贴在底板上，NC膜上包被有检测线和质控线，金标垫上包被有胶体金标记的抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原；
其中，胶体金标记抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原的方法如下：
（1）将胶体金溶液与碳酸钾溶液混合；
（2）将gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原和稳定剂进行混合；
（3）将步骤（2）得到的混合液加入至步骤（1）得到的混合液中进行反应；
（4）加入甘氨酸进行反应，即可得到胶体金标记的抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原。
通过采用上述技术方案，本申请中可以使不同抗原进行同时标记，加入的稳定剂起到了明显的保护作用，稳定剂主要起到两种作用，首先，由于稳定剂是大分子物质，稳定了包被体系的平衡，让标记环境处于弱碱性状态，增强各抗原的标记效果，防止标记过程出现死金现象；其次，稳定剂和抗原在标记过程中起到竞争作用，标记中如果蛋白的含量偏低，会出现死金标记不上的情况，如果蛋白的含量过多，则会出现标记蛋白饱和，导致灵敏度不高，因此，增加稳定剂可以明显增强反应的灵敏度。
本申请中通过对标记工艺的改进，对灵敏度的提升具有显著性，因为现有的试剂盒中，标记胶体金结合的蛋白是过量的，在检测低浓度样本时存在过量情况，导致显色偏弱，本申请中通过对标记工艺改进，可以对胶体金结合的蛋白进行控制，这样在检测低浓度样本时，可以结合更多的胶体金复合物，使胶体金的显色更加明显。
优选的，步骤（2）中gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原和稳定剂的质量比为（1-2）:（1-2）:（0.5-2）:（0.5-2）。
优选的，步骤（2）中稳定剂为甘氨酸、BSA、酪蛋白、PVP10、PEG20000、小牛血清中至少一种。
优选的，步骤（4）中甘氨酸的加入量为500-1000μl。
优选的，步骤（1）中胶体金溶液的加入量为10-20ml；碳酸钾溶液的加入量为20-40μl。
本申请中对胶体金的标记方案进行改进，通过将四种蛋白混合到一起进行标记，现有技术中方案是四个蛋白分别进行标记，然后混合到一起使用，因此，本申请对胶体金的标记方案不同于现有技术的方案。由于不同蛋白的等电点存在差异，如果直接将蛋白混合标记会存在死金等无法标记成功的情况，本申请中通过对胶体金标记工艺的创新，将传统的蛋白分别标记变换成一次性混合标记，在标记的过程中，通过添加大分子蛋白等物质（比如甘氨酸、BSA、酪蛋白、PVP10、PEG20000、小牛血清），可以起到稳定PH值作用，可以有利于蛋白的标记。
本申请中通过胶体金的标记方案进行改进，通过一步法混合标记，不仅大大节约了标记时间和标记步骤，同时混合的蛋白，可以对标记的蛋白产生竞争作用，可以降低胶体金颗粒表面蛋白的量，防止当待检测浓度很低时，待检测物被同一个胶体金颗粒过多捕获，从而降低了检测灵敏度，同时混合标记可以让胶体金颗粒产生复合体结构，极大的增加了显色强度。
在一个具体的可实施方案中，胶体金标记抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原的方法如下：
（1）取10-20ml胶体金溶液，然后加入20-40μl 0.2M碳酸钾溶液，混匀；
（2）将gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原和甘氨酸按照（1-2）:（1-2）:（0.5-2）:（0.5-2）的量混合，其中，稳定剂为甘氨酸、BSA、酪蛋白、PVP10、PEG20000、小牛血清中至少一种；
（3）将步骤（2）混合好的液体一次性加入到步骤（1）混合后的胶体金溶液中，反应15-30min；
（4）然后再加入500-1000μl质量浓度为10%甘氨酸，反应30-60min后反应结束。
在一个具体的可实施方案中，步骤（1）中胶体金溶液的制备工艺如下：
S1、将柠檬酸三钠溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、调节剂混合后，在50-60℃下进行反应；
S2、加入氯金酸溶液，在50-60℃下进行反应；
S3、升温至70-80℃进行反应，得到胶体金。
通过采用上述技术方案，本申请中通过对胶体金溶液的制备工艺的改进，可以提高制金的效率，同时在相对低温的环境中进行胶体金的制备，其中，柠檬酸三钠主要起还原氯金酸的作用，使氯金酸还原成胶体金；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐起到缓冲环境作用，防止pH值的剧烈变化导致金颗粒大小不均一；调节剂在其中的作用主要是增加了分子之间的活化能，提高了分子之间的碰撞率，提高制金的效率，同时可以降低液体的沸点。
