CN108333369A

CN108333369A - 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其专用检测卡

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Publication number: CN108333369A
Application number: CN201810131260.0A
Authority: CN
Inventors: 杨利敏; 刘文军; 魏艳秋; 孙蕾; 李晶; 范文辉
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2018-02-08
Filing date: 2018-02-08
Publication date: 2018-07-27
Anticipated expiration: 2038-02-08
Also published as: CN108333369B

Abstract

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其专用检测卡。本发明采用荧光微球代替胶体金作为标记探针，制备了免疫荧光侧流层析试纸条，灵敏度较胶体金试纸条技术提升10倍以上。本发明提供的检测技术，既具备ELISA技术的高灵敏度优势，又具备胶体金试纸条技术的现场检测优势，利用便携式荧光免疫分析仪15min就能定量的检测出抗体滴度，现场进行不需要专业的培训和技能，测试操作方便，快速提供结果。本发明能切实解决目前猪繁殖与呼吸综合征疫情的检测及防控需求。

Description

一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其专用检测卡

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其专用检测卡。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)引起的一种以感染猪发热、厌食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎，各种年龄猪(特别是仔猪)呼吸障碍为特征的高度传染性疾病。该病于1987年最早发现于美国。1991年荷兰人Wensvoot等首次从发病仔猪和母猪体内分离到了该病毒，当时称为Lelystad病毒。随后德国、美国、英国等国家和地区也分离到了该病毒。目前，该病已遍及北美洲及欧洲，在全球范围内传播。郭宝清等(1996)首次从国内疑似PRRS感染猪群中分离出PRRSV，从而证实了本病在我国的存在。随后，在2006年我国爆发高致病性PRRS，所有年龄段的猪均易感染，表现为高烧(41℃)，患病率高达(50-100％)和高死亡率高达(20-100％)。该病传播速度快，导致大量猪被扑杀，给养猪业造成巨大的经济损失。因此，我们迫切需要一种高敏感性、特异性，并且可实现现场快速筛查的检测技术，用于防控疫情发生和疫苗接种后的免疫评价。

猪繁殖与呼吸综合征病毒是单股正链RNA病毒，长达15kb，包含有5‘端帽状结构和3′pol y(A)尾，含9个大部分首尾连接和重叠的半开放阅读框，简称ORFs(ORFs：ORF1a/1b，ORF2a/2b，and ORF3-7)，至少编码14个非结构蛋白和8个结构蛋白(Gp2/E，Gp3，Gp4，Gp5/5a，M，and N)。根据病毒的抗原性，基因组及致病性的差异，PRRSV可分为2个型，即欧洲型(LV株为代表株)和美洲型(ATCC-VR2332株为代表株)，两种毒株间氨基酸的同源性为78％～81％。在我国分离的PRRSV主要是北美型。

实验室检测PRRSV抗体技术有很多，包括中和试验，免疫过氧化酶单层试验(IPMAs)，免疫荧光检测(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。然而这些技术需要专业实验室，精密仪器，训练有素的专业技术人员，而且耗时较长，无法用于现场快速检测，不能满足现场筛查的需求。免疫层析技术开始于1980年代，可以准确、快速检测生物标记物如抗原、抗体、蛋白质。目前以胶体金颗粒作为标记标签，制备的胶体金试纸条已经被广泛应用于各个领域，该技术具有检测快捷，可实现现场快速检测的目的。但是由于灵敏度偏低，而且该技术不能像ELISA技术那样对待检样品进行定量，限制了其应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其专用检测卡。

本发明一种检测卡，包括底板、样品垫、标记垫、检测垫和吸水垫；

沿待测液体样本流动方向，样品垫、标记垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；

标记垫上包被有荧光微球标记的一抗；

检测垫上设置有检测线和质控线，检测线上包被有抗原蛋白A和抗原蛋白B，质控线上包被有二抗；

所述一抗为抗猪IgG抗体；

所述二抗为抗所述一抗的抗体；

所述抗原蛋白A为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；

(a2)序列表中序列2自N端第35-293位所示的蛋白质；

(a3)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

(a4)将(a1)或(a2)或(a3)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述抗原蛋白B为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：

(b1)序列表中序列4所示的蛋白质；

(b2)序列表中序列4自N端第35-156位所示的蛋白质；

(b3)在序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

(b4)将(b1)或(b2)或(b3)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

本发明还保护一种制备检测卡的方法，包括如下步骤：

分别制备抗原蛋白A和抗原蛋白B；

沿待测液体样本流动方向，将样品垫、标记垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；标记垫上包被有荧光微球标记的一抗；检测垫上设置有检测线和质控线，检测线上包被有抗原蛋白A和抗原蛋白B，质控线上包被有二抗；

