CN102492041A - Hiv重组融合抗原及其表达基因和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HIV重组融合抗原及其表达基因和制备方法，所述HIV重组融合抗原由SEQ ID NO.1所示氨基酸、连接子以及SEQ ID NO.3所示氨基酸顺次组合构成，所述连接子为6-10个分子量小的、极性且亲水的氨基酸构成。所述HIV重组融合抗原由其表达基因在质粒中构建、诱导表达。所述HIV重组融合融合抗原应用于HIV-1及HI-1抗体检测，能同时检测HIV-1及HIV-2抗体，具有很好的检测灵敏度与特异性。

Description

HIV重组融合抗原及其表达基因和制备方法

技术领域

发明属于医药生物领域，具体是涉及一种HIV重组融合抗原及其表达基因和制备方法。

背景技术

艾滋病(获得性免疫系统缺陷症，AIDS)是当今世界瞩目的严重危害人类健康的病毒性疾病。引起艾滋病的主要病原是人I型和II型免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)。HIV感染者因免疫缺陷程度加深，从无症状携带者发展至严重免疫功能衰竭，导致多种致死性疾病的发展而死亡。根据WHO 2007年全球健康报告显示，截止到2007年底全球HIV感染者估计为3320万例，仅2007年全球新HIV感染者达270万例。在发展中国家，由于经济、文化和教育等多方面的原因，HIV的流行越演越烈，部分国家已失去对疾病流行的控制，而我国也趋于爆发性流行的前期阶段。

HIV基因全长约9.8kb，含有gag、pol、env3个结构基因、2个调节基因(tat反式激活因子、rev毒粒蛋白表达调节子)和4个辅助基因(nef负调控因子、vpr病毒r蛋白、vpu病毒u蛋白和vif毒粒感染性因子)。HIV是一种变异性很强的病毒，各基因的变异程度不同，env基因变异率最高。

根据HIV基因差异，分为HIV-1型和HIV-2型。在HIV-1和HIV-2二型之间，其核苷酸序列只有40-60％的同源性。在HIV-1型内，各亚型之间的基因离散率是20％-35％、同一亚型内的基因离散率是7％-20％。

目前全球流行的主要是HIV-1，根据编码包膜蛋白的env基因和编码壳蛋白的gag基因序列的同源性，HIV-1型又进一步分为3个组，M亚型组(main即主要组)、O亚型组(outline即外围组)和N亚型组(new，or non-M，non-O新组或非M非O组)，其中M组有A，B，C，D，E，F，G，H，I，J，K11个亚型。此外，近年来发现多个流行重组型。O组是1990年从喀麦隆和加蓬分离到的，与M组其他亚型的氨基酸序列只有50％的同源性。N组是最近才从两名喀麦隆病人分离到的，在系统树上，既不属于M组，也不属于O组的一组新病毒，故称N组。

HIV-2的生物学特性与HIV-1相似，但其传染性较低，引起的艾滋病临床进展较慢，症状较轻。HIV-2型至少有A，B，C，D，E，F，G7个亚型。

我国以HIV-1为主要流行株，已发现的有A、B(欧美B)、B’(泰国B)、C、D、E、F和G8个亚型，还有不同流行重组型。1999年起在部分地区发现并证实我国有少数HIV-2型感染者。及时发现并鉴定HIV各种亚型对于追踪流行趋势、及时做出诊断、开发新的诊断试剂和新药研制、疫苗开发均具有重要意义。

HIV感染的实验室检测在HIV感染的诊断、疾病进展的监测、抗病毒疗效观察和耐药性监测中至关重要，对疾病流行的控制也有重大意义。HIV的诊断分筛查阶段和确认试验，各种诊断试剂主要是用免疫方法检测血清或体液中的HIV特异的抗体如gp41或gp36抗体和HIV-1的P24抗原。

