CN115951049A - 一种量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡及其应用 - Google Patents
一种量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡及其应用。首先公开了双通量免疫层析试纸条包括PVC背板及设置在PVC背板上的依次排列的样品垫、结合垫、反应垫和吸收垫，邻垫之间须部分重叠；反应垫上从靠近结合垫端到靠近吸收垫端依次设置相互平行的检测线T2线、检测线T1线和质控线C线，检测线T1线和检测线T2线分别包被重组GP5蛋白和重组N蛋白，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；结合垫含有鼠抗猪IgG抗体‑生物素‑亲和素复合物‑量子点荧光微球。进一步公开其在检测GP5抗体和/或N抗体上的应用。本发明双通量免疫层析检测卡实现了猪繁殖与呼吸综合征N和GP5抗体高灵敏度联合定性和定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及动物医学体外诊断技术领域。更具体地，涉及一种量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍、仔猪出现呼吸道疾病为特征的传染病，以高热、发病率和死亡率高，成年猪生殖障碍、早产、流产和死胎，仔猪呼吸异常为特征，是一种接触传染性疾病。仔猪发病率可达100％，死亡率在50％左右，母猪流产、死胎等可达30％以上，是世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties，OIE)列入的93种法定报告的动物疫病之一。
据统计，该病每年给美国的养猪业造成近5.6亿美元的经济损失。2006年，中国爆发了以仔猪高死亡率为特征的高致病性蓝耳病，使中国养猪业蒙受了巨大的经济损失。童光志等(童光志，周艳君，郝晓芳等。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析[J]。中国预防兽医学报，2007，29(5)：323-326。)建立了一整套在中国切实可行的病毒检测、净化猪场、免疫控制等综合防治技术措施和防治模式，是符合国情的防控体系，进而建立一套快速简便、高效精准检测技术是繁殖与呼吸综合征防控的前提条件。
猪繁殖与呼吸综合征诊断方法有多种，首先依据临床症状和病理变化可作出初步诊断，进一步确诊必须结合实验室检测，目前已建立的免疫学实验室诊断方法主要有免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)和血清中和试验(SN)等，均需要专业的技术人员以及专业的实验室，且检测耗时长、实验仪器及耗材费用昂贵，不适合大规模筛查应用。另外，目前市售用于猪繁殖与呼吸综合病毒抗体检测试剂盒均为单一指标检测试剂等，且这些单一指标检测多存在灵敏度和特异性低的问题，临床诊断价值有限。因此，需要一种即时、快速、简便的诊断方法才能在基层大范围地推广使用。
量子点(Quantum dot，QD)又称半导体纳米晶，呈近似球形，其三维尺寸在2-10nm范围内，是新一代荧光标记探针的好选择。量子点作为新型荧光纳米材料运用于免疫层析平台，具有荧光效率高、稳定性高、Stockes位移较大、发射光谱窄而对称、单一波长多色激发等诸多优秀的荧光特性，然而单体量子点粒径小、表面能高、不耐氧的缺点限制了其在生物检测方面的应用。
因此，需要提供一种新型量子点纳米微球应用于免疫层析平台，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡及其在猪繁殖与呼吸综合征抗体联合检测中的应用，实现猪繁殖与呼吸综合征N抗体和GP5抗体高灵敏度联合定性和定量检测。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明首先提供了一种量子点荧光微球标记的双通量免疫层析试纸条，所述试纸条包括PVC背板及设置在PVC背板上的依次排列的样品垫、结合垫、反应垫和吸收垫，邻垫之间须部分重叠；所述反应垫上从靠近所述结合垫端到靠近所述吸收垫端依次设置相互平行的检测线T2线、检测线T1线和质控线C线，检测线T1线和检测线T2线分别包被重组GP5蛋白和重组N蛋白，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；所述结合垫含有鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球；其中，
所述重组GP5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述重组N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明具体的实施方式中，所述重组GP5蛋白的制备方法包括如下步骤：
(1)以含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列(含GP5基因)的质粒为模板，用BamHⅠ和EcoR I酶切，得到含GP5基因的目的片段；
(2)表达载体pcDNA3.1(+)用BamHⅠ和EcoR I酶切，得到线性化的表达载体；
(3)将含GP5基因的目的片段和线性化的表达载体进行酶连接，得到连接产物；
(4)将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，鉴定，筛选阳性克隆,提取质粒，得到重组表达质粒pcDNA3.1(+)-GP5；
(5)将重组表达质粒pcDNA3.1(+)-GP5转染HEK293T细胞并瞬时表达，纯化得到重组GP5蛋白。
在本发明具体的实施方式中，所述重组N蛋白的制备方法包括如下步骤：
(1)以含SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列(含N基因)的质粒为模板，用BamHⅠ和EcoRI酶切，得到含N基因的目的片段；
(2)表达载体pcDNA3.1(+)用BamHⅠ和EcoR I酶切，得到线性化的表达载体；
(3)将含N基因的目的片段和线性化的表达载体进行酶连接，得到连接产物；
(4)将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，鉴定，筛选阳性克隆,提取质粒，得到重组表达质粒pcDNA3.1(+)-N；
(5)将重组表达质粒pcDNA3.1(+)-N转染HEK293T细胞并瞬时表达，纯化得到重组N蛋白。
进一步，所述量子点荧光微球选择粒径在30～50nM范围内，荧光效率大于70％的量子点荧光微球。
在本发明具体的实施方式中，所述鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球的制备方法包括如下步骤：
A、生物素标记鼠抗猪IgG抗体的制备：
①将鼠抗猪IgG抗体用碳酸氢钠缓冲液稀释，交互用碳酸氢钠缓冲液对鼠抗猪IgG抗体充分透析，得到鼠抗猪IgG抗体溶液；
②用二甲基亚砜溶解N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHSB)，得到NHSB溶液；
③向鼠抗猪IgG抗体溶液加入NHSB溶液，持续搅拌，保温；
④加入NH4Cl，搅拌，充分透析，以除去游离的N-羟基琥珀酰亚胺生物素，得到透析后的样品；
⑤将透析后的样品上分子筛Sephadex G150柱，洗脱，超滤浓缩得到生物素标记鼠抗猪IgG抗体溶液；
B、鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球的制备：
①向生物素标记鼠抗猪IgG抗体溶液加链霉亲和素溶液，持续搅拌；
②向步骤①反应后的溶液中继续加入量子点荧光微球，持续搅拌；
③将步骤②反应后的溶液上的分子筛Sephadex G200柱，洗脱，收集洗脱液；