本申请通过对温度的控制，从而达到对胶体金颗粒均一稳定的要求；胶体金颗粒的均一性，对试纸条的灵敏度和特异性起到关键性作用。
优选的，步骤S1中柠檬酸三钠溶液的加入量为1-2ml；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的加入量为1-2ml；调节剂的加入量为10-20ml；步骤S2中氯金酸溶液的加入量为2-3ml。
优选的，步骤S1中调节剂为乙醇、甲醇、异丙醇中至少一种。
优选的，步骤S1、步骤S2中搅拌的转速为100-200rpm；步骤S3中搅拌的转速为150-250rpm。
本申请中通过将氯金酸加入到柠檬酸三钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙醇的混合液里面进行制备的，该混合液可以增强还原反应，从而实现了低温制金的条件，不需要像传统制金方式，必须加热到100℃以上进行反应，因此，本申请的制备工艺可以避免高温煮沸进行制备，另外，传统高温煮沸制备由于大量气泡的产生，会导致受热不均匀，从而影响颗粒的均一性。
本申请在制备的过程中，通过对转速的控制，从而实现对胶体金颗粒的大小进行控制，防止由于转速不均匀，导致受热不均匀，从而影响颗粒的大小。
通过采用上述技术方案，通过对胶体金制备工艺的改进，可以低温进行胶体金的制备，通过对温度、转速等的控制，从而对胶体金的均一度和粒径大小进行有效控制，获得非常理想的胶体金颗粒，将该胶体金颗粒用在HIV产品的性能测试上，会获得灵敏度更高的产品。
在一个具体的可实施方案中，步骤（1）中胶体金溶液的制备工艺如下：
（1）将1-2ml的质量浓度为2%柠檬酸三钠溶液，1-2ml的0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和10-20ml的调节剂，将烧杯放在油浴锅中加热，此时温度设置为50-60℃加热，转速设置为100-200rpm；其中，调节剂为乙醇、甲醇、异丙醇中至少一种；
（2）加热到50-60℃后，一次性加入2-3ml的质量浓度为2%氯金酸溶液，保持转速在100-200rpm，温度50-60℃，1-3min；
（3）然后将转速调整为150-250rpm，温度70-80℃，加热10-15min，然后结束反应；
（4）此时制备好的胶体金可以恢复室温，等待使用，长期储存保持在2-8℃避光。
第二方面，本申请提供一种试剂盒，采用如下的技术方案：
一种试剂盒，包括上述的试纸条。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
1、本申请公开的制备方法得到的人类免疫缺陷病毒抗体胶体金检测试剂盒，其灵敏度提高了10-100倍，并且其阳性检出率可达100%，特异性可达100%，有效提高HIV检测的灵敏度，防止漏检，同时提高试剂的阴性率，防止假阳出现，在整个生产过程中具有操作简单，特异性强等特点，在使用方面具有操作快速简便、结果准确、经济适用，可以用于家庭自检等优点，确保了检测的隐私性和结果的准确性；
2、本申请中对胶体金制备方案进行改进，通过对温度的控制，从而达到对胶体金颗粒均一稳定的要求，有效提高了试纸条的灵敏度和特异性；
3、本申请中通过对胶体金标记工艺的改进，将蛋白分别标记变换成一次性混合标记，通过添加大分子蛋白等物质，可以起到稳定PH值作用，可以有利于蛋白的标记；
4、本申请中通过对胶体金标记工艺的改进，可以对胶体金结合的蛋白进行控制，在检测低浓度样本时，可以结合更多的胶体金复合物，使胶体金的显色更加明显，对灵敏度的提升具有显著性。
具体实施方式
本申请涉及的原料均采用市售产品，以下结合实施例和对比例对本申请作进一步详细说明。
本实施例中所用的英文缩写如下：
BSA 小牛血清蛋白
NC膜 硝酸纤维素膜
PBS 磷酸盐缓冲液
PEG 聚乙二醇
PVP 聚乙烯吡咯烷酮。
实施例1：胶体金的制备
胶体金的制备工艺如下：
（1）在圆底烧瓶中加入90ml超纯水，然后加入1ml质量浓度为2%的柠檬酸三钠溶液，1ml的0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和10ml的乙醇；将烧杯放在油浴锅中加热，此时温度设置为50℃加热，转速设置为100rpm；
（2）加热到50℃后，一次性加入2ml质量浓度为2%的氯金酸溶液，保持转速在100rpm，温度50℃下，反应1min；
（3）然后将转速调整为150rpm，温度70℃，加热10min，然后结束反应；
（4）此时制备好的胶体金可以恢复室温，等待使用，长期储存保持在2-8℃避光。
实施例2：胶体金的制备
胶体金的制备工艺如下：
（1）在圆底烧瓶中加入90ml超纯水，然后加入1.5ml质量浓度为2%的柠檬酸三钠溶液,1.5ml的0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和15ml的乙醇；将烧杯放在油浴锅中加热，此时温度设置为50℃加热，转速设置为150rpm；