现在对HIV的检测方法主要是使用血清学方法，用酶联免疫吸附实验ELISA检测病人血清中的HIV抗体进行初筛，再用免疫印迹实验进行确认，核酸检测作为一种补充，在诊断HIV阳性母亲所生婴儿和处于HIV抗体窗口期的感染者发挥重要作用，但由于HIV的高度变异性，各亚型的抗原决定簇部位刺激机体产生特异性抗体可有一定差异，可以产生不同的抗原抗体反应，有报道表明，O组的HIV感染者血清与现有的HIV诊断试剂反应很弱出现很多假阴性结果，法国巴斯德研究所L.Montagnier也报道他们的一例1990年感染1992年死亡的O组HIV引起的艾滋病病例，正是由于用常规试剂难于检出而造成。虽然O亚型在最近几年通过向抗体检测初筛试剂和确认试剂中加入合成肽，HIV-1的O组可被检测出来，但其敏感性仍有待进一步的观察，因为HIV任何变异所造成的抗原结构细微改变都可能影响其敏感性。同时，由于现有的无论是血清学检测试剂还是核酸检测试剂都是以流行于欧美的B亚型病毒株为基础的，其对非B亚型毒株检测的敏感性有待进一步证实，有研究报道表明，在抗体阳转期间，应用取自B亚型抗原的抗体检测初筛试剂盒可发现在检测非B亚型时敏感性较低。并且，目前所用的几种用于检测核酸的试剂盒，在检测非B亚型HIV-1感染者时，或者不能检测，或者不能正确定量病毒量。对HIV-2型和HIV-1的0组尚不能定量检测其病毒RNA。因此，提高现有检测试剂盒检测各亚型的敏感性和研制能定量检测HIV-2型和HIV-1型中的O组病毒的试剂盒应是当务之急。

HIV抗体检测是HIV感染诊断的主要方法。HIV抗体检测经多年的发展，现已发展成多种成熟的检测系统与技术如ELSIA HIV抗体检测技术及免疫层析技术等。1990年，第二代ELSIA试剂应运而生，该试剂使用基因工程方法得到重组抗原和合成肽包被反应板，由于纯化抗原的使用，HIV抗体检测的特异性有了很大的提高。后在此基础上发展了第三代、第四代产品。其他HIV抗体检测方法也迅速发展。而这些技术的应用的关键还是HIV特意性抗原的开发与研制生产。因此，HIV抗体检测相关重组抗原的研发具有重要的意义。

早在二十世纪八十年代末，国外就有不少文献报道重组HIV抗原的研发并将其应用于ELISA等技术检测HIV抗体。早期的重组HIV抗原经过不断改进，目前在检测的灵敏度与特异性上都有很大的改进。HIV抗体检测ELISA第四代试剂于1998年在欧洲注册使用。第四代试剂在第三代的基础上进一步增加了p24抗原的检测，把HIV抗原和抗p24的抗体同时包被在反应板，同时检测血清中的HIV抗体和p24抗原，进一步缩短窗口期。与第三代试剂相比，第四代试剂检测窗口期大约平均缩短了4-5天。随着对感染者和艾滋病患者抗逆转录病毒治疗的进展，以及对无症状HIV感染者提供资源咨询检测的迫切需求，HIV检测试剂，一方面朝着提高灵敏度、高特异性，缩短窗口期的方向发展，另一方面，朝着简便快速方向发展。目前已有PA((明胶颗粒凝集实验)、Determine、斑点印迹(dot immunoassay)免疫层析等简便快速方法。现发展的艾滋病唾液检测卡及艾滋尿液抗体检测，不需要艾滋抗体检测的抽血步骤，在样本要求上不再依赖于血清，降低采血过程中交叉污染的可能性，更加方便家庭HIV抗体的筛查。以唾液为标本测定HIV抗体的EIA、WB试剂已获得美国FDA批准，国内尚无销售。1996年美国FDA首次批准HIV-1尿检EIA试剂，我国也在研制。主要适用于静脉注射品(IDUs)人群和其他高危人群的大面积流行病学调查。阳性标本仍需采血做确认试验才能确认HIV抗体阳性。

为顺应高灵敏度、高特异性的HIV抗体检测试剂的发展，重组HIV抗原生物原材料的研发也在不断发展。研发应用于HIV抗体检测的重组抗原有病毒多聚酶蛋白p66、p51；病毒颗粒蛋白p17、p24及病毒包膜蛋白gp120和gp41。利用重组产生的gp41作为抗原检测抗HIV抗体的尝试已被描述。不幸的是，HIV-1gp41和HIV-2gp36在生理缓冲条件下基本上是不溶的。利用特别高或低的pH值是在溶液中保持gp41或gp36的溶解状态的一个途径。重组产生的gp41已知在pH 3.0周围一下，或在pH 11.0周围以上是可溶的。一般来说，免疫测试是在生理pH下进行的。这就使得重组HIV gp41抗原应用于抗体检测的应用特别是特异性与灵敏度受到了一定的限制。