④洗脱液充分透析；
⑤向步骤④加入酪蛋白溶液搅拌温育，离心，弃上清，沉淀用复溶缓冲液洗涤，最终用复溶缓冲液将沉淀重悬，得到鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球。
进一步，所述检测线T1线和检测线T2线之间的距离为3～4mm，检测线T1线、质控线C线之间的距离为3～4mm。
进一步，所述重组GP5蛋白和重组N蛋白分别在检测线T1线和检测线T2线上的包被量为0.8～1.5μg/cm2，优选的为1.0μg/cm2。
进一步，所述羊抗鼠IgG抗体在质控线C线上的包被量为0.5～1.0μg/cm2，优选的为0.5μg/cm2。
进一步，所述鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球在结合垫上的含量为2.0～6.0μg/cm2，优选的为4.0μg/cm2。
进一步，所述部分重叠是重叠0.5～1.0mm。
本发明进一步提供了上述量子点荧光微球标记的双通量免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：
结合垫的制备：将鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球均匀喷涂在浸泡干燥后的玻璃纤维上，干燥，得到结合垫；
反应垫的制备：将重组GP5蛋白和重组N蛋白分别包被于硝酸纤维素膜作为检测线T1线和检测线T2线，将羊抗鼠IgG抗体包被于硝酸纤维素膜作为质控线C线，封闭，干燥，得到反应垫；
组装：依次将反应垫、吸收垫、结合垫和样本垫粘附在PVC背板上，邻垫之间部分重叠，切割，即得。
进一步，所述鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球的浓度为4mg/mL，所述鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球在结合垫上的含量为2.0～6.0μg/cm2，优选的为4.0μg/cm2。
进一步，所述检测线T1线和检测线T2线之间的距离为3～4mm，检测线T1线、质控线C线之间的距离为3～4mm。
进一步，所述重组GP5蛋白和重组N蛋白的浓度分别为1mg/mL，所述重组GP5蛋白和重组N蛋白分别在检测线T1线和检测线T2线上的包被量为0.8～1.5μg/cm2，优选的为1.0μg/cm2。
进一步，所述羊抗鼠IgG抗体的浓度为500μg/mL，羊抗鼠IgG抗体在质控线C线上的包被量为0.5～1.0μg/cm2，优选的为0.5μg/cm2。
进一步，所述部分重叠是重叠0.5～1.0mm。
本发明进一步提供了一种量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡，所述双通量免疫层析检测卡包括上述双通量免疫层析试纸条和装载上述双通量免疫层析试纸条的检测卡壳。
上述双通量免疫层析试纸条或双通量免疫层析检测卡在如下任一中的应用也在本发明的保护范围之内：
A、检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体和N抗体的浓度；
B、检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体的浓度；
C、检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体的浓度；
D、检测待测样本中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体；
E、检测待测样本中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体；
F、检测待测样本中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体和N抗体；
G、检测待测样本中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒。
本发明进一步公开了检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体和/或N抗体的浓度的方法(即定量检测)，具体包括如下步骤：
1)建立Logistic拟合曲线方程：
将已知浓度的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和N抗体混合后稀释得样本稀释液，利用上述双通量免疫层析检测卡或上述双通量免疫层析试纸条分别对样品稀释液进行检测，采用干式荧光分析仪器采集检测线T1线、检测线T2线和质控线C线的荧光强度值，计算T1/C值和T2/C值；
以浓度为横坐标、T1/C值为纵坐标通过ELISAcalc进行Logistic曲线拟合分析，计算得到检测GP5抗体的Logistic曲线拟合方程，
以浓度为横坐标、T2/C值为纵坐标通过ELISAcalc进行Logistic曲线拟合分析，计算得到检测N抗体的Logistic曲线拟合方程；
2)待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体和/或GP5抗体的浓度的检测：
利用上述双通量免疫层析检测卡或上述双通量免疫层析试纸条对待测样本进行检测，采用干式荧光分析仪器采集检测线T1线、检测线T2线和质控线C线的荧光强度值，计算T1/C值和T2/C值，T1/C值带入检测GP5抗体的Logistic曲线拟合方程得出待测样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体的浓度；T2/C值带入检测N抗体的Logistic曲线拟合方程得出待测样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体的浓度；
其中，T1代表检测线T1线的荧光强度值，T2代表检测线T2线的荧光强度值，C代表质控线C线的荧光强度值。
在本发明具体的实施方式中，所述检测N抗体的Logistic曲线拟合方程：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D(A＝2.81805，B＝-1.81473，C＝15.87687，D＝0.40842；r^2＝0.99709)；检测GP5抗体的Logistic曲线拟合方程：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D(A＝2.87716，B＝-1.71495，C＝20.03599，D＝0.48098；r^2＝0.99852)。
本发明进一步还公开了检测待测样本中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法(即定性检测)，包括如下步骤：
将灭活阴性血清用上述双通量免疫层析检测卡或上述双通量免疫层析试纸条进行检测，采用干式荧光分析仪器采集检测线T1线、检测线T2线和质控线C线的荧光强度值，计算T1/C值和T2/C值，进行n次平行测试，最终计算T10/C0+2SD10和T20/C0+2SD20，其中，T10/C0代表T1/C值的平均值，SD10代表T1/C值的标准差，T20/C0代表T2/C值的平均值T10/C0，SD20代表T2/C值的标准差：
利用上述双通量免疫层析检测卡或上述双通量免疫层析试纸条对待测样本进行检测，采用干式荧光分析仪器采集检测线T1线、检测线T2线和质控线C线的荧光强度值，计算T1/C值和T2/C值，对结果进行判读，判读标准为：T1/C≥T10/C0+2SD10和/或T2/C≥T20/C0+2SD20，判定为阳性，即待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒；T1/C<T10/C0+2SD10和T2/C<T20/C0+2SD20，判定为阴性，即待测样本不含猪繁殖与呼吸综合征病毒；