（2）加热到50℃后，一次性加入2ml质量浓度为2%的氯金酸溶液，保持转速在150rpm，在温度50℃下反应1min；
（3）然后将转速调整为200rpm，在温度70℃下进行加热10min，然后结束反应；
（4）此时制备好的胶体金可以恢复室温，等待使用，长期储存保持在2-8℃避光。
实施例3：胶体金的制备
胶体金的制备工艺如下：
（1）在圆底烧瓶中加入90ml超纯水，然后加入2ml质量浓度为2%柠檬酸三钠溶液,2ml的0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和20ml的乙醇。将烧杯放在油浴锅中加热，此时温度设置为50℃加热，转速设置为200rpm；
（2）加热到50℃后，一次性加入2ml质量浓度为2%氯金酸溶液，保持转速在200rpm，在温度50℃下进行反应1min；
（3）然后将转速调整为250rpm，温度70℃，加热10min，然后结束反应；
（4）此时制备好的胶体金可以恢复室温，等待使用，长期储存保持在2-8℃避光。
实施例4：胶体金的制备
胶体金的制备工艺如下：
（1）在圆底烧瓶中加入90ml超纯水，然后加入1ml质量浓度为的2%柠檬酸三钠溶液,1ml的0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和10ml的甲醇；将烧杯放在油浴锅中加热，此时温度设置为60℃加热，转速设置为100rpm；
（2）加热到60℃后，一次性加入3ml质量浓度为2%的氯金酸溶液，保持转速在100rpm，在温度60℃下进行反应3min；
（3）然后将转速调整为150rpm，在温度80℃下加热200min，然后结束反应；
（4）此时制备好的胶体金可以恢复室温，等待使用，长期储存保持在2-8℃避光。
实施例5：胶体金的制备
胶体金的制备工艺如下：
（1）在圆底烧瓶中加入90ml超纯水，然后加入2ml质量浓度为2%的柠檬酸三钠溶液，2ml的0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和20ml的异丙醇；将烧杯放在油浴锅中加热，此时温度设置为60℃加热，转速设置为200rpm；
（2）加热到60℃后，一次性加入2ml质量浓度为2%的氯金酸溶液，保持转速在200rpm，在温度60℃下进行反应3min；
（3）然后将转速调整为250rpm，在温度80℃下加热20min，然后结束反应；
（4）此时制备好的胶体金可以恢复室温，等待使用，长期储存保持在2-8℃避光。
实施例6：胶体金标记
胶体金标记抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原的方法如下：
（1）取10ml胶体金溶液（实施例1制备得到），然后加入20μl 0.2M碳酸钾溶液，混匀；
（2）将gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原和甘氨酸按照1:1:0.5:0.5的量混合（其中，gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原和甘氨酸的总加入量为500μg）；
（3）将步骤（2）混合后的液体一次性加入到步骤（1）中的胶体金溶液中，反应15min；
（4）然后再加入500μl质量浓度为10%甘氨酸，反应30min后反应结束。
实施例7：胶体金标记
胶体金标记抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原的方法如下：
（1）取10ml胶体金溶液（实施例2制备得到），然后加入40μl 0.2M碳酸钾溶液，混匀；
（2）将gp41、gp36、鸡IgY和甘氨酸按照2:2:2:2的量混合（其中，gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原和甘氨酸的总加入量为500μg）；
（3）将步骤（2）混合后的液体一次性加入到步骤（1）中的胶体金溶液中，反应15min；
（4）然后再加入500μl质量浓度为10%甘氨酸，反应30min后反应结束。
实施例8：胶体金标记
胶体金标记抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原的方法如下：
（1）取10ml胶体金溶液（实施例3制备得到），然后加入20μl 0.2M碳酸钾溶液，混匀；
（2）将gp41、gp36、鸡IgY和甘氨酸按照1.5:1.5:1:1的量混合（其中，gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原和甘氨酸的总加入量为500μg）；
（3）将步骤（2）混合后的液体一次性加入到步骤（1）中的胶体金溶液中，反应15min；
（4）然后再加入500μl质量浓度为10%甘氨酸，反应30min后反应结束。
实施例9：胶体金标记
胶体金标记抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原的方法如下：