由于gp41或gp36高度的疏水性，重组表达的抗原一般都以包涵体形式表达，且包涵体需要pH 11.0周围以上才具有可溶性，这样给后续的纯化及复性带来极大的困难。且对重组抗原应用于免疫抗体检测也造成了许多的限制。且单独的gp41或gp36重组抗原只能单独检测HIV-1或HIV-2抗体，不能同时检测HIV-1及HIV-2型。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种可以同时检测HIV-1及HIV-2型的重组融合抗原。

解决上述技术问题的技术方案如下：

一种HIV重组融合抗原，其由SEQ ID NO.1所示氨基酸、连接子以及SEQ IDNO.3所示氨基酸顺次组合构成，所述连接子为6-10个分子量小的、极性且亲水的氨基酸构成。

优选地，所示连接子的氨基酸组成如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一目的是提供编码上述HIV重组融合抗原的表达基因。

解决上述技术问题的技术方案如下：

一种编码上述HIV重组融合抗原的表达基因，包括a：其核苷酸序列由SEQID NO.4和编码连接子的碱基序列和SEQ ID NO.6所组成；b：与a的核苷酸序列编码相相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与a的核苷酸序列不同的序列；c：对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

优选地，所述编码连接子的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明另一发明目的是提供上述HIV重组融合抗原的制备方法。

实现该目的的技术方案如下：

上述HIV重组融合抗原的制备方法，其步骤如下：

(1)将上述编码融合抗原的表达基因序列合成，克隆连入pMD18-T simpleVector载体，得到含目的基因的T载体；

(2)T载体经BamH I和HindIII双酶切，酶切产物纯化回收，与经BamH I和HindIII酶切过的质粒pET-28a连接；

(3)热激法将连接产物转化感受态大肠杆菌E.coli DH5α株，涂布于含34-55μg/ml Kan的LB平板，筛选得到阳性质粒；

(4)重组蛋白表达工程菌株的构建与诱导表达：采用CaCl₂将测序正确的阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养；挑取单菌落接种至含34-55μg/ml Kan的5mL LB液体培养基中，37℃，震荡培养过夜；次日，转接于新鲜LB培养基中，37℃，震荡培养至OD600值约为0.6时加入IPTG至终浓度1.0mM，诱导培养3-4h，SDS-PAGE检测重组蛋白的表达，得到HIV重组融合抗原。

优选地，所述制备方法还包括对HIV重组融合抗原的纯化：将包涵体形式的HIV重组融合抗原在0.5％-1％的中性去垢剂用脲素梯度反复多次洗涤初步纯化，变性溶解，利用金属螯合层析法亲和层析。更优选地，所述溶解液为：PH8.0，20mM Tris，1％tween-20，8M脲。

本发明旨在研发一种重组融合的gp41+gp36蛋白，可同时检测HIV-1及HIV-2抗体，优选出此两个蛋白的保守免疫优势表位，具有很好的检测灵敏度，可检测HIV-1病毒B亚型及其非B亚型病毒株，同时可以检测HIV-2型病毒。此外，此融合抗原在设计上，经过对HIV-1gp41蛋白的疏水氨基酸进行改造用以提高抗原的亲水性而不损害抗原性，提高此抗原的亲水性，同时融合抗原在设计过程中利用9-12个亲水的氨基酸作为链接子也极大的提高了此融合抗原的亲水性。本发明制备的重组抗原在pH8.0条件下具有很好的可溶性，从而克服了重组HIV抗原由于溶解性差而在免疫检测中使用受限的缺点。同时，此发明了公布了此种重组抗原的制备方法：采用化学合成的方法得到设计抗原的基因片段，且对基因的遗传密码进行改造，优化基因结构，合成大肠杆菌偏爱密码子，然后将合成优化的基因片段克隆入pET-28a表达载体中，构建表达载体。融合抗原在大肠杆菌中得到高效表达，表达蛋白在pH8.0具有很好的可溶性，利用亲和层析层析技术纯化，SDS-PAGE检测纯度大于95％，利用分步稀释的方法进行复性得到活性良好的复性蛋白。制备的融合抗原应用于HIV-1及HI-1抗体检测能同时检测HIV-1及HIV-2抗体，具有很好的检测灵敏度与特异性，为开发优良的HIV抗体快速检测试剂奠定基础。