其中，T1代表检测线T1线的荧光强度值，T2代表检测线T2线的荧光强度值，C代表质控线C线的荧光强度值，n≥3。
在本发明具体的实施方式中，所述n＝12，经计算T10/C0+2SD10＝0.415，T20/C0+2SD20＝0.487，即判读标准为：T1/C≥0.415和/或T2/C≥0.487，判定为阳性，即待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒；T1/C<0.415和T2/C<0.487，判定为阴性，即待测样本不含猪繁殖与呼吸综合征病毒。
本发明的有益效果如下：
1、本发明首次将量子点荧光微球标记应用于免疫层析平台开发出量子点荧光微球标记的双通道免疫层析检测卡，成功实现猪繁殖与呼吸综合征N抗体和GP5抗体高灵敏度联合定性和定量检测，可以初步判断猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的不同病例阶段，增加检测谱，大大加快猪繁殖与呼吸综合征大规模快速筛查的进程，可以进一步更精确指导动物免疫和科学用药。
2、本发明量子点荧光微球标记的双通道免疫层析检测卡应用基因重组的方法，筛选、制备了能够应用于免疫层析平台的猪繁殖与呼吸综合征重组N蛋白和重组GP5蛋白(即抗原)，工艺简单、产能高、成本低，从根本上降低免疫层析检测卡的制造成本，极大促进其在基层或一线养殖企业广泛应用。
3、本发明量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡选用新型的量子点纳米微球，可显著提高量子点的光稳定性、胶体稳定性及生物相容性，通过量子点荧光纳米微球标记，还能增加单位抗原/抗体标记量子点的数量，提高单位抗原/抗体标记量子点荧光信号，从而进一步提高检测灵敏度。同时，本发明通过定向标记途径，不仅可以使单位抗原/抗体定向标记的量子点纳米微球数量恒定，而且从技术层面优化了抗原/抗体和荧光信号标记物的空间排列，大大降低了非特异性吸附造成的系统性误差，极大提高了免疫层析技术平台的检测灵敏度和结果重现性，同时将CV值得到很好的优化，且CV值控制难度大大降低，使免疫层析技术检测猪繁殖与呼吸综合征抗体成为现实。
4、本发明量子点荧光微球标记的双通道免疫层析检测卡检测操作温度适应范围很宽，10～60℃范围内，稳定性测试一致。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为重组表达质粒pcDNA3.1(+)-N的结构示意图。
图2为重组表达质粒pcDNA3.1(+)-GP5的结构示意图。
图3为量子点荧光微球标记的双通道免疫层析试纸条的示意图。
图4为量子点荧光微球标记的双通道免疫层析检测卡及检测结果图。
图5为量子点荧光微球标记的双通道免疫层析检测卡N抗体检测Logistic拟合曲线图。
图6为量子点荧光微球标记的双通道免疫层析检测卡GP5抗体检测Logistic拟合曲线图。
图7为单量子点非特异性标记、检测线(T)单一包被重组N蛋白的单指标免疫层析检测卡N抗体检测Logistic拟合曲线图。
图8为量子点荧光微球非特异性标记、检测线(T)单一包被重组N蛋白的单指标免疫层析检测卡N抗体检测Logistic拟合曲线图。
图9为量子点荧光微球特异性标记、检测线(T)单一包被重组GP5蛋白的单指标免疫层析检测卡GP5抗体检测Logistic拟合曲线图。
图10为量子点荧光微球特异性标记、检测线(T)单一包被重组N蛋白的单指标免疫层析检测卡N抗体检测Logistic拟合曲线图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下述实施例中阳性样本为相应抗体和阴性血清混合配置。
实施例1高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)的重组GP5和N蛋白的制备
1.1材料
实验材料为市售或本实验室保存，其中测试阳性样本为相应抗体和阴性血清混合配置。
1.2构建重组表达质粒
1.2.1GP5和N的基因合成
选用Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，VR-2332病毒株为模板序列，其NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库GenBank中登录号是AY150564.1)，人工合成GP5和N基因序列(GP5基因序列如SEQ ID NO.3第13-612位，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1第1-200位所示的GP5蛋白；N基因序列如SEQ ID NO.4第13-381位所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2第1-123位所示的N蛋白)，5'端和3'端分别引入了BamHⅠ和EcoR I酶切位点(分别为GGATCC和GAATTC)，在BamHⅠ酶切位点后面ATG前面引入Kozak序列GCCACC，并在3'端引入His标签CACCACCACCACCACCAC和终止密码子TAG或TGA，所得序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
1.2.2pcDNA3.1(+)-GP5和pcDNA3.1(+)-N蛋白表达载体的构建
(1)以含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列(含GP5基因)的质粒为模板，用BamHⅠ和EcoR I酶切，琼脂糖凝胶电泳检测，然后胶回收，得到含GP5基因的目的片段；
(2)表达载体pcDNA3.1(+)用BamHⅠ和EcoR I酶切，琼脂糖凝胶电泳检测，然后胶回收，得到线性化的表达载体；
(3)将含GP5基因的目的片段和线性化的表达载体进行T4酶连接，得到连接产物；
(4)将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，鉴定，筛选阳性克隆,取质粒，得到重组表达质粒pcDNA3.1(+)-GP5，结构示意图如图1所示。
同理，将“以含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列(含GP5基因)的质粒”替换为以含SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列(含N基因)的质粒，其他步骤同上得到重组表达质粒pcDNA3.1(+)-N，结构示意图如图2所示。
1.2.3重组表达质粒pcDNA3.1(+)-GP5和pcDNA3.1(+)-N转染HEK293T细胞及瞬时表达
(1)提前一天将HEK293T细胞种植在6孔板，以转染时细胞密度在50％左右为宜。
(2)将3μg的重组表达质粒pcDNA3.1(+)-GP5或pcDNA3.1(+)-N用50μl无血清DMEM稀释液稀释，充分混匀，制成质粒稀释液。
(3)将3μl的EntransterTM-H用50μl无血清稀释液体稀释，充分混匀，室温静置5分钟，制成EntransterTM-H稀释液。
(4)将EntransterTM-H稀释液加入到质粒稀释液中，充分混匀(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上)，室温静置30分钟，制成转染复合物。
(5)将转染复合物加入到含HEK293T细胞和完全培养基的培养容器上，轻柔混匀。
(6)培养4-6小时后更换培养基，并在培养基中加入终浓度为700ug/mL G418继续培养48小时，得到细胞培养物。
1.3目的蛋白分离纯化、鉴定
1.3.1上清液收集
细胞培养物用超低温离心机15000g，离心10min，收集上清液过0.22μm滤膜，过滤后的上清液置于10mmol/L PBS(pH 7.4)，4℃中透析过12小时，得到透析液体。
1.3.2Ni-亲和层析分离纯化