所述一抗为抗猪IgG抗体；

所述二抗为抗所述一抗的抗体；

所述抗原蛋白A的制备方法包括如下步骤：将抗原蛋白A的编码基因导入宿主菌，得到重组菌；培养所述重组菌，表达得到所述抗原蛋白A；

所述抗原蛋白A的编码基因为如下(c1)-(c4)中任一所述的DNA分子：

(c1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(c2)序列表中序列1自5’端第97-876位核苷酸所示的DNA分子；

(c3)在严格条件下与(c1)或(c2)限定的DNA序列杂交且编码抗原蛋白A的DNA分子；

(c4)与(c1)或(c2)或(c3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码抗原蛋白A的DNA分子；

所述抗原蛋白B的制备方法包括如下步骤：将抗原蛋白B的编码基因导入宿主菌，得到重组菌；培养所述重组菌，表达得到所述抗原蛋白B；

所述抗原蛋白B的编码基因为如下(d1)-(d4)中任一所述的DNA分子：

(d1)序列表中序列3所示的DNA分子；

(d2)序列表中序列3自5’端第97-465位核苷酸所示的DNA分子；

(d3)在严格条件下与(d1)或(d2)限定的DNA序列杂交且编码抗原蛋白B的DNA分子；

(d3)与(d1)或(d2)或(d3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码抗原蛋白B的DNA分子。

所述抗原蛋白A的编码基因可以通过重组表达载体导入宿主菌。所述重组表达载体可为采用序列表的序列1自5’端第97-876位核苷酸所示的双链DNA分子替代pET-28a(+)载体多克隆位点(例如BamHI和HindIII酶切位点)之间的片段得到的重组表达载体。

所述抗原蛋白B的编码基因可以通过重组表达载体导入宿主菌。所述重组表达载体可为采用序列表的序列3自5’端第97-465位核苷酸所示的双链DNA分子替代pET-28a(+)载体多克隆位点(例如BamHI和HindIII酶切位点)之间的片段得到的重组表达载体。

以上任一所述宿主菌具体可为Rosetta(DE3)感受态细胞。

所述检测垫上，每厘米检测线上附着有1μg所述抗原蛋白A和2μg所述抗原蛋白B。

所述检测线的印记方法具体为：将抗原蛋白A和抗原蛋白B按照蛋白含量1∶2的比例混合后，得到混合蛋白溶液，将混合蛋白溶液的浓度调至1.5mg/mL后印迹于检测垫(设置包被量为2μL/cm)。

以上任一所述检测垫上，每厘米质控线上附着有4μg所述二抗。

所述质控线的印记方法具体为：将二抗溶液浓度调整至2mg/mL后印迹于检测垫(设置包被量为2μL/cm)。

以上任一所述一抗为羊抗猪IgG抗体。

以上任一所述二抗为兔抗羊IgG。

以上任一所述检测垫的材质具体可为玻璃纤维膜。

以上任一所述检测垫上，所述检测线与质控线相距0.5cm。

以上任一所述检测垫上，所述检测线距检测垫左边的距离为1.0cm。

以上任一所述检测垫上，所述质控线距检测垫右边的距离为1.0cm。

以上任一所述标记垫上，每厘米标记垫上附着有30μg所述一抗；所述荧光微球和所述一抗的质量比为1∶100。

以上任一所述荧光微球具体可为羧基荧光微球。

所述羧基荧光微球的粒径为300nm，激发/发射为365/613nm。

所述荧光微球标记的一抗的制备方法包括如下步骤：

1、取100μL羧基荧光微球溶液(羧基荧光微球质量百分含量为1％，粒径300nm，激发/发射365/613nm)，加入500μL BS-T2，混匀，14000r/min离心20min，收集沉淀；采用500μLBS-T2重悬沉淀，14000r/min离心20min，收集沉淀；采用300μL BS-T1重悬沉淀。

2、向步骤1的溶液中加入10μL溶液A和10μL溶液B，震荡混匀，避光反应15min；14000rpm离心20min，收集沉淀采用500μL BS-T1重悬沉淀，14000rpm离心20min，收集沉淀；采用500μL BS-T2重悬沉淀。

溶液A：浓度为2mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)水溶液；

溶液B：浓度为4mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液。

3、向步骤2的溶液中加入100μg羊抗猪IgG，震荡混匀，避光反应2h，加入15μL9％(质量百分含量)酪蛋白水溶液，震荡混匀，避光反应30min；14000rpm离心20min，收集沉淀采用500μL BS-T1重悬沉淀，14000rpm离心20min，收集沉淀；采用500μL BS-T1重悬沉淀，得到标记羊抗猪IgG的荧光微球溶液。