附图说明

图1：实施例2中重组抗原表达鉴定图；

图2：实施例2中重组抗原纯化电泳鉴定图；

图3：实施例3中重组抗原表达鉴定图；

图4：实施例3中重组抗原纯化电泳鉴定图。

具体实施方式

实施例1

融合抗原的设计

对众多的传染性疾病而言，病原体上的相应抗原表位成为研制特异诊断试剂和疫苗的靶标。HIV感染也不例外，其gp41蛋白即是重要的检测靶标。gp41是HIV-1的跨膜糖蛋白，直接介导HIV与细胞膜的融合，在HIV感染细胞的过程中发挥重要的作用。gp41还具有中和表位和免疫优势结构域，可诱发中和抗体和机体早而强的抗体反应。在本发明中，通过分析设计，HIV-1gp41选取HIV标准病毒株HXB2病毒株中的优势表位：536aa-684aa，其对应的氨基酸序列为：tltvq arqllsgivq qqnnllraie aqqhllqltv wgikqlqari laverylkdq qllgiwgcsgklicttavpw naswsnksle qiwnhttwme wdreinnyts lihslieesq nqqekneqel leldkwaslwnwfnitnwlw yikl

由于此序列疏水性较强，对此序列进行改造，通过生物信息学技术设计，改造包括主要将前端四个疏水氨基酸替换为亲水的氨基酸包括555aa位(L，T)，566aa位(L，T)，573aa位(I，E)，580aa(I，T)的置换，突变改造前后对比的氨基酸序列为：tltvqarqllsgivq qqnnl(T)lraie aqqhll(T)qltv wgi(E)kqlqari(T)laverylkdq qllgiwgcsgklicttavpw naswsnksle qiwnhttwme wdreinnyts lihslieesq nqqekneqelleldkwaslw nwfnitnwlw yikl

选取的表位突变后对应的基因序列为：

ACA CTG ACA GTA CAG GCC CGT CAA TTA TTG TCT GGT ATC GTGCAG CAG CAG AAC AAT ACC CTG CGT GCT ATT GAG GCG CAA CAG CATCTG ACC CAA CTC ACA GTC TGG GGC GAA AAG CAG CTC CAG GCACGT ACC CTG GCT GTG GAA CGT TAC CTG AAG GAT CAA CAG CTC CTGGGC ATT TGG GGT TGC TCT GGT AAA CTC ATT TGC ACC ACT GCT GTGCCT TGG AAT GCT AGT TGG AGT AAT AAA TCT CTG GAA CAG ATT TGGAAT CAC ACC ACC TGG ATG GAG TGG GAC CGT GAA ATT AAC AATTAC ACA AGT TTA ATC CAC TCC TTA ATT GAA GAA TCG CAA AAC CAGCAA GAA AAG AAT GAA CAA GAA TTA TTG GAA TTA GAT AAA TGGGCA AGT TTG TGG AAT TGG TTT AAC ATC ACA AAT TGG CTG TGG TATATC AAA TTA。

gp36选取优HIV-2标准株ROD2的优势表位527aa-679aa，其对应的氨基酸序列为：

SSAMGAASLTVSAQSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCHTTVPWVND SLAPDWDNMTWQEWEKQVRYLEANISKSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDIFGNWFDLTSWVKYIQY

其基因序列，碱基组成为：

Agcagcgcgatgggcgcggcgagcctgaccgtgagcgcgcagagccgcaccctgctggcgggcattgtgcagcagcagcagcagctgctggatgtggtgaaacgccagcaggaactgctgcgcctgaccgtgtggggcaccaaaaacctgcaggcgcgcgtgaccgcgattgaaaaatatctgcaggatcaggcgcgcctgaacagctggggctgcgcgtttcgccaggtgtgccataccaccgtgccgtgggtgaacgatagcctggcgccggattgggataacatgacctggcaggaatgggaaaaacaggtgcgctatctggaagcgaacattagcaaaagcctggaacaggcgcagattcagcaggaaaaaaacatgtatgaactgcagaaactgaacagctgggatatttttggcaactggtttgatctgaccagctgggtgaaatatattcagtat