(1)首先采用10mmol/L PBS(pH 7.4)平衡Ni-亲和层析柱，流速为1mL/min，平衡8～10倍柱体积。
(2)取透析液体以流速为1mL/min流速上柱，然后采用10mmol/L PBS(pH7.4)冲洗Ni-亲和层析柱，收集流出液。
(3)30mM咪唑、80mM咪唑、200mM咪唑,500mM咪唑的洗脱液进行梯度洗脱，流速为2mL/min，收集洗脱液。
(4)将收集的上清液、流出液和洗脱液进行鉴定。
1.3.3鉴定
经SDS-PAGE检测后，发现上清液有浓度很高且符合预期大小的目的蛋白条带，经上述亲和层析纯化后，发现洗脱液中有纯度很高的目的条带，流出液几乎没有目的蛋白条带。
1.3.4透析
洗脱液用10mM PB pH 7.7(透析液)，1000mL透析，12小时更换一次透析液，透析3次，最终得到重组GP5蛋白和重组N蛋白，其中，所述重组GP5蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述重组N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2、鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球的制备
A、生物素标记鼠抗猪IgG抗体(B·Ab)的制备：
①将鼠抗猪IgG抗体用0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)稀释到1mg/mL，交互用0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)对鼠抗猪IgG抗体充分透析，得到鼠抗猪IgG抗体溶液。
②用1mL二甲基亚砜(DMSO)溶解N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHSB)1mg，得到NHSB溶液。
③向1mL鼠抗猪IgG抗体溶液加入120μl NHSB溶液，在室温下持续搅拌，保温2小时。
④加入9.6μL 1M NH4Cl，在室温下搅拌10分钟，在4℃，用PBS(0.02M,pH7.4)充分透析，以除去游离的N-羟基琥珀酰亚胺生物素，得到透析后的样品。
⑤将透析后的样品上1mL的分子筛Sephadex G150柱，以PBS(0.02M,pH7.4)缓慢洗脱，收集1mL/管，生物素标记的鼠抗猪IgG抗体在1～3mL之间洗脱下来，超滤浓缩至终浓度为2mg/mL的生物素标记鼠抗猪IgG抗体溶液。
B、量子点荧光微球的选择：
选择粒径在30～50nM范围内，荧光效率大于70％的量子点荧光微球。
C、鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球(Ab·B·A·量子点荧光微球)的制备：
①向2.2mg生物素标记鼠抗猪IgG抗体溶液加1mg链霉亲和素溶液，在室温下持续搅拌20min。
②向步骤①反应后的溶液中继续加入32mg量子点荧光微球，在室温下持续搅拌20min。
③将步骤②反应后的溶液上5mL的分子筛Sephadex G200柱，以PBS(0.02M,pH7.4)缓慢洗脱，收集在6～10mL之间洗脱下来的洗脱液，1mL/管。
④在4℃，用PBS(0.02M,pH7.4)缓冲液充分透析。
⑤向步骤④加入5g/L的酪蛋白溶液至终浓度为0.2g/L，在37℃搅拌温育30分钟，然后12000g离心20分钟，弃上清，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次(复溶缓冲液为0.02M PBS，pH6.5～8.0，含有浓度为5g/L的牛血清白蛋白和7.5g/L的海藻糖)，最终用复溶缓冲液将沉淀重悬，得到至终浓度4mg/mL的鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球，在4℃下贮存备用，保存期限为60天。
实施例3、量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡的制备及使用
1、量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡的结构
量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡包括检测卡壳和装载于该检测卡壳内的试纸条，所述试纸条的结构示意图如图3所示，包括PVC背板及设置在PVC背板上的依次排列的样品垫、结合垫、反应垫和吸收垫，邻垫之间须部分重叠；所述反应垫上从靠近所述结合垫端到靠近所述吸收垫端依次设置相互平行的检测线T2线、检测线T1线和质控线C线，检测线T1线和检测线T2线之间的距离为4mm，检测线T1线、质控线C线之间的距离为3mm，检测线T1线和检测线T2线分别包被重组GP5蛋白和重组N蛋白；质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；结合垫含有鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球。
2、量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡的制备
2.1结合垫的制备
将玻璃纤维膜浸泡于含有浓度为1.5g/L的牛血清白蛋白的缓冲液(0.05M PB,pH7.5)中浸湿45秒，37℃干燥2h；
用点膜仪将终浓度为4mg/mL的鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球均匀喷涂在浸泡干燥后的玻璃纤维膜上，含量为4.0μg/cm2，得到结合垫，真空干燥、封装，4℃保存备用。
2.2反应垫的制备
用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)将重组GP5蛋白和重组N蛋白分别稀释到1mg/mL，用点膜仪将其分别划线包被于硝酸纤维素膜作为检测线T1线和检测线T2线，包被量为1.0μg/cm2，用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)将羊抗鼠IgG抗体稀释到500μg/mL，用点膜仪将其划线包被于硝酸纤维素膜作为质控线C线，包被量为0.5μg/cm2，再用含有浓度为1.5g/L的牛血清白蛋白的缓冲液(0.05M PB,pH7.5)划线进行封闭，检测线T1线、检测线T2线之间的距离为4.0mm，检测线T1线、质控线C线之间的距离为3.0mm，于37℃恒温烘干、封装，4℃保存备用。
2.3组装
依次将反应垫、吸收垫、结合垫和样本垫粘附在PVC背板上，邻垫之间须部分重叠(重叠0.5～1.0mm)，然后将制备好的试纸进行切割成3-4mm宽的试纸条，将试纸条装载于检测卡壳内(检测卡实物见图4)，用铝箔袋真空包装，在18-25℃有效期一年。
3、量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡的定量测试
1)Logistic拟合曲线的绘制
将1mg/mL的GP5和N抗体混合后用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)稀释成10倍后，再进行7次倍比稀释，然后用滴管滴入量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T1线和检测线T2线和质控线C线的荧光强度值，计算T1/C值和T2/C值(T1代表检测线T1线的荧光强度值，T2代表检测线T2线的荧光强度值，C代表质控线C线的荧光强度值)。
