CN101893629A - 一种torch筛查试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于体外诊断试剂领域,公开了一种TORCH筛查试纸条及其制备方法。本发明TORCH筛查试纸条,包括试纸条底衬(1),以及试纸条底衬(1)上顺次相互搭接粘贴的样品垫(2)、涂覆有色颗粒标记抗原的玻璃纤维膜(3)、包被膜(4)及吸水纸(5),包被膜(4)设有检测区(6)和控制区(7),有色颗粒标记抗原为有色颗粒标记的TORCH相关抗原,检测区(6)包被抗人免疫球蛋白抗体,控制区(7)包被抗有色颗粒标记TORCH抗原的抗体。本发明试纸条用胶体金标记ToRCH相关抗原,不受血清等标本中的无关IgG和IgM干扰,较之现有的TORCH试纸条具有更高的特异性和敏感性。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断试剂领域,涉及一种TORCH筛查试纸条及其制备方法,具体涉及利用,免疫层析技术检测全血、血清或血浆中TORCH抗体水平的试纸条及其制备方法。
背景技术
我国人口出生缺陷形势严峻。根据我国1987年进行的残疾人抽样调查结果推算:全国有5100多万残疾人,2200多万遗传病患者,其中相当大部分致残原因是出生缺陷,残疾人占全国总人口的4.9%。1995年全国残疾人数增加到6000万人,连同遗传缺陷患者计占全国总人口的6.3%。按我国每年出生人口2,000万计,其中就有10~30万肉眼可见的出生缺陷,加上出生数月及数年才显现出来的缺陷,每年新增先天性残疾儿童高达80多万,占4%。因此,出生缺陷的问题必须引起举国上下的高度重视。
过去认为在妇女孕前和孕期能够引起宫内和胎儿感染的微生物主要有弓形体(Toxoplasma gondii,Toxo)病毒、风疹病毒(Rubella Virus,RV)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)、单纯疱疹I型和II型病毒(Herpes Simplex Virus,HSV)五种,他们对优生优育的危害比较严重。1971年Nalmias特就这几个微生物英文名称的第一个字母撰造出“ToRCH”一词,To代表弓形体;R代表风疹病毒;C代表巨细胞病毒;H代表单纯疱疹I型和II型病毒。ToRCH感染在围产医学中称之为“ToRCH综合症”,而在孕前和孕期对ToRCH的检测则称之为“ToRCH筛查”。
随着医学科学技术的发展,目前ToRCH筛查的内容有了一些新的变化,集中地反映在“国人口发[2007]85号”文件的附件2《孕前常见病原体抗体实验室筛查技术指导(试行)》中。其主要内容摘要如下:
建议育龄妇女应在孕前半年筛查风疹病毒IgG抗体,风疹病毒IgG抗体阳性者说明已经具备免疫力,不需要再做风疹病毒抗体相关检测,也不需要注射风疹病毒疫苗;风疹病毒IgG抗体阴性的待孕妇女建议到具备资质的机构接种风疹病毒疫苗,接种疫苗三个月后再怀孕。
建议育龄妇女在孕前筛查巨细胞病毒IgG抗体,阳性者可不再做相关检测,阴性者建议在孕早期做巨细胞病毒IgG抗体亲和指数和IgM抗体检测。
建议有动物接触史或生食习惯的待孕妇女孕前检测弓形体IgM抗体,阳性者建议3个月以后再怀孕。孕早期检测弓形体IgM抗体阳性者应积极治疗,基本可以防止宫内感染的发生。一般孕早期治疗效果要好于孕晚期。
据文献报告,1983-2003年近20年间,全世界仅报告十几例单纯疱疹病毒宫内感染。因此基本可以不用考虑孕妇单纯疱疹病毒宫内感染,孕前及孕期一般不需作单纯疱疹病毒实验室筛查。孕期若有生殖道单纯疱疹病毒感染体征者,经实验室检测确认感染者,建议行剖宫产术。
