CN1580777A - 胶体金层析法检测血液hiv1/2抗体的试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条及其制备方法。本发明所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条，是在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸而形成的膜条，包被膜有检测区和控制区，检测区包被HIV1/2抗原，控制区包被抗鼠抗体。本发明将艾滋病的特异性抗原gp36，gp41以及gp24引入到HIV1/2抗体快速检测试纸条中，并改进了样品垫的处理，能实现HIV1/2抗体的血液、血浆以及血清检测，提高检测的窗口期，节约样本，减少操作人员劳动强度。
Description
技术领域
本发明属于医学检验领域，特别是涉及一种利用胶体金免疫层析技术检测HIV1/2抗体的试纸条。
背景技术
艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)，又称获得性免疫缺陷综合症，是一类世界范围内严重危害人类健康和生命的病毒性传染性疾病。在不到20年中，已使3000万人受到感染，1000万人失去生命。目前，世界上每天有万余人新感染艾滋病病毒。据统计，至2001年底，我国艾滋病的感染人数为100万左右，现进入快速增长期，根据卫生部的资料，2001年上半年报告的艾滋病病毒感染者数量与上一年相比上升了67.4％。全球的研究结果表明HIV1/2是通过被污染的血液、血液制品、输血或密切个体间接触而传播传染的，在特殊的人群中甚至出现交叉感染的迹象。不但医学界在竭尽全力研究诊断预防治疗艾滋病，各国政府，社会各阶层都纷纷投入到抗击艾滋的运动。但到目前为止，人类还没有找到一种治疗此病的方法。因而早期诊断及时发现感染病人，控制其进一步传播仍然是艾滋病防治的重要手段之一。
近年来，国内外主要采用酶联免疫吸附法(ELISA)、PCR、细胞培养等方法检测HIV1/2抗体或病毒。这些方法都不同程度的存在一些缺点。
如ELISA法操作程序较复杂，易造成假阳性和假阴性，并易造成操作者受害和环境污染，试验时间较长，需要两个小时以上才能得出检测结果。同时必须具备酶标仪和洗板机，这在基层实验室和小型门诊较难达到，且试验受温度等条件限制，给检测带来不便。
分子测试(简称PCR法)其检测时间长，试验步骤繁琐，同时需要使用特殊的仪器和设备，试剂需要冷藏，同时检测费用昂贵，限制了试剂的普及应用。
IFA(荧光免疫检测法)必须具备荧光免疫显微镜和暗室条件，为获得良好的荧光观察效果必须配合合适的滤光片，实验时间需要两个小时，结果检测在荧光显微镜下进行，必须由有经验的专业技术人员判定检测结果。阴性的抗体测试结果不能排除是否感染，需要在超过21天后仍然阴性才能确定没有受到HIV1/2感染。
细胞培养是一种无菌操作技术，要求具备很高的实验工作环境和条件(无菌操作间、超净工作台、操作间等)，需要大量的仪器设备(培养箱、离心机、显微镜等)，需要大量的专业实验器材，实验技术复杂，需要有经验的技术人员操作，且实验周期很长，不适宜疾病的快速检测。
凝聚试验包括明胶颗粒(PA)和乳胶颗粒(LAT)属半定量测定，须多次倍比稀释测定费试剂，且结果重复性差，且灵敏度低。
而免疫金标法技术(Immunochromatography Assay)是上世纪九十年代中期发展起来的，因其快速、操作简便、试剂稳定、可室温储运、不易污染的特点得到广泛的应用。它是免疫亲和技术、印迹技术、免疫标记技术和层析技术的组合。将包被抗体，胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起，制备为免疫层析诊断试条/板，使用时只需要把试纸条下插入样本溶液，数分钟就可以判断结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作更简便、快速，且由于为干试条/试板形式，无需低温保存，储运方便。
目前，免疫胶体金技术在检测HIV1/2抗体的应用上具有如下缺点：
(1)检测局限于血清样本，不是同时实现血液或者血浆的检测。因此对于某些样本溶血或者样本量不够的情况下，由于灵敏度的限制，会出现错检或者漏检。
(2)特异性抗原仅能采用gp36和gp41，检测窗口期长。
(3)检测血清时需要对样本进行处理，整个检测时间长，费时费力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条，将艾滋病的特异性抗原gp36，gp41以及gp24引入到HIV1/2抗体快速检测试纸条中，能实现HIV1/2抗体的血液、血浆以及血清检测，提高检测的窗口期，节约样本，减少操作人员劳动强度，省时省力。
本发明所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条，是在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸而形成的膜条，包被膜有检测区和控制区，检测区包被HIV1/2抗原，控制区包被抗鼠抗体。