检测结果见表1，以浓度为横坐标、T2/C值或T1/C值为纵坐标通过ELISAcalc进行Logistic曲线拟合分析，计算得到检测N抗体的Logistic曲线拟合方程：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D(A＝2.81805，B＝-1.81473，C＝15.87687，D＝0.40842；r^2＝0.99709)，Logistic拟合曲线图见图5；计算得到检测GP5抗体的Logistic曲线拟合方程：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D(A＝2.87716，B＝-1.71495，C＝20.03599，D＝0.48098；r^2＝0.99852)，Logistic拟合曲线图见图6。
表1GP5和N抗体混合的检测结果
2)待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体和/或GP5抗体的浓度的检测：
将待测样本用滴管滴入量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T1线、检测线T2线和质控线C线的荧光强度值，计算T1/C值和T2/C值；
T1/C值带入检测GP5抗体的Logistic曲线拟合方程得出待测样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体的浓度；T2/C值带入检测N抗体的Logistic曲线拟合方程得出待测样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体的浓度。
4、量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡的定性测试
将灭活阴性血清用滴管滴入量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T1线、检测线T2线和质控线C线的荧光强度值，计算T1/C值和T2/C值(T1代表T1线的荧光强度值，T2代表T2线的荧光强度值，C代表C线的荧光强度值)，进行12次平行测试，最终计算T10/C0+2SD10和T20/C0+2SD20，其中，T10/C0代表灭活阴性血清12次平行测试的T1/C值的平均值，SD10代表灭活阴性血清12次平行测试的T1/C值的标准差，T20/C0代表灭活阴性血清12次平行测试的T2/C值的平均值T10/C0，SD20代表灭活阴性血清12次平行测试的T2/C值的标准差；
将待测样本用滴管滴入量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T1线、检测线T2线和质控线C线的荧光强度值，计算T1/C值和T2/C值，对结果进行判读，判读标准为：T1/C≥T10/C0+2SD10和/或T2/C≥T20/C0+2SD20，判定为阳性，其中，GP5和N抗体任意一项数值为阳性，即判定为阳性，即待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒；T1/C<T10/C0+2SD10和T2/C<T20/C0+2SD20，判定为阴性，其中GP5和N抗体2项数值全为阴性，才判定为阴性，即待测样本不含猪繁殖与呼吸综合征病毒。
检测结果见表2，T10/C0+2SD10＝0.407+0.008×2＝0.415(N抗体)，对应Cut off值＝0.61ng/mL，T20/C0+2SD20＝0.469+0.009×2＝0.487(GP5抗体)，对应Cut off值＝0.61ng/mL；即T1/C≥0.415和/或T2/C≥0.487，判定为阳性；T1/C<0.415和T2/C<0.487，判定为阴性。
表2灭活阴性血清的检测结果
5、量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡的特异性测试
将灭活的猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪口蹄疫病毒抗体样本用滴管滴入量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T1线、检测线T2线和质控线C线的荧光强度值，计算T1/C值和T2/C值，按“4、量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡的定性测试”的判读标准进行判读，从而检测检测卡的特异性。
检测结果见表3，结果显示本发明量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡对灭活的猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪口蹄疫病毒抗体阳性样本检测的结果均为阴性，且无交叉反应，特异性高。
表3常见猪病毒阳性样本检测结果
6、量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡的稳定性测试
在室温(25℃)、10℃、60℃，分别将GP5和N抗体混合后用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)稀释成5ng/mL，然后用滴管滴入量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T1线、检测线T2线和质控线C线的荧光强度值，做12个平行测试，计算T1/C值和T2/C值，确定CV值，考察温度对检测卡检测结果的影响；将检测卡在37℃，放置180天，室温(25℃)做12个平行测试，取T1/C值和T2/C值的平均值和同批次原始T1/C值和T2/C值的平均值进行对比，检验其高温存放后对性能的影响。
检测结果见表4、5，结果显示：环境温度10～60℃，检测结果的误差10％以内，37℃，放置180天破坏性试验结果推断，室温存放2年内，检测结果的误差在10％以内；批间差小于3％。
表4稳定性测试结果
注：浓度的单位为ng/mL，“1”代表新生产的检测卡的室温(25℃)检测结果，“2”代表新生产的检测卡37℃放置180天后的室温(25℃)检测结果，“3”代表新生产的检测卡10℃的检测结果，“4”代表新生产的检测卡60℃的检测结果。
表5稳定性统计结果
注：浓度的单位为ng/mL，对比例1、单量子点荧光非特异性标记、检测线(T)单一包被重组N蛋白的单指标免疫层析检测卡的制备及使用
1、检测卡的制备
该检测卡与实施例3中检测卡具有如下区别：
1)、只有一条检测线T线，T线包被重组N蛋白；
2)、结合垫含有鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球替换为结合垫含有单量子点荧光标记的鼠抗猪IgG抗体。
其中，单量子点荧光标记的鼠抗猪IgG抗体的制备方法如下：
用0.1M碳酸钾将量子点的pH值调至7.8，按3～5.5mg/mL的比例将量子点加入鼠抗猪IgG抗体中，用磁力搅拌器搅拌45min，加入5g/L的酪蛋白溶液至终浓度为0.2g/L，静置30min，12000rpm、4℃下离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次(复溶缓冲液为0.02M PBS，pH7.0～8.0；含有浓度为5.0g/L的牛血清白蛋白和5.0g/L的海藻糖)，沉淀再用复溶缓冲液溶解，得到终浓度为2.5mg/mL的单量子点荧光标记的鼠抗猪IgG抗体，在4℃下贮存备用，保存期限为60天。
反应垫的制备：用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)将重组N蛋白稀释到1mg/mL，用点膜仪将其划线包被于硝酸纤维素膜作为检测线T，包被量为1.0μg/cm2，用缓冲液(0.05MPB,pH7.5)将羊抗鼠IgG抗体稀释到500μg/mL，用点膜仪将其划线包被于纤维素膜作为质控线，包被量为0.5μg/cm2，再用含有浓度为1.5g/L的牛血清白蛋白的缓冲液(0.05MPB,pH7.5)划线进行封闭，T、C线之间的距离为8.0mm，然后于37℃恒温烘干、封装。
其它步骤同实施例3。