以上任一所述BS-T1为含有0.25％Tween-20(体积百分含量)的25mM硼酸水溶液，所述BS-T1的pH＝8.5。

以上任一所述BS-T2为含有0.15％Tween-20(体积百分含量)的25mM硼酸水溶液，所述BS-T2的pH＝8.5。

以上任一所述标记垫处理液为含有0.3％(体积百分含量)BSA、4％(质量百分含量)蔗糖和0.2％(体积百分含量)Tween-20的0.02M Tris-HCl缓冲液，所述标记垫处理液的pH＝8.0。

以上任一所述标记垫的材质具体可为玻璃纤维膜。

以上任一所述标记垫的制备方法如下：(2)将玻璃纤维膜置于标记垫处理液中静置1min后取出，37℃烘干。(2)将以上任一所述荧光微球标记的一抗，以30μg所述一抗/cm的量喷涂到步骤(1)处理的玻璃纤维膜上，37℃烘干。

所述(2)具体可为：将荧光微球标记的一抗溶液调至一抗浓度为1mg/ml，然后喷涂到玻璃纤维膜上(设置喷涂量为30μL/cm)，37℃烘干。

所述标记垫处理液为含有0.3％(体积百分含量)BSA、4％(质量百分含量)蔗糖和0.2％(体积百分含量)Tween-20的0.02M Tris-HCl缓冲液，所述标记垫处理液的pH＝8.0。

以上任一所述样品垫的材质具体可为玻璃纤维膜。

以上任一所述样品垫的制备方法如下：将玻璃纤维膜置于样品垫处理液中静置1min后取出，37℃烘干。

所述样品垫处理液为含有1％(质量百分含量)PVP-K30、1％(体积百分含量)Tritonx-100、0.3％(质量百分含量)BSA和4％(质量百分含量)蔗糖的0.02M Tris缓冲液，所述样品垫处理液的pH＝8.0。

以上任一所底板具体可为粘性的PVC板。

以上任一所述检测卡的组装方法如下：(1)粘性的PVC板(上海金标生物技术有限公司)规格为8×300mm，将吸水垫(美国Whatman公司，200×300mm)剪裁为30×300mm的规格，在粘性的PVC板上粘贴吸水垫；(2)印迹有检测线(T)和质控线(C)的检测垫规格为25×300mm的规格，粘贴检测垫，将检测垫的2mm覆盖在吸水垫上；(3)将标记垫剪裁为80×300mm的规格，粘贴标记垫，将标记垫的2mm覆盖在检测垫上；(4)将样品垫剪裁为22×300mm的规格，粘贴样品垫，将样品垫的2mm覆盖在标记垫上；(5)裁剪成4mm宽的荧光微球试剂卡。

所述检测卡的总长度为8mm，宽度为4mm。

本发明还保护以上任一所述方法制备得到的检测卡。

本发明还保护一种检测系统，由以上任一所述的检测卡和荧光免疫分析仪组成；所述检测系统的用途为如下(1)-(3)中的至少一种：

(1)检测待测猪是否感染了猪繁殖与呼吸综合征病毒；

(2)检测待测猪血清中是否具有猪繁殖与呼吸综合征病毒或其抗体；

(3)检测待测猪是否患有猪繁殖与呼吸综合征。

所述荧光免疫分析仪具体可为手持式金标/荧光检测仪(杭州峰航科技公司)。

本发明还保护以上任一所述抗原蛋白在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(1)-(3)中的至少一种：

(1)检测待测猪是否感染了猪繁殖与呼吸综合征病毒；

(3)检测待测猪是否患有猪繁殖与呼吸综合征。

本发明还保护一种试剂盒，包括以上任一所述的抗原蛋白或抗原蛋白溶液；所述试剂盒的用途为如下(1)-(3)中的至少一种：

(1)检测待测猪是否感染了猪繁殖与呼吸综合征病毒；

(3)检测待测猪是否患有猪繁殖与呼吸综合征。

本发明还保护一种检测待测猪血清中是否具有猪繁殖与呼吸综合征病毒或其抗体的方法，包括如下步骤：取离体待测猪血清，采用以上任一所述的检测卡或检测系统进行检测，根据检测卡上质控线和检测线的荧光数值判断待测猪血清中是否具有猪繁殖与呼吸综合征病毒或其抗体。

所述方法中，所述待测猪血清的使用量为80μL。

所述方法的具体步骤为：将待测猪血清加至检测卡的样品垫，反应15min，在激发/发射(365/615nm)条件下读取检测卡的荧光值，当待测血清样本的T/C值≥0.355，待测猪血清中具有猪繁殖与呼吸综合征病毒或其抗体，当待测血清样本的T/C值＜0.355，待测猪血清中不具有猪繁殖与呼吸综合征病毒或其抗体。