所述的样品垫是经过样品垫处理溶液浸制处理的玻璃纤维膜，所述的样品垫处理液为含1％～5％BSA的0.01M PBS溶液，并含0.01％～0.5％PEG和0.01％～0.05％TWEEN-20表面活性剂。
所述的包被膜上，检测区所包被的HIV1/2抗原为HIV1/2的特异性抗原gp36，gp41以及gp24，其来源于商品化的纯化基因工程重组抗原，或者自行制备；控制区所包被的抗鼠抗体，是用纯化的IgG免疫小鼠得到的。
本发明的另一目的在于提供一种胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条的制备方法。
本发明所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条的制备方法，包括以下步骤：
A.抗原的制备：选用纯化的基因工程表达的HIV1/2病毒重组抗原；
B.包被膜的制备：用包被膜缓冲液稀释抗原至浓度为5～20μg/ml，喷印在包被膜上，凉干后在25℃～37℃封闭液中浸泡60分钟，取出后于25℃～37℃烘干2小时，封袋备试纸板贴板用；
C.金标抗原的制备：用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.0～8.0，按9～15μg蛋白/ml胶体金加入HIV1/2gp36，gp41和gp24重组抗原，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀用标记洗涤液洗涤，将沉淀用十分之一初始胶体金的金标抗原保存液溶解，置2℃～8℃备涂覆玻璃纤维膜用；
D.将制备好的金标抗原涂覆在玻璃纤维膜上；
E.样品垫的处理：将样品垫的材料玻璃纤维膜放入样品垫处理溶液中处理；样品垫处理液中含1％～5％BSA的0.01M PBS溶液，并含0.01％～0.5％PEG和0.01％～0.05％TWEEN-20表面活性剂；
F.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。
其中，所述的步骤D中，金标抗原的涂覆方法是：将制备好的金标抗原均匀的铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4～8平方厘米，25℃～40℃干燥16小时，封袋，置2℃～8℃备试纸板贴板用。
将本发明所述的试纸条固定在试剂盒的底板上，合上上盖板，使上盖的加样窗对应试纸条的样品垫，结果显示窗对应检测区和控制区，就成为可检测血液HIV1/2抗体的试剂盒。
与现有的检测试纸条相比较，本发明具有以下优点：
(1)通过对试纸条的改进，首次将艾滋病的特异性抗原gp36，gp41以及gp24引入到检测试纸条中，能实现HIV1/2抗体的快速检测。
(2)对样品垫进行了特殊的预处理，因此在加样血液或血浆时，样品垫能够将样本中血清和血红细胞分离，血红细胞被吸附在样品垫上，血清在毛细作用下继续移动，从而实现检测血液和血浆的功能。
(3)本发明所述的试纸条提高了HIV1/2检测的窗口期，具有高度特异性、灵敏度、检测速度快等优点，节约样本，减少了操作人员劳动强度。
本发明成本低廉，操作简便，在检测时不需要特殊的仪器设备，因此能广泛应用于医院、血站、防疫站、卫生检疫部门、大专院校和科研机构的疾病诊断、流行病学调查和科学研究，特别适用于现场、农村和基层单位使用。这对于控制上述病毒性疾病的流行和传播有着极为重要的意义。
附图说明
图1为本发明的结构示意图；
图2为本发明的检测结果示意图。
具体实施方式
本发明所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条，如图1所示，该试纸条是在底衬1上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜3、包被膜4以及吸水纸5而形成的膜条，包被膜4有检测区6和控制区7，检测区6包被HIV1/2抗原，控制区7包被抗鼠抗体。
在具体实施例中，所采用纯化的HIV1/2病毒基因工程重组抗原gp36，gp41和gp24作为包被抗原，该抗原可以实验室自制，也可以是购自美国亚利斯达生物技术公司(aristabiologicals)的商品化抗原。利用双抗原夹心法原理检测血清中是否含有HIV1/2抗体。当待测样本中含有HIV1/2抗体，抗体先和金标抗原结合，由于层析作用反应复合物沿包被膜向前移动，当遇到包被抗原时，形成抗原-抗体-金标抗原复合物而富集在包被线上，形成紫红色沉淀线，为阳性结果，从而快速诊断HIV1/2患者。
如图2所示，加样后，反应1～2分钟即可看到检测区(T区)6和控制区(C区)7相应的位置上出现紫红色条带，如图2(a)所示，如果C区7和T区6均出现紫红色条带，结果为阳性，说明样品含有HIV1/2抗体；如图2(b)所示，C区7出现紫红色条带，而T区6不出现紫红色条带，结果为阴性，说明样品不含HIV1/2抗体。如果C区7不出现紫红色条带，说明试纸条失效。
本发明所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条的制备方法见以下实施例：
实施例一：
本实施例的制备方法包括以下步骤：