（1）取20ml胶体金溶液（实施例4制备得到），然后加入20μl 0.2M碳酸钾溶液，混匀；
（2）将gp41、gp36、鸡IgY和甘氨酸按照1:2:2:1的量混合（其中，gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原和甘氨酸的总加入量为500μg）；
（3）将步骤（2）混合后的液体一次性加入到步骤（1）中的胶体金溶液中，反应15min；
（4）然后再加入500μl质量浓度为10%甘氨酸，反应30min后反应结束。
实施例10：胶体金标记
胶体金标记抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原的方法如下：
（1）取10ml胶体金溶液（实施例5制备得到），然后加入20μl 0.2M碳酸钾溶液，混匀；
（2）将gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原和BSA按照1:1:2:2的量混合（其中，gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原和BSA的总加入量为500μg）；
（3）将步骤（2）混合后的液体一次性加入到步骤（1）中的胶体金溶液中，反应30min；
（4）然后再加入1000μl质量浓度为10%甘氨酸，反应60min后反应结束。
实施例11：病毒抗体检测试剂盒的制备
病毒抗体检测试剂盒的制备步骤如下：
步骤一、结合垫的制备
（1）结合垫处理液配方：20mM PBS缓冲液，其中含有0.3%PEG20000；1%的甘氨酸；0.5%的吐温20；0.1%的Proclin300；5%的蔗糖，pH7.4；
（2）将处理液固化在玻纤上，20*30cm规格的玻纤加入45ml结合垫处理液，烘箱烘干6h；
（3）烘干后，存储在湿度小于30%铝箔袋中。
步骤二、喷金
（1）将实施例6中制备得到的标记好的金溶液，喷在上述步骤一处理的结合垫中；
（2）喷量设置为2-4μl/cm，然后放入烘箱烘干2h；
（3）烘干好的金标垫储存于湿度小于30%环境中备用；
步骤三、样品垫的制备
（1）样本垫处理液配方：20mM PBS缓冲液，其中含有1%的BSA；0.5%的吐温20；0.1%的Proclin300，pH7.4；
（2）将处理液固化在玻纤上，20*30cm规格的玻纤加入45ml结合垫处理液，烘箱烘干6h；
（3）烘干后，存储在湿度小于30%铝箔袋中；
步骤四、NC膜
（1）取NC膜贴于PVC底板上；
（2）然后将gp140抗原和羊抗鸡IgY抗原，分别用含3%蔗糖的20mM PBS稀释成1mg/ml液体；
（3）将1mg/ml的gp140抗原作为检测线T，将1mg/ml的羊抗鸡IgY抗原作为C，分别固定在NC膜上，固定的量为1μl/cm；
（4）固定好抗体的NC膜放入烘箱中烘干2h；
（5）烘干好的NC膜储存于湿度小于30%环境中备用；
步骤物五、试纸条组装
将样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫按层析方向顺次搭接粘贴在底板上，然后裁剪成试纸条。
实施例12：病毒抗体检测试剂盒的制备
本实施例与实施例11的区别之处在于，步骤二中，所用的标记好金溶液为实施例7中制备得到的。
实施例13：病毒抗体检测试剂盒的制备
本实施例与实施例11的区别之处在于，步骤二中，所用的标记好金溶液为实施例8中制备得到的。
实施例14：病毒抗体检测试剂盒的制备
本实施例与实施例11的区别之处在于，步骤二中，所用的标记好金溶液为实施例9中制备得到的。
实施例15：病毒抗体检测试剂盒的制备
本实施例与实施例11的区别之处在于，步骤二中，所用的标记好金溶液为实施例10中制备得到的。
对比例1：
步骤一、胶体金的制备
（1）将1ml质量浓度为1%的氯金酸溶液和99ml超纯水混匀，然后使用加热装置煮至沸腾；
（2）然后迅速加入1ml的质量浓度为2%柠檬酸三钠溶液；
（3）待烧瓶中的液体颜色变化为深紫色，持续加热10min，然后结束反应；
步骤二、胶体金标记
（1）取10ml胶体金溶液，然后加入20μl 0.2M碳酸钾溶液，混匀；
（2）将gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原和甘氨酸按照1:1:0.5:0.5的量混合（其中，gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原和甘氨酸的总加入量为500μg）；
（3）将步骤（2）混合后的液体一次性加入到步骤（1）中的胶体金溶液中，反应15min；
（4）然后再加入500μl质量浓度为10%甘氨酸，反应30min后反应结束。
步骤三、结合垫的制备
（1）结合垫处理液配方：20mM PBS缓冲液，其中含有0.3%PEG20000；1%的甘氨酸；0.5%的吐温20；0.1%的Proclin300；5%的蔗糖，pH7.4.