荧光微球较胶体金颗粒有许多优势，如良好的球形，统一尺寸、表面反应能力高，易于功能化。本发明采用荧光微球代替胶体金作为标记探针，制备了免疫荧光侧流层析试纸条，灵敏度较胶体金试纸条技术提升10倍以上，。本发明提供的检测技术，既具备ELISA技术的高灵敏度优势，又具备胶体金试纸条技术的现场检测优势，利用便携式荧光免疫分析仪(杭州峰航科技公司)15min就能定量的检测出抗体滴度，现场进行不需要专业的培训和技能，测试操作方便，快速提供结果。本发明能切实解决目前猪繁殖与呼吸综合征疫情的检测及防控需求。

附图说明

图1为重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析。

图2为纯化的重组蛋白Western blot分析。

图3为荧光微球免疫层析试剂卡结构图。

图4为荧光微球免疫层析试剂卡结果读取示意图。

图5为实施例3中建立的标准曲线。

图6为实施例4中步骤一的灵敏度比较结果。

图7为实施例4中步骤二的特异性检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pET-28a(+)载体：上海索莱宝生物科技有限公司，货号：P3110。

Rosetta(DE3)感受态细胞：上海易欣生物科技有限公司，货号：cc502-01。

BS-T1(pH 8.5)：含有0.25％Tween-20(体积百分含量)的25mM硼酸水溶液。

BS-T2(pH 8.5)：含有0.15％Tween-20(体积百分含量)的25mM硼酸水溶液。

样品垫处理液：含有1％(质量百分含量)PVP-K30、1％(体积百分含量)Tritonx-100、0.3％(质量百分含量)BSA和4％(质量百分含量)蔗糖的0.02M Tris缓冲液(pH8.0)。

标记垫处理液：含有0.3％(体积百分含量)BSA、4％(质量百分含量)蔗糖和0.2％(体积百分含量)Tween-20的0.02M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。

实施例1、重组蛋白的制备

一、重组表达载体的构建

1、采用序列表的序列1自5’端第97-876位核苷酸所示的双链DNA分子替代pET-28a(+)载体的BamHI和HindIII酶切位点之间的小片段，得到重组表达载体pET-28a-NSP7(已经测序验证)。序列1自5’端第97-876位核苷酸所示的DNA分子是将猪繁殖与呼吸综合征病毒的NSP7基因经过优化使其适应大肠杆菌后得到的。插入后的序列与载体上的His标签序列融合得到融合基因，如序列表的序列1所示。序列表的序列1所示的融合基因编码序列表的序列2所示的融合蛋白。序列2所示的融合蛋白中，自N端第1-34位氨基酸为His标签蛋白，第35-293位氨基酸为NSP7蛋白。

2、采用序列表的序列3自5’端第97-465位核苷酸所示的双链DNA分子替代pET-28a(+)载体的BamHI和HindIII酶切位点之间的小片段，得到重组表达载体pET-28a-N(已经测序验证)。序列3自5’端第97-465位核苷酸所示的DNA分子是将猪繁殖与呼吸综合征病毒的N基因经过优化使其适应大肠杆菌后得到的。插入后的序列与载体上的His标签序列融合得到融合基因，如序列表的序列3所示。序列表的序列3所示的融合基因编码序列表的序列4所示的融合蛋白。序列4所示的融合蛋白中，自N端第1-34位氨基酸为His标签蛋白，第35-156位氨基酸为N蛋白。

二、NSP7重组蛋白的诱导表达

1、将步骤一制备的重组表达载体pET-28a-NSP7导入Rosetta(DE3)感受态细胞，得到重组菌。

2、将步骤1得到的重组菌单菌落接种于3mL含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养8-12小时。

取1mL菌液，5000r/min离心5min，收集沉淀；采用100μL无菌去离子水重悬沉淀，加100μL 2xSDS凝胶加样缓冲液，混匀，沸水浴5min，取10μL进行SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达，结果见图1A的泳道1。

3、完成步骤2后，取100μL菌液接种于10mL含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至菌液OD_600nm为0.6；向培养体系中加入IPTG(IPTG在培养体系中的浓度为1.0mmol/L)，37℃、200r/min振荡培养5h。

取1mL菌液，5000r/min离心5min，收集沉淀；采用100μL无菌去离子水重悬沉淀，加100μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀，沸水浴5min，取10μL进行SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达，结果见图1A的泳道2。

4、完成步骤3后，将培养体系5000r/min离心10min，收集菌体沉淀；采用BingdingBuffer(20mM Tirs，500mMNacl，20mM咪唑，pH8.0)重悬沉淀，超声裂解30min(每开3s后关4s)，取上清，0.22μm滤膜过滤，得到滤液(含有目的蛋白)。