两个抗原通过链接子序列连接子连接，链接子由亲水的氨基酸残基构成，从而提高重组融合抗原的可溶性，连接子的尺寸便于保守N和C间的天然构象。连接子具有整体的亲水性，没有或只有微弱的免疫原性：优选小的、极性的及亲水的残基，例如GSGGSG，GSGGSGG GSGGSGGG，GGGGSGGG，GGGGSGGGGSGGGG，最优选的连接子设计的氨基酸序列为：GGGGSGGGG，其对应的基因序列为：Ggcggcggcggcagcggcggcggcggc。

本实施例所构建的整个HIV重组融合抗原的氨基酸序列为：

Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn ThrLeu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Thr Gln Leu Thr Val Trp Gly Glu Lys GlnLeu Gln Ala Arg Thr Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly IleTrp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp SerAsn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn His Thr Thr Trp MET Glu Trp Asp Arg Glu IleAsn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu LysAsn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn IleThr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Leu(SEQ ID NO.1)Gly Gly Gly Gly Ser GlyGly Gly Gly(SEQ ID NO.2)Ser Ser Ala MET Gly Ala Ala Ser Leu Thr Val Ser Ala Gln Ser Arg Thr Leu Leu Ala Gly IleVal Gln Gln Gln Gln Gln Leu Leu Asp Val Val Lys Arg Gln Gln Glu Leu Leu Arg LeuThr Val Trp Gly Thr Lys Asn Leu Gln Ala Arg Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu GlnAsp Gln Ala Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His Thr Thr ValPro Trp Val Asn Asp Ser Leu Ala Pro Asp Trp Asp Asn MET Thr Trp Gln Glu Trp GluLys Gln Val Arg Tyr Leu Glu Ala Asn Ile Ser Lys Ser Leu Glu Gln Ala Gln Ile GlnGln Glu Lys Asn MET Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asn Ser Trp Asp Ile Phe Gly Asn TrpPhe Asp Leu Thr Ser Trp Val Lys Tyr Ile Gln Tyr(SEQ ID NO.3)

对应以上表位且经遗传密码优化的构建上述融合抗原的编码基因序列为：

Accctgaccgtgcaggcgcgccagctgctgagcggcattgtgcagcagcagaacaacaccctgcgcgcgattgaagcgcagcagcatctgacccagctgaccgtgtggggcgaaaaacagctgcaggcgcgcaccctggcggtggaacgctatctgaaagatcagcagctgctgggcatttggggctgcagcggcaaactgatttgcaccaccgcggtgccgtggaacgcgagctggagcaacaaaagcctggaacagatttggaaccataccacctggatggaatgggatcgcgaaattaacaactataccagcctgattcatagcctgattgaagaaagccagaaccagcaggaaaaaaacgaacaggaactgctggaactggataaatgggcgagcctgtggaactggtttaacattaccaactggctgtggtatattaaactg(SEQ ID NO.4)Ggcggcggcggcagcggcggcggcggc(SEQ ID NO.5)

Agcagcgcgatgggcgcggcgagcctgaccgtgagcgcgcagagccgcaccctgctggcgggcattgtgcagcagcagcagcagctgctggatgtggtgaaacgccagcaggaactgctgcgcctgaccgtgtggggcaccaaaaacctgcaggcgcgcgtgaccgcgattgaaaaatatctgcaggatcaggcgcgcctgaacagctggggctgcgcgtttcgccaggtgtgccataccaccgtgccgtgggtgaacgatagcctggcgccggattgggataacatgacctggcaggaatgggaaaaacaggtgcgctatctggaagcgaacattagcaaaagcctggaacaggcgcagattcagcaggaaaaaaacatgtatgaactgcagaaactgaacagctgggatatttttggcaactggtttgatctgaccagctgggtgaaatatattcagtat(SEQ IDNO.6).