鉴于此,本发明所研制的TORCH筛查试纸条的检测目标是CMV和RV的IgG抗体及CMV和Toxo的IgM抗体。
目前国内市场上使用的TORCH筛查试剂基本上采用的是酶联免疫技术,该技术需要特殊设备(酶标仪),要求批量操作,不适合在优生优育第一线(特别是基层)进行单个地床边检测,而且质量不够稳定以致不能满足筛查需求。国外虽有用于TORCH筛查的金标试纸条问世,但是他们采用的方法都是以胶体金标记抗人IgG和IgM,由于人血清中大量无关IgG和IgM的存在,将消耗(反应)掉大量的金标试剂,其结果严重地影响了方法的敏感性和特异性,因此未能获得广泛应用。
发明内容
本发明的目的是针对目前市场上筛查试剂的缺点和不足,向优生优育第一线提供一种稳定可靠、反应迅速、不需特殊设备、内源性干扰小、结果准确的TORCH筛查试纸条。
本发明的另一目的是提供这种试纸条的制备方法。
本发明的技术方案如下:
一种TORCH筛查试纸条,包括试纸条底衬,以及试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴的样品垫、涂覆有色颗粒标记抗原的玻璃纤维膜、包被膜及吸水纸,包被膜设有检测区和控制区,所述的有色颗粒标记抗原为有色颗粒标记的TORCH相关抗原,检测区包被抗人免疫球蛋白抗体,控制区包被抗有色颗粒标记TORCH抗原的抗体。
所述的抗人免疫球蛋白抗体为抗人IgG抗体、抗人IgM抗体或抗人IgM μ链抗体。
所述的有色颗粒为胶体金、胶体硒或粒径为100~200nm的有色乳胶颗粒。
所述的TORCH筛查试纸条还配有吸收IgG抗体的免疫亲和柱作为配套试剂。
所述的吸收IgG抗体的免疫亲和柱为将G蛋白、A蛋白或抗IgG抗体固相化制成的免疫亲和柱。
本发明所述的TORCH筛查试纸条的制备方法,包括如下步骤:
(1)相关TORCH抗原和抗人IgG抗体、抗人IgM抗体或抗人IgM μ链抗体的获得,
(2)包被膜的制备,
(3)涂覆有色颗粒标记抗原的玻璃纤维膜的制备,
(4)试纸条的组装;
其中,所述步骤(2)包被抗人免疫球蛋白抗体及抗金标抗原的包被膜的制备方法为:用包被膜缓冲液分别稀释抗人免疫球蛋白抗体和TORCH抗原抗体至浓度为20~100μg/mL,分别划线在包被膜上,两条线之间的距离为0.4~0.6cm,室温晾干30~40min后,于25℃~37℃条件下,在封闭液中浸泡50~60分钟,取出后于25℃~37℃烘干4小时。
所述的有色颗粒标记抗原为胶体金、胶体硒或粒径为100~200nm的有色乳胶颗粒标记的TORCH相关抗原,优选胶体金标记的TORCH相关抗原。
所述步骤(3)涂覆胶体金标记TORCH相关抗原的玻璃纤维膜的制备方法为:①采用柠檬酸三钠还原法制备金颗粒直径为20nm的胶体金溶液;②金标抗原的制备:用0.1M碳酸钾调节胶体金溶液pH值至7.5~8.5,按照10-25μg/mL胶体金的量加入抗原,稳定后再陆续加入5%的BSA和1%的PEG20000,稳定后离心处理,弃上清,沉淀溶于10mLTBS pH8.2中,4℃保存备用;③金标抗原垫的制备和干燥:将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上,每毫升铺3~6平方厘米,25℃~37℃干燥24小时。
本发明涉及TORCH抗原及对应抗体,以及抗人IgG和IgM抗体(包括基因重组抗原、抗体以及单克隆抗体)既可以实验室自制,也可通过商业化途径购买。
本发明试纸条底衬材质为薄塑料条,包被膜材质为硝酸纤维素膜;试纸条底衬、包被膜均可通过商业化途径购买。