5、采用AKTA蛋白纯化系统(GE生命科学，FPLC)和Ni-柱(GE生命科学，HisTrapHP)，对步骤4的滤液(含有目的蛋白)进行蛋白纯化，上样后用Wash Buffer(20mM Tirs，500mMNacl，60mM咪唑，pH8.0)洗涤以去除杂蛋白，然后用Elution Buffer(20mM Tirs，500mMNacl，500mM咪唑，pH8.0)洗脱以收集目的蛋白，收集洗脱液(含有目的蛋白)，得到NSP7重组蛋白溶液(分子量大小约为33kDa)，蛋白浓度为2.0mg/mL。

取10μLNSP7重组蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳，检测重组蛋白的表达和纯化情况，结果见图1A的泳道3。

三、N重组蛋白的诱导表达

1、将步骤一制备的重组表达载体pET-28a-N转化Rosetta(DE3)感受态细胞，得到重组菌。

取1mL菌液，5000r/min离心5min，收集沉淀；采用100μL无菌去离子水重悬沉淀，加100μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀，沸水浴5min，取10μL进行SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达，结果见图1B的泳道1。

取1mL菌液，5000r/min离心5min，收集沉淀；采用100μL无菌去离子水重悬沉淀，加100μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀，沸水浴5min，取10μL进行SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达，结果见图1B的泳道2。

4、完成步骤3后，将培养体系5000r/min离心10min，收集菌体沉淀；采用BingdingBuffer(20mM Tirs，500mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0)重悬沉淀，超声裂解30min(每开3s后关4s)，取上清，0.22μm滤膜过滤，得到滤液(含有目的蛋白)。

5、采用AKTA蛋白纯化系统(GE生命科学，FPLC)和Ni-柱(GE生命科学，HisTrapHP)，对步骤4的滤液(含有目的蛋白)进行蛋白纯化，上样后用Wash Buffer(20mM Tirs，500mMNacl，60mM咪唑，pH8.0)洗涤以去除杂蛋白，然后用Elution Buffer(20mM Tirs，500mMNacl，500mM咪唑，pH8.0)洗脱以收集目的蛋白，收集洗脱液(含有目的蛋白)，得到N重组蛋白溶液(分子量大小约为17kDa)，蛋白浓度为1.2mg/mL。

取10μLN重组蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳，检测重组蛋白的表达和纯化情况，结果见图1B的泳道3。

四、重组蛋白的抗原反应原性检测

待测重组蛋白：步骤二制备的NSP7重组蛋白溶液和步骤三制备的N重组蛋白溶液。

采用westen blot检测待测重组蛋白的抗原反应原性。

一抗：离体猪繁殖与呼吸综合征阳性血清(经IDEXX-ELISA试剂盒(HerdCheck*PRRS X3)鉴定，1∶100倍稀释)或离体猪繁殖与呼吸综合征阴性血清(经IDEXX-ELISA试剂盒(HerdCheck*PRRS X3)鉴定，1∶100倍稀释)。

二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG(1∶2000倍稀释)(北京索莱宝科技有限公司，货号：SA137)。

结果如图2所示。图2中，泳道1为NSP7重组蛋白与猪繁殖与呼吸综合征阳性血清反应结果；泳道2为N重组蛋白与猪繁殖与呼吸综合征阳性血清反应结果；泳道3为泳道1为NSP7重组蛋白与猪繁殖与呼吸综合征阴性对照血清反应结果；泳道4为N重组蛋白与猪繁殖与呼吸综合征阴性对照血清反应结果。

结果显示，NSP7重组蛋白与阳性血清反应出现约33kDa的条带，N重组蛋白与阳性血清反应出现约17kDa的条带，而两种重组蛋白与阴性对照血清反应均没有得到对应条带，表明两种重组蛋白具有抗原反应原性。

实施例2、检测卡的制备

一、微球标记抗体

1、取100μL羧基荧光微球溶液(羧基荧光微球质量百分含量为1％，粒径300nm，激发/发射365/613nm，挪岛科技)，加入500μL BS-T2，混匀，14000r/min离心20min，收集沉淀；采用500μL BS-T2重悬沉淀，14000r/min离心20min，收集沉淀；采用300μL BS-T1重悬沉淀。

溶液B：浓度为4mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液。

3、向步骤2的溶液中加入100μg羊抗猪IgG(北京索莱宝科技有限公司，货号：SA137)，震荡混匀，避光反应2h，加入15μL9％(质量百分含量)酪蛋白水溶液，震荡混匀，避光反应30min；14000rpm离心20min，收集沉淀采用500μL BS-T1重悬沉淀，14000rpm离心20min，收集沉淀；采用500μLBS-T1重悬沉淀，调整羊抗猪IgG浓度为1mg/ml，得到标记羊抗猪IgG的荧光微球溶液。