以上优化的整一条编码融合抗原的表达基因序列采用化学合成的方法得到，合成的基因序列连入T载体中用于后续扩增克隆。

实施例2重组抗原原核表达载体的构建

目的基因采用化学合成的方法合成，克隆连入pMD18-T simple Vector载体，得到含目的基因的T载体(invitrogen公司提供)，经BamH I和HindIII 37℃双酶切4-5小时，酶切产物纯化回收，各取6μl与经同样酶酶切过的质粒pET-28a，22℃连接1h。热激法将连接产物转化感受态大肠杆菌E.coli DH5α株，涂布于含34μg/ml Kan的LB平板，挑取阳性克隆经菌落PCR和酶切初步鉴定后送测序，测序结果证明表达载体构建序列与设计基因序列一致(如SEQ ID NO.4+SEQID NO.5+SEQ ID NO.6所示)。鉴定正确后得到重组表达载体(阳性质粒)命名为pET-28a-OLM。

1.2.3重组蛋白表达工程菌株的构建与诱导表达

采用CaCl₂将测序正确的阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，37℃培养16h。挑取单菌落接种至含50μg/ml Kan的5mL LB液体培养基中，37℃，200r/min培养过夜。次日，以1∶100比例转接于5mL新鲜LB培养基中，37℃，200r/min培养至OD₆₀₀值约为0.6时加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度1.0mM，诱导培养3-4h，SDS-PAGE检测重组蛋白的表达，本发明中设计的抗原在大肠杆菌中得到高效表达，表达蛋白两端带组氨酸标签，蛋白分子量约为37KDa，表达形式主要为包涵体形式。筛选高效表达的重组菌株构建表达工程菌株。图1为重组抗原表达鉴定图，其中，泳道1：表达菌体裂解沉淀；泳道2：表达上清；泳道3：未经诱导的表达菌；泳道4：蛋白Marker。从图上可以看出，重组蛋白在大肠杆菌中得到很好的表达，主要的表达形式为包涵体形式。

1.2.4抗原的纯化

表达的包涵体在0.8％-1％(体积比)的中性去垢剂，如tween-20，TritonX-100，或NP40等加EDTA和还原剂DTT，B-巯基乙醇等用脲素梯度(4M脲-2M脲-1M脲-0M脲)反复多次洗涤初步纯化之后，由于融合抗原经改造，亲水性得到极大提高，包涵体在pH8.0-pH9.0范围含8M脲变性剂条件下可以得到很好的变性溶解。本发明优选包涵体的溶解液为：20mM Tris(PH8.0)，1％tween-20(体积比)，8M脲。根据抗原的性质，以及设计时所带的标签，首选金属螯合层析方法，经一步亲和层析的重组抗原纯度达到95％以上。重组抗原优选的纯化方案为：

NI柱纯化

介质：ni Sepharose 6ff(金属镍螯合琼脂糖凝胶)

bufferA：20mM Tris-Cl，pH8.0，8M脲素，20mM咪唑，0.1mM PMSF；

bufferB：20mM Tris-cl，pH8.0，8M脲素，0.5M咪唑，0.1mM PMSF

平衡buffer：bufferA

洗脱：bufferB，纯化上样过程中样品添加终浓度为20mM咪唑并校正pH至pH8.0；

抗原纯化鉴定如图2所示，其中，泳道1：蛋白Marker；泳道2：初步洗涤纯化经溶解的包涵体蛋白；泳道3：亲和纯化流穿样品；泳道4：纯化目的蛋白。

1.2.5抗原的复性与ELISA活性鉴定

纯化的抗原采用稀释复性的方法进行复性，优选的抗原复性体系为：20mMTris-Cl，pH8.0，2mM EDTA，5％蔗糖(质量百分比)，0.1％tween-20(体积百分比)，0.02％NaN₃(质量百分比)。优选的稀释复性方案如下：

A、在4℃条件下，溶解的包涵体抗原用变性液(20mM Tris(PH8.0)，1％tween-20，8M脲)稀释至1mg/ml；B、变性的包涵体以1∶10缓慢滴加入复性液(20mM Tris-Cl，pH8.0，2mM EDTA，5％蔗糖，0.1％tween-20，0.02％NaN₃)中，边加入包涵体蛋白搅拌搅拌，复性蛋白的终浓度约为100-200ug/ml；C、4度放置5h以上；D、每隔5-12h可重新往复性液中以1∶10比例加入变性蛋白，继续4度复性，如此可重复2-3次。复性蛋白用PEG20000浓缩至3mg/ml的浓度。