本发明试纸条检测原理:测定IgM抗体时先将受试者血清(血浆或全血(需加滤网))通过G蛋白(A蛋白或抗人IgG抗体)固相化免疫亲和柱以去除IgG(测定IgG抗体则不需要这一步),然后把滤过的血清滴在样品垫上,通过虹吸现象血清就会向吸水纸垫一端渗透,当血清经过玻璃纤维膜时其中的TORCH抗体就会与相应的有色颗粒标记的TORCH抗原反应,形成抗原抗体复合物,使得受试者的抗体(IgM)间接地标上了有色颗粒(如胶体金),并进一步向吸水垫一端流动,经过检测区时,抗原抗体复合物就会被包被其上的抗人IgM(或IgG)抗体捕捉而形成一条红色线(阳性线),血清继续向前流动,未与受试者抗体反应的有色颗粒标记抗原则会与控制区该有色颗粒标记抗原的抗体反应也形成一条红色线(对照线),结果可报告阳性(图2之a)。如受试者抗体阴性,则当血清经过玻璃纤维膜时不会与相应的有色颗粒标记TORCH抗原反应,血清进一步向吸水垫一端流动,经过检测区时,就会被包被其上的抗人IgM(或IgG)抗体捕捉,由于血清未与有色颗粒标记抗原反应就不会出现红色线(阳性线),血清继续向前流动,未与受试者抗体反应的有色颗粒标记抗原则会与金标抗原的抗体反应也形成一条红色线(对照线),因此阴性血清仅有一条对照线(图2之b)。
本发明的除草剂组合物具有以下优点:
1、本发明试纸条用胶体金标记ToRCH相关抗原,不受血清等标本中的无关IgG和IgM干扰,较之现有的TORCH试纸条具有更高的特异性和敏感性。
2、本发明试纸条以免疫亲和柱吸附标本中的IgG,防止了IgG抗体对IgM测定的干扰,进一步提高了IgM抗体测定的特异性和敏感性。
综上所述,本发明试纸条反应迅速、特异性高、无内源性干扰、不需使用特殊设备、实现了一步操作即可快速定性检测出血液中抗体的含量是否异常(超过正常上限值)。
说明书附图
图1本发明试纸条(不含免疫亲和柱)结构示意图。
1为试纸条底衬,2为样品垫,3为涂覆金标抗原的玻璃纤维膜,4为包被膜,5为吸水纸,6为检测区,7为控制区。
图2本发明试纸条检测结果示意图。
(a)为阳性结果示意图,(b)为阴性结果示意图。
具体实施方式
为了更好地描述本发明,在此我们列举实例。但这并不表示实施实例中的所述方式是实施本发明的唯一途径。此外,实例中提到的原材料种类及其选用为业内普通技术人员所共识。
实施例1
一种TORCH筛查试纸条,包括试纸条底衬1,以及试纸条底衬1上顺次相互搭接粘贴的样品垫2、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜3、包被膜4及吸水纸5,包被膜4有检测区6和控制区7,其中金标抗原为胶体金标记的是CMV的gB重组抗原VS-003-8965,检测区(6)包被抗人IgM μ链抗体,控制区包被CMV重组抗原VS-003-8965的单克隆抗体VS-001-0826。
本实施例TORCH筛查试纸条制备方法如下:
1.相关TORCH抗原和抗人免疫球蛋白(IgG和IgM)抗体的获得:
本实施例中使用的是CMV的gB重组抗原VS-003-8965、相应的单克隆抗体VS-001-0826及抗人IgMμ链单克隆抗体均通过商业化途径购买。
2.抗体包被膜的制备:
用包被膜缓冲液(0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液,0.22μm膜过滤后,置2℃~8℃备用,有效期6个月)分别稀释抗人IgM μ链抗体和CMV重组抗原VS-003-8965的单克隆抗体VS-001-0826至浓度为30μg/mL,分别划线在包被膜上,两条线之间的距离为0.5cm。在室温晾干30min后,于25℃条件下,在封闭液(含1.0%脱脂奶粉的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液,用0.22μm膜过滤后,置2℃~8℃备用,有效期5天)中浸泡60分钟,取出后于37℃烘干4小时,封袋备试纸板贴板用。