2、检测卡定量测试
1)Logistic拟合曲线的绘制
将1mg/mL的N抗体用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)稀释成10倍后，在进行7次倍比稀释，然后用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T线和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值(T代表T线的荧光强度值，C代表C线的荧光强度值)。
检测结果见表6，以浓度为横坐标、T/C值为纵坐标通过ELISAcalc进行Logistic曲线拟合分析，计算得到Logistic曲线拟合方程：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D(A＝52.61843，B＝-0.48939，C＝301457.19101，D＝0.14826；r^2＝0.96042),Logistic拟合曲线图见图7。
表6单量子点荧光非特异性标记、检测线(T)单一包被的检测卡N抗体检测结果
2)待测样本中N抗体的浓度的检测：
将待测样本用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值；
T/C值带入Logistic曲线拟合方程，计算得出待测样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体的浓度。
3、检测卡定性测试
将灭活阴性血清用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T线和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值(T代表T线的荧光强度值，C代表C线的荧光强度值)，进行12次平行测试，最终计算T0/C0+2SD0，其中，T0/C0代表灭活阴性血清12次平行测试T/C值的平均值，SD0代表灭活阴性血清12次平行测试的T/C值的标准差；
将待测样本用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T线和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值，对结果进行判读，判读标准为：T/C≥T0/C0+2SD0判定为阳性，即待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体；T/C<T0/C0+2SD0，判定为阴性，即待测样本不含猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体。
检测结果见表7，T0/C0+2SD＝0.507+0.124×2＝0.775，即T/C≥0.775，判定为阳性，T/C<0.775，判定为阴性。CV值为12.22％，Cut off值为36.38ng/mL。
表7单量子点非特异性标记、检测线(T)单一包被重组N蛋白的单指标免疫层析检测卡阴性样本检测结果
对比例2、量子点荧光微球非特异性标记、检测线(T)单一包被重组N蛋白的单指标免疫层析检测卡的制备及使用
1、检测卡的制备
该检测卡与实施例3中检测卡具有如下区别：
1)、结合垫含有鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球替换为结合垫含有量子点荧光微球非特异性标记的鼠抗猪IgG抗体；
2)、反应垫只有一条检测线，即T线，T线包被重组N蛋白。
其中，量子点荧光微球非特异性标记的鼠抗猪IgG抗体：用0.1M碳酸钾将量子点的pH值调至7.8，按3～5.5mg/mL的比例将量子点荧光微球加入鼠抗猪IgG抗体中，用磁力搅拌器搅拌45min，加入1.5％的酪蛋白至终浓度为0.2％，静置30min，12000rpm、4℃下离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次(复溶缓冲液为0.02M PBS，pH7.0～8.0；含有浓度为5.0g/L的牛血清白蛋白和5.0g/L的海藻糖)，沉淀再用复溶缓冲液溶解，得到重组鼠抗猪IgG抗体量子点荧光微球标记物至终浓度2.5mg/mL，在4℃下贮存备用，保存期限为60天。
反应垫的制备：用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)将重组N蛋白稀释到1mg/mL，用点膜仪将其划线包被于硝酸纤维素膜作为检测线T，包被量为1.0μg/cm2，用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)将羊抗鼠IgG抗体稀释到500μg/mL，用点膜仪将其划线包被于纤维素膜作为质控线，包被量为0.5μg/cm2，再用含有浓度为1.5g/L的牛血清白蛋白的缓冲液(0.05M PB,pH7.5)划线进行封闭，T、C线之间的距离为8.0mm，然后于37℃恒温烘干、封装。
其它步骤同实施例3。
2、检测卡的定量测试
1)Logistic拟合曲线的绘制
将1mg/mL的N抗体用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)稀释成10倍后，在进行7次倍比稀释，然后用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T线和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值(T代表T线的荧光强度值，C代表C线的荧光强度值)。
检测结果见表8，以浓度为横坐标、T/C值为纵坐标通过ELISAcalc进行Logistic曲线拟合分析，计算得到Logistic曲线拟合方程：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D(A＝3.09036，B＝-1.26133，C＝213.55945，D＝0.29747；r^2＝0.98654)，Logistic拟合曲线图见图8。
表8量子点荧光微球非特异性标记、检测线(T)单一包被重组N蛋白的单指标免疫层析检测卡N抗体检测结果
2)待测样本中N抗体的浓度的检测：
将待测样本用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值；
T/C值带入Logistic曲线拟合方程，计算得出待测样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体的浓度。
3、检测卡定性测试
将灭活阴性血清用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T线和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值(T代表T线的荧光强度值，C代表C线的荧光强度值)，进行12次平行测试最终计算T0/C0+2SD0，其中，T0/C0代表灭活阴性血清12次平行测试T/C值的平均值，SD0代表灭活阴性血清12次平行测试的T/C值的标准差；
将待测样本用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T线和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值，对结果进行判读，判读标准为：T/C≥T0/C0+2SD0判定为阳性，即待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体；T/C<T0/C0+2SD0，判定为阴性，即待测样本不含猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体。