（2）将处理液固化在玻纤上，20*30cm规格的玻纤加入45ml结合垫处理液，烘箱烘干6h；
（3）烘干后，存储在湿度小于30%铝箔袋中；
步骤四、喷金
（1）将上述步骤二制备得到的标记好的金溶液，喷在上述步骤三制备得到的结合垫中；
（2）喷量设置为2-4μl/cm，然后放入烘箱烘干2h；
（3）烘干好的金标垫储存于湿度小于30%环境中备用。
步骤五、样本垫的制备
（1）样本垫处理液配方：20mM PBS缓冲液，其中含有1%的BSA，0.5%的吐温20，0.1%的Proclin300，pH7.4；
（2）将处理液固化在玻纤上，20*30cm规格的玻纤加入45ml结合垫处理液，烘箱烘干6h；
（3）烘干后，存储在湿度小于30%铝箔袋中；
步骤六、NC膜包被
（1）取NC膜贴于PVC底板上；
（2）然后将gp140抗原和羊抗鸡IgY抗原，分别用含3%蔗糖的20mM PBS稀释成1mg/ml液体；
（3）将1mg/ml的gp140抗原作为检测线T，将1mg/ml的羊抗鸡IgY抗原作为C，分别固定在NC膜上，固定的量为1μl/cm；
（4）固定好抗体的NC膜放入烘箱中烘干2h；
（5）烘干好的NC膜储存于湿度小于30%环境中备用；
步骤七、试纸条组装
将样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫按层析方向顺次搭接粘贴在底板上，然后裁剪成试纸条。
对比例2：
步骤一、胶体金的制备
（1）在圆底烧瓶中加入90ml超纯水，然后加入1ml质量浓度为2%柠檬酸三钠溶液,1ml的0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和10ml的乙醇，将烧杯放在油浴锅中加热，此时温度设置为50℃加热，转速设置为100rpm；
（2）加热到50℃后，一次性加入2ml质量浓度为2%氯金酸溶液，保持转速在100rpm，温度50℃，1min；
（3）然后将转速调整为150rpm，温度70℃，加热10min，然后结束反应；
（4）此时制备好的胶体金可以恢复室温，等待使用，长期储存保持在2-8℃避光。
步骤二、胶体金标记
（1）取10ml胶体金溶液，然后加入20μl 0.2M碳酸钾溶液，混匀；
（2）然后迅速加入70μg gp41抗原进行反应15min，然后在加入500μlBSA溶液（其中，500μl 含有10%的BSA）；
（3）反应30min后反应结束，获得gp41胶体金保存液，2-8℃避光保存备用；
（4）取10ml胶体金溶液，然后加入10μl 0.2M碳酸钾溶液，混匀；
（5）然后迅速加入70μg gp36抗原进行反应15min，然后在加入500μl 的BSA溶液（其中，500μl 中含有10%的BSA）；
（6）反应30min后反应结束，获得gp36胶体金溶液，2-8℃避光保存备用；
（7）取10ml胶体金溶液，然后加入30μl 0.2M碳酸钾溶液，混匀；
（8）然后迅速加入70μg 鸡IgY抗原进行反应15min，然后在加入500μl 的BSA溶液（其中，500μl 中含有10%的BSA）；
（9）反应30min后反应结束，获得鸡IgY胶体金溶液，2-8℃避光保存备用；
（10）将gp36胶体金溶液、gp41胶体金溶液和鸡IgY胶体金溶液分别按照1:1:0.5进行混合使用。
步骤三、结合垫的制备
（1）结合垫处理液配方：20mM PBS缓冲液，其中含有0.3%PEG20000；1%的甘氨酸；0.5%的吐温20；0.1%的Proclin300；5%的蔗糖，pH7.4；
（2）将处理液固化在玻纤上，20*30cm规格的玻纤加入45ml结合垫处理液，烘箱烘干6h；
（3）烘干后，存储在湿度小于30%铝箔袋中；
步骤四、喷金
（1）将步骤二制备得到的标记好的金溶液，喷在上述步骤三处理的结合垫中；
（2）喷量设置为2-4μl/cm，然后放入烘箱烘干2h；
（3）烘干好的金标垫储存于湿度小于30%环境中备用；
步骤五、样本垫的制备
（1）样本垫处理液配方：20mM PBS缓冲液，其中含有1%的BSA；0.5%的吐温20；0.1%的Proclin300，pH7.4；
（2）将处理液固化在玻纤上，20*30cm规格的玻纤加入45ml结合垫处理液，烘箱烘干6h；
（3）烘干后，存储在湿度小于30%铝箔袋中；
步骤六、NC膜包被
（1）取NC膜贴于PVC底板上；
（2）然后将gp140抗原和羊抗鸡IgY抗原，分别用20mM PBS（其中，含3%蔗糖）稀释成1mg/ml液体；
（3）将1mg/ml的gp140抗原作为检测线T，将1mg/ml的羊抗鸡IgY抗原作为C，分别固定在NC膜上，固定的量为1μl/cm；
（4）固定好抗体的NC膜放入烘箱中烘干2h；
（5）烘干好的NC膜储存于湿度小于30%环境中备用；
步骤七、试纸条组装
将样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫按层析方向顺次搭接粘贴在底板上，然后裁剪成试纸条。