二、样品垫和标记垫的制备

1、样品垫(22×300mm)：将玻璃纤维膜(型号：Alstrom 8964，美国Alstrom公司)置于样品垫处理液中静置1min后取出，37℃烘干。

2、标记垫(8×300mm)：将玻璃纤维膜(型号：Alstrom 8964，美国Alstrom公司)置于标记垫处理液中静置1min后取出，37℃烘干。应用XYZ三维划膜喷金仪喷涂，将步骤一得到的标记羊抗猪IgG的荧光微球溶液涂到玻璃纤维膜上(设置喷涂量为30μL/cm)，即每厘米标记垫上附着有30μg羊抗猪IgG)，37℃烘干。

三、检测垫的制备

检测垫印迹有检测线(T)和质控线(C)。

1、将实施例1制备的NSP7重组蛋白溶液和N重组蛋白溶液分别测定蛋白浓度后，按照NSP7重组蛋白含量∶N重组蛋白含量＝1∶2的比例混合，得到混合蛋白溶液。采用Tris-HCl缓冲液将混合蛋白溶液的总蛋白浓度调至1.5mg/mL，印迹于硝酸纤维素膜(型号：M135，美国Millipore公司)(设置包被量为2μL/cm)，作为检测线(T)。

2、按照2μL/cm的包被量，将2mg/mL的兔抗羊IgG(北京索莱宝科技有限公司，货号：SPA238)印迹于硝酸纤维素膜，作为质控线(C)。

检测线与质控线相距0.5cm，位于硝酸纤维素膜的中间，检测线距检测垫左边的距离为1.0cm，质控线距检测垫右边的距离为1.0cm，置于37℃干燥，得到检测垫(25×300mm)。

四、荧光微球试剂卡的组装

(1)粘性的PVC板(上海金标生物技术有限公司)规格为8×300mm，将吸水垫(美国Whatman公司，200×300mm)剪裁为30×300mm的规格，在粘性的PVC板上粘贴吸水垫；(2)印迹有检测线(T)和质控线(C)的检测垫规格为25×300mm，粘贴检测垫，将检测垫的2mm覆盖在吸水垫上；(3)将标记垫剪裁为80×300mm的规格，粘贴标记垫，将标记垫的2mm覆盖在检测垫上；(4)将样品垫剪裁为22×300mm的规格，粘贴样品垫，将样品垫的2mm覆盖在标记垫上；(5)裁剪成4mm宽的荧光微球试剂卡。

试剂卡的总长度为8mm，宽度为4mm。沿待测液体样本流动方向依次为样品垫、标记垫、检测垫和吸水垫(图3)。

所述荧光微球试剂卡在使用时，将80μL的检测样品加至样品垫，反应15min，将检测卡插入到荧光免疫分析仪，在激发/发射(365/615nm)条件下的荧光值读取，获得T/C值(图4)。

荧光免疫分析仪可采用手持式金标/荧光检测仪(杭州峰航科技公司)，小巧轻便，使用电池无需电源插电，现场检测后通过无线网络模块上传结果，利于数据的保存和分析。

实施例3、检测方法的建立

一、标准曲线

1、采用PRRSV阴性血清将抗体滴度为1∶24的PRRSV标准参考血清(北京兽药检查所)依次倍比稀释成抗体滴度1∶24、1∶12、1∶6、1∶3、1∶1.5和1∶0.75的血清待测液。

2、取实施例1制备的荧光微球试剂卡，将80μL的血清待测液加至样品垫，反应15min，将荧光微球试剂卡插入到荧光免疫分析仪，在激发/发射(365/615nm)条件下的荧光值读取，获得T/C值。

结果如表1所示。用抗体滴度和T/C值分别做横坐标、纵坐标，使用Logistic 4P方程，拟合曲线(图5)，求得标准曲线方程及相关系数(R2＝99.98％)(表2)。

表1标准血清检测结果

表2标准曲线方程

二、临界值的确定

用荧光微球试剂卡检测50份临床离体猪PRRSV阴性血清，得到样品的T/C值和滴度值，代入步骤一得到的标准曲线方程，计算50份血清的平均T/C值及其标准方差。

阴阳性临界值＝阴性样本平均浓度值(X)十2×标准方差(SD)。

根据计算和统计学分析结果，当被检样品浓度值≥X+2SD时，可以在95.3％的水平上判定为阳性。因此，当被检样品的T/C值≥0.355(X＝0.3356，SD＝0.009846)时判定为阳性，当T/C值＜0.355时判定为阴性。T/C值＝0.355在标准曲线中对应的抗体滴度为0.88。

三、检测方法建立

取80μL待测血清样本，加至荧光微球试剂卡的样品垫，反应15min，将荧光微球试剂卡插入到手持式金标/荧光检测仪(杭州峰航科技公司)，在激发/发射(365/615nm)条件下的荧光值读取，获得T/C值。