A.抗原制备：购买高纯度的基因工程表达的HIV1/2病毒重组抗原gp36、gp41和gp24。HIV gp36的商品编号为AGHIV-0210，或AGHIV-0215；HIV gp41的商品编号为AGHIV-0220，或AGHIV-0225；HIV gp24的商品编号为AGHIV-0245。
B.抗原包被膜的制备：
包被缓冲液的制备：0.05M pH9.6硫酸盐缓冲液为包被溶液，0.22μ膜过滤后，置2℃～8℃备用，有效期一周。
封闭液的配制：配制0.01M pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)，0.22μ膜过滤后，置2℃～8℃备用，有效期一周。配制封闭工作液：2％BSA，2％脱脂奶，0.01MpH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)，0.22μ膜过滤后，置2℃～8℃备封闭包被膜用，有效期一周。
包被膜制备：调试喷膜机(Bio-Dot)，膜液量为20ul/35cm，用包被缓冲液稀释包被抗原，浓度为5～20μg/ml，机器划线，两线间隔5mm，应细致均匀，室温凉干20分钟。25℃～37℃在封闭液浸泡60分钟，取出后置25℃～37℃烘干处理2小时，封袋备试纸板贴板用。
C.胶体金、胶体金标记抗原的制备
氯金酸的配制：用双蒸水溶解氯金酸，配成1％溶液，置2℃～8℃备用，有效期三天。1000ml 1％氯金酸溶液配方：10g氯金酸溶解于1000ml双蒸水。
柠檬酸三钠的配制：用双蒸水溶解柠檬酸三钠，配成1％溶液，置2℃～8℃备用，有效期三天。1000ml 1％柠檬酸三钠溶液配方：10g柠檬酸三钠溶解于1000ml双蒸水。
0.1M碳酸钾的配制：用双蒸水配制，0.22μ膜过滤，置2℃～8℃备用，有效期一周。1000ml 0.1M碳酸钾溶液配方：13.8g碳酸钾溶解于1000ml双蒸水。
3％PEG-20000的配制：用双蒸水配制，0.22μ膜过滤，置2℃～8℃备用，有效期一周。1000ml 3％PEG溶液配方：30Gpeg-20000溶解于1000ml双蒸水。
标记洗涤液的配制：2％牛血清白蛋白BSA，0.01M pH7.0 PBS溶液，0.22μ膜过滤，置2℃～8℃备用，有效期两周。1000ml标记洗涤液配方：20gBSA溶解于1000ml 0.01M pH7.0 PBS溶液。
金标物保存液的配制：1％牛血清白蛋白BSA，0.5％脱脂奶，5/万叠氮钠NaN3，1％吐温-20(Tween-20)，0.01M pH7.0PBS溶液，0.22μ膜过滤，置2℃～8℃备用，有效期十五天。1000ml金标物保存液配方：10gBSA；5g脱脂奶；1ml Tween-20；0.5g NaN3溶解于1000ml 0.01M pH7.0 PBS溶液。
胶体金的烧制：用双蒸水将1％氯金酸溶液稀释成0.01％，置电炉煮沸，按每100ml 0.01％氯金酸加入4ml 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温补足失水。外观应纯净、透亮，无沉淀和漂浮物。
金标抗原的制备：用0.1M碳酸钾调胶体金pH值至7.0～8.0，按照9～15μg抗体/ml胶体金加入gp36、gp41、gp24重组抗原，混匀，静置30分钟，13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上清，将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标物保存液溶解，置2℃～8℃备涂覆硝酸纤维素膜用，有效期一周。
D.金标抗原的冻干：
将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4～8平方厘米，25℃～40℃干燥16小时，封袋，置2℃～8℃备试纸板贴板用。
E.样品垫的处理：
将样品垫材料玻璃纤维膜放入样品垫处理溶液中处理。
样品垫处理液的配方为：含1％～5％BSA的0.01M PBS溶液，并含0.01％～0.5％PEG和0.01％～0.05％TWEEN-20表面活性剂。
F.试纸板的生产：
金标抗原玻璃纤维膜的裁切：根据滴配实验确定的宽度，将金标抗原玻璃纤维膜进行裁切，置干燥房间备贴板用。
吸水纸的操切：用裁纸机将吸水纸切成35厘米长，4.2厘米宽，置干燥房间备贴板用。
玻璃纤维膜的裁切：将玻璃纤维膜切成35厘米，宽2厘米的长条，置干燥房间备贴板用。
大板的粘贴：按要求把包被膜、吸水纸、金标抗原、玻璃纤维膜粘贴在塑料底板上，组成大板。组装车间温度控制在25℃～30℃，湿度20％～30％。
G.切条
用切条机将大板切成单个人份，每人份宽度按照一定要求2.5mm～4mm，随机抽检，灵敏度能检出室内质控，条带显色程度达到一个“+”号，无非特异性条带，能够通过卫生部质控标准panel。
H.组装、包装
将1人份已切好的试纸条与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，将50人份放入一包装盒，每盒一份说明书。于4-25℃避光保存，不得冻存。