对比例3：
步骤一、胶体金的制备
（1）将1ml质量浓度为1%的氯金酸溶液和99ml超纯水混匀，然后使用加热装置煮至沸腾；
（2）然后迅速加入1ml的质量浓度为2%柠檬酸三钠溶液；
（3）待烧瓶中的液体颜色变化为深紫色，持续加热10min，然后结束反应；
步骤二、胶体金标记
（1）取10ml胶体金溶液，然后加入20μl 0.2M碳酸钾溶液，混匀；
（2）然后迅速加入70μg gp41抗原进行反应15min，然后在加入500μl BSA溶液（其中，500μl 含有10%的BSA）；
（3）反应30min后反应结束，获得gp41胶体金保存液，2-8℃避光保存备用；
（4）取10ml胶体金溶液，然后加入10μl 0.2M碳酸钾溶液，混匀；
（5）然后迅速加入70μg gp36抗原进行反应15min，然后在加入500μl 的BSA溶液（其中，500μl 中含有10%的BSA）；
（6）反应30min后反应结束，获得gp36胶体金溶液，2-8℃避光保存备用；
（7）取10ml胶体金溶液，然后加入30μl 0.2M碳酸钾溶液，混匀；
（8）然后迅速加入70μg 鸡IgY抗原进行反应15min，然后在加入500μl 的BSA溶液（其中，500μl 中含有10%的BSA）；
（9）反应30min后反应结束，获得鸡IgY胶体金溶液，2-8℃避光保存备用；
（10）将gp36胶体金溶液、gp41胶体金溶液和鸡IgY胶体金溶液分别按照1:1:0.5进行混合使用；
步骤三、结合垫的制备
（1）结合垫处理液配方：20mM PBS缓冲液，其中含有0.3%PEG20000，1%的甘氨酸，0.5%的吐温20；0.1%的Proclin300；5%的蔗糖，pH7.4；
（2）将处理液固化在玻纤上，20*30cm规格的玻纤加入45ml结合垫处理液，烘箱烘干6h；
（3）烘干后，存储在湿度小于30%铝箔袋中；
步骤四、喷金
（1）将步骤二制备出来的标记好的金溶液，喷在上述步骤三处理的结合垫中；
（2）喷量设置为2-4μl/cm，然后放入烘箱烘干2h；
（3）烘干好的金标垫储存于湿度小于30%环境中备用；
步骤五、样本垫的制备
（1）样本垫处理液配方：20mM PBS缓冲液，其中含有1%的BSA；0.5%的吐温20；0.1%的Proclin300，pH7.4；
（2）将处理液固化在玻纤上，20*30cm规格的玻纤加入45ml结合垫处理液，烘箱烘干6h；
（3）烘干后，存储在湿度小于30%铝箔袋中；
步骤六、NC膜包被
（1）取NC膜贴于PVC底板上；
（2）然后将gp140抗原和羊抗鸡IgY抗原，分别用20mM PBS（其中，含3%蔗糖的）稀释成1mg/ml液体；
（3）将1mg/ml的gp140抗原作为检测线T，将1mg/ml的羊抗鸡IgY抗原作为C，分别固定在NC膜上，固定的量为1μl/cm；
（4）固定好抗体的NC膜放入烘箱中烘干2h；
（5）烘干好的NC膜储存于湿度小于30%环境中备用；
步骤七、试纸条组装
将样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫按层析方向顺次搭接粘贴在底板上，然后裁剪成试纸条。
对比例4：
本对比例与实施例11的区别之处在于，在制备胶体金标记抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原时，步骤（2）中不加入甘氨酸。
对比例5：
本对比例与实施例11的区别之处在于，在制备胶体金标记抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原时，步骤（4）中不加入甘氨酸。
对比例6：
本对比例与实施例11的区别之处在于，在制备胶体金溶液时，不加入三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。
对比例7：
本对比例与实施例11的区别之处在于，在制备胶体金溶液时，不加入乙醇。
性能检测
1、灵敏度比对
收集HIV血液样本，然后使用体检血浆对齐进行10倍梯度稀释，获得P1-5，5个梯度样本，其中P6为体检血浆，然后对这六份样本进行检测，检测结果如表1所示。
表1 灵敏度检测表
Figure 916317DEST_PATH_IMAGE001
由表1可知，结合实施例11、对比例1，通过对比，与实施例11相比，对比例1制备得到的试剂盒，其灵敏度低了10倍，说明通过对胶体金制备工艺的改进，可以使用低温进行胶体金的制备，通过对转速等的控制，从而对胶体金的均一度和粒径大小进行有效控制，获得非常理想的金颗粒，将胶体金颗粒用在HIV产品的性能测试上，会获得灵敏度更高的产品。
结合实施例11、对比例2，通过对比，与实施例11相比，对比例2制备得到的试剂盒，其灵敏度低了10倍，说明本申请中通过一步法混合标记，不仅大大节约了标记时间和标记步骤，提高了检测灵敏度，极大的增加了显色强度。