当待测血清样本的T/C值≥0.355，待测样本感染了猪繁殖与呼吸综合征病毒；

当待测血清样本的T/C值＜0.355，待测样本没有感染猪繁殖与呼吸综合征病毒。

实施例4、检测卡的评价

一、灵敏度

采用商业的IDEXX-ELISA(货号HerdCheck*PRRS X3)检测实施例3步骤一的1得到的不同抗体滴度的血清待测液(检测方法参照试剂盒说明书)，并计算阴阳性临界值和最低抗体滴度。结果显示试剂盒的阴阳性临界值为0.297，可检测到的最低抗体滴度为1.75。

根据实施例3的结果，荧光微球试剂卡的阴阳性临界值为0.355，可检测到的最低抗体滴度为0.88。

结果表明，荧光微球试剂卡检测方法(FICT)和ELISA试剂盒检测方法有一定的相关性(图6)，荧光微球试剂卡的灵敏度是ELISA试剂盒的2倍。

二、特异性

待测血清样本：临床离体猪PRRSV阳性血清、临床离体猪PRRSV阴性血清、临床离体猪CSFV阳性血清、临床离体猪TGEV阳性血清、临床离体猪PRV阳性血清和临床离体猪PCV2阳性血清。

采用实施例3中步骤三建立的方法检测待测血清。

结果如图7所示。结果表明，荧光微球试剂卡具有良好的特异性，与其他病毒的抗体没有交叉反应。

三、符合率

分别采用商业的IDEXX-ELISA和步骤三建立的方法(FICT)检测100份临床离体猪血清样本。结果如表3所示。

表3FICT和IDEXX-ELISA方法的比较

IDEXX-ELISA方法检测阳性80份，阴性20份。

FICT方法检测阳性78份，阴性22份。

FICT方法的特异性是95％(76/80)，灵敏性是90％(18/20)，精确性为94％(94/100)。

结果表明两种方法有一定的相关性，FICT方法能用于临床样本的检测。

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其专用检测卡

<160> 4

<210> 1

<211> 876

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgctctc tgactggtgc cctcgctatg 120

agactcaatg acgaggactt ggatttcctt atgaaatgga ctgattttaa gtgctttgtt 180

tctgcgtcca acatgaggaa tgcagcgggt caatttatcg aggctgccta tgctaaagca 240

cttagagtag aactggccca gttggtacag gttgataaag ttcgaggtac tttggccaaa 300

cttgaagctt ttgctgatac cgtggctcct caactctcgc ccggtgacat tgttgtcgct 360

ctcggccaca cgcctgttgg cagtatcttc gacctaaagg ttggtagcac caagcatacc 420

ctccaagcca ttgagaccag agtccttgct gggtccaaaa tgaccgtggc gcgcgtcgtc 480

gacccgaccc ccacgccccc acccgcaccc gtgcccatcc ccctcccacc gaaagttctg 540

gagaatggcc ccaacgcttg gggggatgag gaccgtttga ataagaagaa gaggcgcagg 600

atggaagccc tcggcatcta tgttatgggc gggaaaaagt accagaaatt ttgggacaag 660

aattccggtg atgtgtttta tgaggaggtc cataataaca cagatgagtg ggagtgtctc 720

agagttggcg accctgccga ctttgaccct gagaagggaa ctctgtgtgg acatgtcacc 780

attgaaaata aggcttacca tgtttacacc tccccatctg gtaagaagtt cttggtcccc 840

gtcaacccag agaatggaag agttcaatgg gaatga 876

<210> 2

<211> 293

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Thr Gly Ala Leu Ala Met Arg Leu Asn Asp Glu Asp