3.胶体金标记抗原的制备
(1)胶体金的制备:
采用柠檬酸三钠还原法制备金颗粒直径为20nm的胶体金溶液。取0.01%的氯金酸水溶液100mL,加热煮沸,然后快速加入1%的柠檬酸三钠溶液2.5mL,继续煮沸5min,待恢复至室温后补水至原体积。
(2)金标抗原的制备:
用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至8.0,按照15μg/mL胶体金的量加入CMV重组抗原VS-003-8965,稳定10min后,再陆续加入5%的BSA 1mL和1%的PEG200001mL,稳定30min后于12000rpm离心40min,弃上清,沉淀溶于10mL TBS pH8.2(含1%BSA和0.05%NaN3)中,4℃保存备用。
4.金标抗原垫的干燥
将标记好的胶体金抗原均匀地铺在玻璃纤维膜上,每毫升铺3~6平方厘米,25℃~37℃干燥24小时,封袋,置2℃~8℃保存备用。
5.试纸条板的组装
金标抗原玻璃纤维膜的裁切:将金标抗原玻璃纤维膜按要求进行裁切,置干燥房间备用。
吸水纸的裁切:用裁纸机将吸水纸切成35厘米长,4.2厘米宽,置干燥房间备用。
样品垫的裁切:将玻璃纤维膜切成35厘米,宽2厘米的长条,置干燥房间备用。
试纸条板的组装:按要求把包被膜、加样垫、玻璃纤维膜、吸水纸粘贴在白色塑料底板上。组装温度控制在18℃~26℃,湿度35%~55%。
6.切条
用切条机将试纸条板切成单人份,每人份宽度2.5mm~3.5mm。
7.试剂盒的包装与贮存
将本发明所制的试纸条固定在试剂外盒的底板上,上下盖密合,使上盖的加样窗对应试纸条的样品垫,结果显示窗对应检测区和控制区,就成为可检测CMV抗体的胶体金层析法试剂盒。试剂盒于4-8℃避光保存,不得冻存。
临床对照试验
取受检血清100μl加于G蛋白亲和小柱的顶端,静置5min,以100μl pH7.2,0.1mol/L的PBS洗柱,收集洗脱液;取100μl加于金标试纸条的样品窗中。同时取受检血清以爱尔兰Trinity Biotech公司生产的ELISA检测试剂盒进行平行对照检测(方法按该试剂盒的说明书),两种方法的检测结果如下表:
表1巨细胞病毒(CMV)IgM抗体的对比检测结果
与爱尔兰试剂比较,金标试纸条的特异性:89.7%,敏感性:89.1%,诊断指数:89.8%,符合率:89.4%。
经x2检验P>0.05,两法无显著性差异。本发明的方法检出率略高于爱尔兰试剂,说明本法作为筛查试剂更为合适。
制备本实施例试剂盒所需材料清单如下:
名称 商品名/商品编号 供应厂家
重组G蛋白 Recomb Prptein G 北京博奥森生物技术有限公司
抗人IgM μ链抗体 抗人IgM μ链单抗 南京大渊生物技术工程有限责任公司
CMV的gB重组抗原 VS-003-8965 广州精达医学科技有限公司
CMV重组抗原的单克隆抗体 VS-001-0826 广州精达医学科技有限公司
实施举例2
将实施举例1中的CMV抗原和抗体换成Toxo的抗原(货号JW-001-28103,购自广州精达医学科技有限公司)和抗体(货号VS-001-6206,购自广州精达医学科技有限公司),就可以检测Toxo的IgM抗体。
实施举例3
将举例1中的抗人IgM抗体换成抗人IgG抗体(南京大渊生物技术工程有限责任公司),血清不经过免疫亲和柱的分离,而是直接加到试纸条的反应窗中,就可以检测CMV的IgG抗体。