结合实施例11、对比例3，通过对比，与实施例11相比，对比例3制备得到的试剂盒，其灵敏度低了100倍，说明本申请中通过对胶体金制备方案、胶体金标记工艺的改进，有效提高了试纸条的灵敏度，极大的增加了显色强度。
结合实施例11、对比例4，对比例4的灵敏度无法测出，说明本申请中将传统的蛋白分别标记，变换成一次性混合标记，通过添加大分子蛋白等物质（比如甘氨酸、BSA、酪蛋白、PVP10、PEG20000、小牛血清），可以起到稳定PH值作用，可以有利于蛋白的标记；有效克服了现有技术中，由于不同蛋白的等电点存在差异，直接将蛋白混合标记会存在死金等无法标记成功的情况。
结合实施例11、对比例5，通过对比，与实施例11相比，对比例5制备得到的试剂盒，其灵敏度低了10倍，说明不加入甘氨酸进行混合时，降低了试纸条的灵敏度。
结合实施例11、对比例6，通过对比，与实施例11相比，对比例6制备得到的试剂盒，其灵敏度低了1000倍，说明三羟甲基氨基甲烷盐酸盐起到缓冲环境作用，防止pH值的剧烈变化导致金颗粒大小不均一，不加入三羟甲基氨基甲烷盐酸盐进行混合时，极大的降低了试纸条的灵敏度。
结合实施例11、对比例7，通过对比，与实施例11相比，对比例7制备得到的试剂盒，其灵敏度低了1000倍，说明本申请中加入调节剂，有效增加了分子之间的活化能，提高了分子之间的碰撞率，提高制金的效率，同时可以降低液体的沸点，有效提高了试纸条的灵敏度。
因此，通过测试发现，通过本申请的方法制备得到的试剂盒，与对比例1-7的技术方案相比，其灵敏度高10-100倍。因此，通过本申请的方法制备得到的试剂盒，具有更优的灵敏度性能。
2、特异性检测
收集100例处于感染3-6周的早期的弱阳性临床样本和200例阴性样本将这300个样本进行顺序打乱，然后编号进行编盲，然后对这300个样本进行试纸条检测，最终检测结果和罗氏结果进行对比，然后按照2x2表对结果进行分析。
表2 实施例11制备得到的试剂盒特异性检测结果
Figure 630195DEST_PATH_IMAGE002
表3 实施例12制备得到的试剂盒特异性检测结果
Figure 271917DEST_PATH_IMAGE003
表4 实施例13制备得到的试剂盒特异性检测结果
Figure 463864DEST_PATH_IMAGE004
表5 实施例14制备得到的试剂盒特异性检测结果
Figure 12657DEST_PATH_IMAGE005
表6 实施例15制备得到的试剂盒特异性检测结果
Figure 428594DEST_PATH_IMAGE006
表7 对比例1制备得到的试剂盒特异性检测结果
Figure 492365DEST_PATH_IMAGE007
表8 对比例2制备得到的试剂盒特异性检测结果
Figure 425686DEST_PATH_IMAGE008
表9 对比例3制备得到的试剂盒特异性检测结果
Figure 891303DEST_PATH_IMAGE009
表10 对比例4制备得到的试剂盒特异性检测结果
Figure 478142DEST_PATH_IMAGE010
表11 对比例5制备得到的试剂盒特异性检测结果
Figure 966892DEST_PATH_IMAGE011
表12 对比例6制备得到的试剂盒特异性检测结果
Figure 500642DEST_PATH_IMAGE012
表13 对比例7制备得到的试剂盒特异性检测结果
Figure 617502DEST_PATH_IMAGE013
结合表2-表6可知，本申请制备得到的试剂盒，其阳性检出率为100%，特异性为100%。
结合表2、表7可知，对比例1制备得到的试剂盒，其阳性检出率为92%，特异性为98.5%；说明通过对胶体金制备工艺的改进，可以使用低温进行胶体金的制备，通过对转速等的控制，从而对胶体金的均一度和粒径大小进行有效控制，从而获得特异性更高的产品。
结合表2、表8可知，对比例2制备得到的试剂盒，其阳性检出率为90%，特异性为98%；说明本申请中通过一步法混合标记，大大节约了标记时间和标记步骤，提高了检测灵敏度，从而获得特异性更高的产品。
结合表2、表9可知，对比例3制备得到的试剂盒，其阳性检出率为82%，特异性为97%；说明本申请中通过对胶体金制备方案、胶体金标记工艺的改进，有效提高了试纸条的灵敏度，从而获得特异性更高的产品。
结合表2、表10可知，对比例4制备得到的试剂盒，其阳性检出率为0%，特异性为100%；说明将传统的蛋白分别标记，变换成一次性混合标记，并且通过添加大分子蛋白等物质，可以起到稳定PH值作用，可以有利于蛋白的标记，从而获得特异性更高的产品。
结合表2、表11可知，对比例5制备得到的试剂盒，其阳性检出率为92%，特异性为97%；说明不加入甘氨酸进行混合时，降低了试纸条的特异性。
结合表2、表12可知，对比例6制备得到的试剂盒，其阳性检出率为69%，特异性为95%，说明不加入三羟甲基氨基甲烷盐酸盐进行混合时，影响了胶体金颗粒大小均一性，从而降低了试纸条的特异性。