检测结果见表9，T0/C0+2SD＝0.273+0.035×2＝0.343，即T/C≥0.343，判定为阳性，T/C<0.343，判定为阴性。CV值为12.82％，Cut off值为8.28ng/mL。
表9量子点荧光微球非特异性标记、检测线(T)单一包被重组N蛋白的单指标免疫层析检测卡阴性样本检测结果
对比例3、量子点荧光微球特异性标记、检测线(T)单一包被重组GP5蛋白的单指标免疫层析检测卡的制备及使用
1、检测卡的制备
该检测卡与实施例3中检测卡具有如下区别：
反应垫只有一条检测线T线，T线包被重组GP5蛋白。
反应垫的制备：用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)将重组GP5稀释到1mg/mL，用点膜仪将其划线包被于硝酸纤维素膜作为检测线T，包被量为1.0μg/cm2，用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)将羊抗鼠IgG抗体稀释到500μg/mL，用点膜仪将其划线包被于纤维素膜作为质控线，包被量为0.5μg/cm2，再用含有浓度为1.5g/L的牛血清白蛋白的缓冲液(0.05M PB,pH7.5)划线进行封闭，T、C线之间的距离为8.0mm，然后于37℃恒温烘干、封装。
其它步骤同对比例2。
2、检测卡定量测试
1)Logistic拟合曲线的绘制
将1mg/mL的GP5抗体用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)稀释成10倍后，在进行7次倍比稀释，然后用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T线和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值(T代表T线的荧光强度值，C代表C线的荧光强度值)。
检测结果见表10，以浓度为横坐标、T/C值为纵坐标通过ELISAcalc进行Logistic曲线拟合分析，计算得到Logistic曲线拟合方程：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D(A＝2.73108，B＝-2.32783，C＝15.67497，D＝0.49987；r^2＝0.99719),Logistic拟合曲线图见图9。
表10量子点荧光微球特异性标记、检测线(T)单一包被重组GP5的单指标免疫层析检测卡检测结果
2)待测样本中GP5抗体的浓度的检测：
将待测样本用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值；
T/C值带入Logistic曲线拟合方程，计算得出待测样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体的浓度。
3、检测卡定性测试
将灭活阴性血清用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T线和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值(T代表T线的荧光强度值，C代表C线的荧光强度值)，进行12次平行测试最终计算T0/C0+2SD0，其中，T0/C0代表灭活阴性血清12次平行测试T/C值的平均值，SD0代表灭活阴性血清12次平行测试的T/C值的标准差；
将待测样本用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T线和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值，对结果进行判读，判读标准为：T/C≥T0/C0+2SD0判定为阳性，即待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体；T/C<T0/C0+2SD0，判定为阴性，即待测样本不含猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体。
检测结果见表11，T0/C0+2SD＝0.477+0.013×2＝0.503，即T/C≥0.503，判定为阳性，T/C<0.503，判定为阴性。CV值为2.74％，Cut off值为0.93ng/mL。
表11灭活阴性血清的检测结果
对比例4、量子点荧光微球特异性标记、检测线(T)单一包被重组N蛋白的单指标免疫层析检测卡的制备及使用
1、检测卡的制备
该检测卡与实施例3中检测卡具有如下区别：
反应垫只有一条检测线T线，T线包被重组N蛋白。
反应垫的制备：用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)将重组N蛋白稀释到1mg/mL，用点膜仪将其划线包被于硝酸纤维素膜作为检测线T线，包被量为1.0μg/cm2，用缓冲液(0.05MPB,pH7.5)将羊抗鼠IgG抗体稀释到500μg/mL，用点膜仪将其划线包被于纤维素膜作为质控线，包被量为0.5μg/cm2，再用含有浓度为1.5g/L的牛血清白蛋白的缓冲液(0.05MPB,pH7.5)划线进行封闭，T、C线之间的距离为8.0mm，然后于37℃恒温烘干、封装。
其它步骤同实施例3。
2、检测卡定量测试
1)Logistic拟合曲线的绘制
将1mg/mL的GP5抗体用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)稀释成10倍后，在进行7次倍比稀释，然后用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T线和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值(T代表T线的荧光强度值，C代表C线的荧光强度值)。
检测结果见表12，以浓度为横坐标、T/C值为纵坐标通过ELISAcalc进行Logistic曲线拟合分析，计算得到Logistic曲线拟合方程：y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D(A＝2.76778，B＝-2.02438，C＝14.94657，D＝0.43765；r^2＝0.99578)，Logistic拟合曲线图见图10。
表12量子点荧光微球特异性标记、检测线(T)单一包被重组N蛋白的单指标免疫层析检测卡检测结果
2)待测样本中N抗体的浓度的检测：
将待测样本用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值；
T/C值带入Logistic曲线拟合方程，计算得出待测样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体的浓度。
3、检测卡定性测试
将灭活阴性血清用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T线和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值(T代表T线的荧光强度值，C代表C线的荧光强度值)，进行12次平行测试最终计算T0/C0+2SD0，其中，T0/C0代表灭活阴性血清12次平行测试T/C值的平均值，SD0代表灭活阴性血清12次平行测试的T/C值的标准差；
待测样本用滴管滴入检测卡对应的样本垫上方的上样孔内，每孔滴加3滴后计时，5min后采用干式荧光分析仪器检测(超过15min的样品检测判读无效)，采集检测线T线和质控线C线的荧光强度值，计算T/C值，对结果进行判读，判读标准为：T/C≥T0/C0+2SD0判定为阳性，即待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体；T/C<T0/C0+2SD0，判定为阴性，即待测样本不含猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体。