将本发明所述的试纸条固定在试剂盒的底板上，合上上盖板，使上盖的加样窗对应试纸条的样品垫，结果显示窗对应检测区和控制区，就成为可检测血液HIV1/2抗体的试剂盒。
实施例二：
本实施例的制备方法与实施例一基本相同，不同点在于：
步骤B中，包被膜的制备方法是：用包被膜缓冲液稀释抗原至浓度为10μg/ml，喷印在包被膜上，凉干后在25℃～37℃封闭液中浸泡60分钟，取出后于25℃～37℃烘干2小时，封袋备试纸板贴板用。
实施例三：
本实施例的制备方法与实施例一基本相同，不同点在于：
步骤C中，金标抗原的制备方法是：用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.0～8.0，按12μg蛋白/ml胶体金加入HIV1/2gp36，gp41和gp24重组抗原，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀用标记洗涤液洗涤，将沉淀用十分之一初始胶体金的金标抗原保存液溶解，置2℃～8℃备涂覆玻璃纤维膜用。
Claims (7)
1、胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条，其特征在于：该试纸条是在底衬(1)上顺次相互搭接地粘贴样品垫(2)、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜(3)、包被膜(4)以及吸水纸(5)而形成的膜条，包被膜(4)有检测区(6)和控制区(7)，检测区(6)包被HIV1/2抗原，控制区(7)包被抗鼠抗体。
2、根据权利要求1所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条，其特征在于：所述的样品垫(2)是经过样品垫处理溶液浸制处理的玻璃纤维膜，所述的样品垫处理液为含1％～5％BSA的0.01M PBS溶液，并含0.01％～0.5％PEG和0.01％～0.05％TWEEN-20表面活性剂。
3、根据权利要求1所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条，其特征在于：包被的HIV1/2抗原为HIV1/2的特异性抗原gp36，gp41以及gp24，为纯化的基因工程重组抗原。
4、如权利要求1所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.抗原的制备：选用纯化的基因工程表达的HIV1/2病毒重组抗原；
B.包被膜的制备：用包被膜缓冲液稀释抗原至浓度为5～20μg/ml，喷印在包被膜上，凉干后在25℃～37℃封闭液中浸泡60分钟，取出后于25℃～37℃烘干2小时，封袋备试纸板贴板用；
C.金标抗原的制备：用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.0～8.0，按9～15μg蛋白/ml胶体金加入HIV1/2gp36，gp41和gp24重组抗原，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀用标记洗涤液洗涤，将沉淀用十分之一初始胶体金的金标抗原保存液溶解，置2℃～8℃备涂覆玻璃纤维膜用；
D.将制备好的金标抗原涂覆在玻璃纤维膜上；
E.样品垫的处理：将样品垫的材料玻璃纤维膜放入样品垫处理溶液中处理；样品垫处理液中含1％～5％BSA的0.01M PBS溶液，并含0.01％～0.5％PEG和0.01％～0.05％TWEEN-20表面活性剂；
F.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。
5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中，包被膜的制备方法是：用包被膜缓冲液稀释抗原至浓度为10μg/ml，喷印在包被膜上，凉干后在25℃～37℃封闭液中浸泡60分钟，取出后于25℃～37℃烘干2小时，封袋备试纸板贴板用。
6、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤C中，金标抗原的制备方法是：用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.0～8.0，按12μg蛋白/ml胶体金加入HIV1/2gp36，gp41和gp24重组抗原，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀用标记洗涤液洗涤，将沉淀用十分之一初始胶体金的金标抗原保存液溶解，置2℃～8℃备涂覆玻璃纤维膜用。
7、根据权利要求4或5或6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤D中，金标抗原的涂覆方法是：将制备好的金标抗原均匀的铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4～8平方厘米，25℃～40℃干燥16小时，封袋，置2℃～8℃备试纸板贴板用。
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