35 40 45

Leu Asp Phe Leu Met Lys Trp Thr Asp Phe Lys Cys Phe Val Ser Ala

50 55 60

Ser Asn Met Arg Asn Ala Ala Gly Gln Phe Ile Glu Ala Ala Tyr Ala

65 70 75 80

Lys Ala Leu Arg Val Glu Leu Ala Gln Leu Val Gln Val Asp Lys Val

85 90 95

Arg Gly Thr Leu Ala Lys Leu Glu Ala Phe Ala Asp Thr Val Ala Pro

100 105 110

Gln Leu Ser Pro Gly Asp Ile Val Val Ala Leu Gly His Thr Pro Val

115 120 125

Gly Ser Ile Phe Asp Leu Lys Val Gly Ser Thr Lys His Thr Leu Gln

130 135 140

Ala Ile Glu Thr Arg Val Leu Ala Gly Ser Lys Met Thr Val Ala Arg

145 150 155 160

Val Val Asp Pro Thr Pro Thr Pro Pro Pro Ala Pro Val Pro Ile Pro

165 170 175

Leu Pro Pro Lys Val Leu Glu Asn Gly Pro Asn Ala Trp Gly Asp Glu

180 185 190

Asp Arg Leu Asn Lys Lys Lys Arg Arg Arg Met Glu Ala Leu Gly Ile

195 200 205

Tyr Val Met Gly Gly Lys Lys Tyr Gln Lys Phe Trp Asp Lys Asn Ser

210 215 220

Gly Asp Val Phe Tyr Glu Glu Val His Asn Asn Thr Asp Glu Trp Glu

225 230 235 240

Cys Leu Arg Val Gly Asp Pro Ala Asp Phe Asp Pro Glu Lys Gly Thr

245 250 255

Leu Cys Gly His Val Thr Ile Glu Asn Lys Ala Tyr His Val Tyr Thr

260 265 270

Ser Pro Ser Gly Lys Lys Phe Leu Val Pro Val Asn Pro Glu Asn Gly

275 280 285

Arg Val Gln Trp Glu

290

<210> 3

<211> 465

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcccaa ataacaacgg caagcagcag 120

aatagaaaga agggggatgg ccagccagtc aatcagctgt gccagatgct gggtaagatc 180

atcgctcagc aaaaccagtc cagaggcaag ggaccgggaa agaaaaataa gaagaaaaac 240

ccggagaagc cccattttcc tctagcgact gaagatgatg tcagacatca ctttacccct 300

agtgagcggc aattgtgtct gtcgtcaatc cagaccgcct ttaatcaagg cgctgggact 360

tgcaccctgt cagattcagg gaggataagt tacactgtgg agtttagttt gcctacgcat 420

catactgtgc gcctgattcg cgtcacagca tcaccctcag catga 465

<210> 4

<211> 156

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Asn Arg Lys Lys Gly Asp

35 40 45

Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala

50 55 60

Gln Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys

65 70 75 80

Lys Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val

85 90 95

Arg His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile

100 105 110

Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser

115 120 125

Gly Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr

130 135 140

Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala

145 150 155

Claims

1.一种检测卡，包括底板、样品垫、标记垫、检测垫和吸水垫；

标记垫上包被有荧光微球标记的一抗；检测垫上设置有检测线和质控线，检测线上包被有抗原蛋白A和抗原蛋白B，质控线上包被有二抗；

所述一抗为抗猪IgG抗体；

所述二抗为抗所述一抗的抗体；

所述抗原蛋白A为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；

(a2)序列表中序列2自N端第35-293位所示的蛋白质；

所述抗原蛋白B为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：

(b1)序列表中序列4所示的蛋白质；

(b2)序列表中序列4自N端第35-156位所示的蛋白质；

2.一种制备检测卡的方法，包括如下步骤：

分别制备抗原蛋白A和抗原蛋白B；

所述一抗为抗猪IgG抗体；

所述二抗为抗所述一抗的抗体；

(c1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(c2)序列表中序列1自5’端第97-876位核苷酸所示的DNA分子；

(d1)序列表中序列3所示的DNA分子；

(d2)序列表中序列3自5’端第97-465位核苷酸所示的DNA分子；

3.如权利要求1所述的检测卡或如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述检测垫上，每厘米检测线上附着有1μg所述抗原蛋白A和2μg所述抗原蛋白B。

4.如权利要求1至3任一所述的检测卡或方法，其特征在于：所述检测垫上，每厘米质控线上附着有4μg所述二抗。

5.如权利要求1至4任一所述的检测卡或方法，其特征在于：所述标记垫上，每厘米标记垫上附着有30μg所述一抗；所述荧光微球和所述一抗的质量比为1∶100。

6.权利要求2至5任一所述的方法制备得到的检测卡。

7.一种检测系统，由权利要求1至6任一所述的检测卡和荧光免疫分析仪组成；所述检测系统的用途为如下(1)-(3)中的至少一种：

(1)检测待测猪是否感染了猪繁殖与呼吸综合征病毒；

(3)检测待测猪是否患有猪繁殖与呼吸综合征。

8.权利要求1或2中所述的抗原蛋白A和抗原蛋白B在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(1)-(3)中的至少一种：

(1)检测待测猪是否感染了猪繁殖与呼吸综合征病毒；

(3)检测待测猪是否患有猪繁殖与呼吸综合征。

9.一种试剂盒，包括权利要求1或2中所述的抗原蛋白或抗原蛋白溶液；所述试剂盒的用途为如下(1)-(3)中的至少一种：

(1)检测待测猪是否感染了猪繁殖与呼吸综合征病毒；

(3)检测待测猪是否患有猪繁殖与呼吸综合征。

10.一种检测待测猪血清中是否具有猪繁殖与呼吸综合征病毒或其抗体的方法，包括如下步骤：取离体待测猪血清，采用权利要求1至6任一所述的检测卡，或，权利要求7所述的系统进行检测，根据检测卡上质控线和检测线的荧光数值判断待测猪血清中是否具有猪繁殖与呼吸综合征病毒或其抗体。