实施举例4
将实施举例3中的CMV抗原和抗体换成RV的抗原(货号VS-003-8928,购自广州精达医学科技有限公司)和抗体(VS-002-1701,购自广州精达医学科技有限公司),就可以检测RV的IgG抗体。
实施举例5
将实施举例1中的G蛋白亲和柱换成A蛋白亲和柱(购自Jena Bioscience),可以获得同样效果。
实施举例6
将实施举例1中的G蛋白亲和柱换成抗人IgG抗体柱(购自Baxter),可以获得同样效果。
Claims (9)
1.一种TORCH筛查试纸条,包括试纸条底衬(1),以及试纸条底衬(1)上顺次相互搭接粘贴的样品垫(2)、涂覆有色颗粒标记抗原的玻璃纤维膜(3)、包被膜(4)及吸水纸(5),包被膜(4)设有检测区(6)和控制区(7),其特征在于所述的有色颗粒标记抗原为有色颗粒标记的TORCH相关抗原,检测区(6)包被抗人免疫球蛋白抗体,控制区(7)包被抗有色颗粒标记TORCH抗原的抗体。
2.根据权利要求1所述的试纸条,其特征在于所述的抗人免疫球蛋白抗体为抗人IgG抗体、抗人IgM抗体或抗人IgMμ链抗体。
3.根据权利要求1所述的试纸条,其特征在于所述的有色颗粒为胶体金、胶体硒或粒径为100~200nm的有色乳胶颗粒。
4.根据权利要求1所述的试纸条,其特征在于所述的TORCH筛查试纸条还配有吸收IgG抗体的免疫亲和柱作为配套试剂。
5.根据权利要求4所述的试纸条,其特征在于所述的吸收IgG抗体的免疫亲和柱为将G蛋白、A蛋白或抗IgG抗体固相化制成的免疫亲和柱。
6.权利要求1所述的TORCH筛查试纸条的制备方法,包括如下步骤:
(1)TORCH相关抗原和抗人IgG抗体、抗人IgM抗体或抗人IgM μ链抗体的获得,
(2)包被膜的制备,
(3)涂覆有色颗粒标记抗原的玻璃纤维膜的制备,
(4)试纸条的组装;
其特征在于所述步骤(2)包被膜的制备方法为:用包被膜缓冲液分别稀释抗人免疫球蛋白抗体和抗TORCH抗原抗体至浓度为20~100μg/mL,分别划线在包被膜上,两条线之间的距离为0.4~0.6cm,室温晾干30~40min后,于25℃~37℃条件下,在封闭液中浸泡50~60分钟,取出后于25℃~37℃烘干4小时。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于所述的有色颗粒标记抗原为胶体金、胶体硒或粒径为100~200nm的有色乳胶颗粒标记的TORCH相关抗原。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于所述的有色颗粒为胶体金。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于所述步骤(3)涂覆胶体金标记TORCH相关抗原的玻璃纤维膜的制备方法为:①采用柠檬酸三钠还原法制备金颗粒直径为20nm的胶体金溶液;②金标抗原的制备:用0.1M碳酸钾调节胶体金溶液pH值至7.5~8.5,按照10-25μg/mL胶体金的量加入抗原,稳定后再陆续加入5%的BSA和1%的PEG20000,稳定后离心处理,弃上清,沉淀溶于10mLTBS pH8.2中,4℃保存备用;③金标抗原垫的制备和干燥:将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上,每毫升铺3~6平方厘米,25℃~37℃干燥24小时。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20101124 |