结合表2、表13可知，对比例7制备得到的试剂盒，其阳性检出率为72%，特异性为93.5%；说明本申请中加入调节剂，增加了分子之间的活化能，提高了分子之间的碰撞率，提高制金的效率，同时可以降低液体的沸点，从而获得特异性更高的产品。
因此，通过测试发现，通过本申请的方法制备得到的试剂盒，其在检出率上可以达到100%，而对比例制备得到的试剂盒，在弱阳性样本检出率上只有69%，特异性方面，通过本申请的方法制备得到的试剂盒，其特异性也达到100%，而对比例制备得到的试剂盒，在特异性上只有93.5%。因此，本申请的制备得到的试剂盒，其在灵敏度和特异性上明显由于对比例的检测方案。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种病毒抗体检测试纸条的制备方法，所述试纸条包括底板、样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫，所述样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫按层析方向顺次搭接粘贴在底板上，NC膜上包被有检测线和质控线，其特征在于：金标垫上包被有胶体金标记的抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原；
其中，胶体金标记抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原的方法如下：
（1）将胶体金溶液与碳酸钾溶液混合；
（2）将gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原和稳定剂进行混合；
（3）将步骤（2）得到的混合液加入至步骤（1）得到的混合液中进行反应；
（4）加入甘氨酸进行反应，得到胶体金标记的抗gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原。
2.根据权利要求1所述的一种病毒抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤（2）中gp41抗原、gp36抗原、鸡IgY抗原和稳定剂的质量比为（1-2）:（1-2）:（0.5-2）:（0.5-2）。
3.根据权利要求2所述的一种病毒抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤（2）中稳定剂为甘氨酸、BSA、酪蛋白、PVP10、PEG20000、小牛血清中至少一种。
4.根据权利要求1所述的一种病毒抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤（4）中甘氨酸的加入量为500-1000μl。
5.根据权利要求1所述的一种病毒抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤（1）中胶体金溶液的加入量为10-20ml；碳酸钾溶液的加入量为20-40μl。
6.根据权利要求5所述的一种病毒抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤（1）中胶体金溶液的制备工艺如下：
S1、将柠檬酸三钠溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、调节剂混合后，在50-60℃下进行反应；
S2、加入氯金酸溶液，在50-60℃下进行反应；
S3、升温至70-80℃进行反应，得到胶体金。
7.根据权利要求6所述的一种病毒抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤S1中柠檬酸三钠溶液的加入量为1-2ml；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的加入量为1-2ml；调节剂的加入量为10-20ml；步骤S2中氯金酸溶液的加入量为2-3ml。
8.根据权利要求7所述的一种病毒抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤S1中调节剂为乙醇、甲醇、异丙醇中至少一种。
9.根据权利要求6所述的一种病毒抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于：步骤S1、步骤S2中搅拌的转速为100-200rpm；步骤S3中搅拌的转速为150-250rpm。
10.一种试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-9中任一项所述方法制备得到的试纸条。
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