复性浓缩的蛋白用间接ELISA的方法鉴定抗原的活性，活性鉴定结果如表1：

从以上结果可以看出，重组抗原经复性之后具有很好的抗原活性。

1.2.6抗原稳定性研究

考虑到该抗原属于生物活性大分子，较容易受到外体系降解，和自身蛋白周期的降解。本组进行了温度试验；pH试验；共存分子辅助稳定性试验和氧化-还原体系Buffer试验等。经组合试验寻找一种Buffer体系尽最大程度保存蛋白性质的稳定，在该体系下，进一步增加时间稳定试验。优选的蛋白稳定保存体系(保存液)为：20mM Tris-Cl，pH8.0，2mM EDTA，5％蔗糖，0.1％tween-20，0.02％NaN₃，该体系下，重组抗原在4℃保存一个月的稳定，-20℃条件下能保存半年以上。

1.2.7重组抗原在胶体金产品工艺中的应用及评价

上述制备的HIV重组融合抗原用胶体金进行标记，按照现有技术中的常规的HIV胶体金试纸条的制备方法，重组融合抗原以20ug/ml的浓度以胶体金进行标记，该重组融合抗原的包被浓度为1.5mg/ml，制作快速胶体金检测试纸条，使用双抗原夹心法检测临床样本中HIV-1及HIV-2抗体。使用广州万孚生物技术有限公司的人类免疫缺陷病毒抗体(HIV1/2)诊断试剂盒(胶体金法)产品质控品及国际BBI盘(Company Name：Boston Biomedica Inc.，Anti-HIV1/2combo performance panel)对制作的试纸条灵敏度进行评价，试纸条灵敏度达到本公司原有产品及市场对照产品要求；经国际BBI盘检测，使用此重组抗原制备的快速检测试纸条能同时检测HIV-1及HIV-2抗体，且能检测HIV-1M组B亚型及非B型样本。检测广西CDC收集的临床阳性血清标本共530例，全部检出，灵敏度为100％，参见表1。同时搜集1000份临床确诊的阴性样品(来源于广东药学院附属第一医院及广州华侨医院)本对试纸条的特异性性能进行评价，出现两份C9假阳，特异性为99.8％，比对照产品人类免疫缺陷病毒抗体(HIV1/2)诊断试剂盒(胶体金法)(出现5例假阳性)的特异性略高极小一点。参见表2

表1：临床阳性检测结果检测结果

广西CDC收集的临床阳性血清标本共530例，统计阳性显色深度，如下表：

注：C1-C9为试纸条的显色度，C1最深，C9最浅。

表2：特异性检测结果

实施例3

本发明的HTV的融合抗原的构成与实施例1基本相同，不同是连接子为GSGGSGG，其碱基序列组成为ggcagcggcggcagcggcggc(SEQ ID NO.7)。

3.1本实施所述的HTV的融合抗原的制备步骤(包括纯化和复性)如实施例2。通过亲和层析方法纯化的重组抗原纯度达到90％。

图3为本实施例所述重组抗原表达鉴定图；泳道1：蛋白Marker；泳道2：表达菌体裂解沉淀；泳道3：表达菌体裂解上清；泳道4：未诱导表达的对照菌。图4为本实施例中重组抗原纯化电泳鉴定图，其中，泳道1纯化的重组蛋白；泳道2：蛋白Marker。

3.2用蛋白稳定保存体系为：20mM Tris-Cl，pH8.0，2mM EDTA，5％蔗糖，0.1％tween-20，0.02％NaN₃该体系下，本实施例所述的重组抗原在4℃保存一个月的稳定，-20℃条件下能保存半年以上。

3.3经过复性浓缩的蛋白用间接ELISA的方法鉴定抗原的活性，活性鉴定结果如表2：

3.4重组抗原在胶体金产品工艺中的应用及评价

采用本实施例得到的HIV重组融合抗原进行胶体金进行标记，按照现有技术中的常规的HIV胶体金试纸条的制备方法，重组融合抗原以20ug/ml的浓度以胶体金进行标记，该重组融合抗原的包被浓度为1.5mg/ml，制作快速胶体金检测试纸条，使用双抗原夹心法检测临床样本中HIV-1及HIV-2抗体。使用广州万孚生物技术有限公司的人类免疫缺陷病毒抗体(HIV1/2)诊断试剂盒(胶体金法)产品质控品及国际BBI盘(Company Name：Boston Biomedica Inc.，Anti-HIV1/2 combo performance panel)对制作的试纸条灵敏度进行评价，使用广州万孚生物技术有限公司原有已经上市人类免疫缺陷病毒抗体(HIV1/2)诊断试剂盒(胶体金法)产品作为对照试剂，评价本发明融合抗原制备的试纸条灵敏度；灵敏度质控品显色与对照产品一致；检测广西CDC收集的临床阳性血清标本共530例，全部检出，灵敏度为100％；经国际BBI盘检测，使用此重组抗原制备的快速检测试纸条能同时检测HIV-1及HIV-2抗体，且能检测HIV-1 M组B亚型及非B型样本，同比条件下比本公司原有产品显色要深。同时搜集两家不同医院的1000份临床确诊血清阴性样本(来源于广东药学院附属第一医院及广州华侨医院)对试纸条的特异性性能进行评价(如实施例2)，出现3份C9假阳，特异性为99.7％，具体见表3：

表3：

以上仅为本发明的具体实施例，并不以此限定本发明的保护范围；在不违反本发明构思的基础上所作的任何替换与改进，均属本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种HIV重组融合抗原，其特征是，其由SEQ ID NO.1所示氨基酸、连接子以及SEQ ID NO.3所示氨基酸顺次组合构成，所述连接子为6-10个分子量小的、极性且亲水的氨基酸构成。

2.根据权利要求1所述的HIV重组融合抗原，其特征是，所示连接子的氨基酸组成如SEQ ID NO.2所示。

3.一种编码权利要求1所示的HIV重组融合抗原的表达基因，其特征是，包括a：其核苷酸序列由SEQ ID NO.4和编码连接子的碱基序列和SEQ ID NO.6所组成；b：与a的核苷酸序列编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与a的核苷酸序列不同的序列；C：对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的表达基因，其特征是，所述编码连接子的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

5.一种权利要求1所述HIV重组融合抗原的制备方法，其特征是，其步骤如下：

(1)将权利要求3所述编码融合抗原的表达基因序列合成，克隆连入pMD18-T simple Vector载体，得到含目的基因的T载体；

(2)T载体经BamH I和HindIII双酶切，酶切产物纯化回收，与经BamH I和HindIII酶切过的质粒pET-28a连接；

(3)热激法将连接产物转化感受态大肠杆菌E.coli DH5α株，涂布于含34-55μg/ml Kan的LB平板，筛选得到阳性质粒；

(4)重组蛋白表达工程菌株的构建与诱导表达：采用CaCl₂将测序正确的阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养；挑取单菌落接种至含34-55μg/ml Kan的5mL LB液体培养基中，37℃，震荡培养过夜；次日，转接于新鲜LB培养基中，37℃，震荡培养至OD₆₀₀值约为0.6时加入IPTG至终浓度1.0mM，诱导培养3-4h，SDS-PAGE检测重组蛋白的表达，得到HIV重组融合抗原。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是，所述制备方法还包括对HIV重组融合抗原的纯化：将包涵体形式的HIV重组融合抗原在0.5％-1％的中性去垢剂用脲素梯度反复多次洗涤初步纯化，变性溶解，利用金属螯合层析法亲和层析。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是，所述溶解液为：pH8.0，20mM Tris，1％tween-20，8M脲。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是，对纯化后的HIV重组融合抗原进行复性，复性液包括有：20mM Tris-Cl，pH8.0，2mMEDTA，5％蔗糖，0.1％tween-20，0.02％NaN₃。

9.根据权利要求5-8任一项所述的制备方法，其特征是，所述HIV重组融合抗原的保存液包括有：20mM Tris-Cl，pH8.0，2mM EDTA，5％蔗糖，0.1％tween-20，0.02％NaN₃。

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