检测结果见表13，T0/C0+2SD＝0.422+0.010×2＝0.442，即T/C≥0.442，判定为阳性，T/C<0.442，判定为阴性。CV值为2.33％，Cut off值为0.67ng/mL。
表13灭活阴性血清的检测结果
试验例1定量检测
在室温(25℃)分别将随机浓度GP5和N抗体混合后用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)稀释，然后用实施例3的双通量免疫层析检测卡，采集T1线、T2和C线的荧光强度值，计算T1/C值或T2/C值，或用对比例1、对比例2、对比例3和对比例4的检测卡检测，采集T线和C线的荧光强度值，计算T/C值，通过“定量测试”得到GP5和N抗体的浓度，对检测结果进行分析。
检测结果见表14和表15，结果显示，实施例1的检测卡和对比例3和对比例4的检测卡检测的性能接近，无明显差异，说明双指标联合检测卡的性能是可靠的，可实现N抗体和GP5抗体高灵敏度联合定量检测，可以更精确指导动物免疫和科学用药；批间差均小于3％。对比例1的单量子点荧光非特异性标记的检测卡比对比例3的量子点荧光微球标记的检测卡的灵敏度低、线性范围更窄，说明单量子点荧光非特异性标记的检测卡比量子点荧光微球标记的检测卡的灵敏度低、线性范围更窄；对比例4的检测卡比对比例2的检测卡的灵敏度明显高10倍左右，并且Logistic曲线拟合方程r^2更高，差距明显，说明量子点荧光微球特异性标记比量子点荧光微球非特异性标记的灵敏度明显高10倍左右，并且Logistic曲线拟合方程r^2更高，差距明显。
表14双通量免疫层析检测卡和的单指标免疫层析检测卡的性能评价结果
注：浓度单位为ng/mL，“×”代表超出其检测范围。
表15双通量免疫层析检测卡和单指标免疫层析检测卡的性能评价统计结果
注：浓度单位为ng/mL，“×”代表超出其检测范围。
试验例2定性检测
在室温(25℃)分别将随机浓度N抗体混合后用缓冲液(0.05M PB,pH7.5)稀释，然后用实施例3的双通量免疫层析检测卡，采集T2线和C线的荧光强度值，计算T2/C值，或用对比例1、对比例2和对比例4的检测卡检测，采集T线和C线的荧光强度值，计算T/C值，通过来判定样本阴阳性，对检测结果进行定性分析。
检测结果见表16，结果显示，实施例3的检测卡和对比例4的检测卡定性判读结果一致，说明双指标联合检测卡的性能是可靠的，实施例3、对比例4和对比例1、对比例2检测卡在定性判读方面有明显的差异，但其检测结果差异和其灵敏度是一致的，说明本发明采用量子点荧光微球特异性标记制备检测卡可以大大提高阳性检出率。
表16双通量免疫层析检测卡和的单指标免疫层析检测卡的定性检测评价结果
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.一种量子点荧光微球标记的双通量免疫层析试纸条，所述试纸条包括PVC背板及设置在PVC背板上的依次排列的样品垫、结合垫、反应垫和吸收垫，邻垫之间须部分重叠，其特征在于，所述反应垫上从靠近所述结合垫端到靠近所述吸收垫端依次设置相互平行的检测线T2线、检测线T1线和质控线C线，检测线T1线和检测线T2线分别包被重组GP5蛋白和重组N蛋白，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；所述结合垫含有鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球；其中，
所述重组GP5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述重组N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的双通量免疫层析试纸条，其特征在于，所述量子点荧光微球选择粒径在30～50nM范围内，荧光效率大于70％的量子点荧光微球。
3.根据权利要求1所述的双通量免疫层析试纸条，其特征在于，所述检测线T1线和检测线T2线之间的距离为3～4mm，检测线T1线、质控线C线之间的距离为3～4mm。
4.根据权利要求1所述的双通量免疫层析试纸条，其特征在于，所述重组GP5蛋白和重组N蛋白分别在检测线T1线和检测线T2线上的包被量为0.8～1.5μg/cm2；优选的，所述羊抗鼠IgG抗体在质控线C线上的包被量为0.5～1.0μg/cm2。
5.根据权利要求1所述的双通量免疫层析试纸条，其特征在于，所述鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球在结合垫上的含量为2.0～6.0μg/cm2。
6.权利要求1-5任一所述的双通量免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
结合垫的制备：将鼠抗猪IgG抗体-生物素-亲和素复合物-量子点荧光微球均匀喷涂在浸泡后的玻璃纤维上，干燥，得到结合垫；
反应垫的制备：将重组GP5蛋白和重组N蛋白分别包被于硝酸纤维素膜作为检测线T1线和检测线T2线，将羊抗鼠IgG抗体包被于硝酸纤维素膜作为质控线C线，封闭，干燥，得到反应垫；
组装：依次将反应垫、吸收垫、结合垫和样本垫粘附在PVC背板上，邻垫之间部分重叠，切割，即得。
7.一种量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡，其特征在于，所述双通量免疫层析检测卡包括权利要求1-5任一所述的双通量免疫层析试纸条和装载权利要求1-5任一所述的双通量免疫层析试纸条的检测卡壳。
8.权利要求1-5所述的双通量免疫层析试纸条或权利要求7所述的双通量免疫层析检测卡在如下任一中的应用：
A、检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体和N抗体的浓度；
B、检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体的浓度；
C、检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体的浓度；
D、检测待测样本中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体和N抗体；
E、检测待测样本中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体；
F、检测待测样本中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体；
G、检测待测样本中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒。
9.一种检测待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体和/或N抗体的浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)建立Logistic拟合曲线方程：
将已知浓度的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和N抗体混合后稀释得样本稀释液，利用权利要求7所述的双通量免疫层析检测卡或权利要求1-5所述的双通量免疫层析试纸条分别对样品稀释液进行检测，采用干式荧光分析仪器采集检测线T1线、检测线T2线和质控线C线的荧光强度值，计算T1/C值和T2/C值；
以浓度为横坐标、T1/C值为纵坐标通过ELISAcalc进行Logistic曲线拟合分析，计算得到检测GP5抗体的Logistic曲线拟合方程，
以浓度为横坐标、T2/C值为纵坐标通过ELISAcalc进行Logistic曲线拟合分析，计算得到检测N抗体的Logistic曲线拟合方程；
2)待测样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体和/或GP5抗体的浓度的检测：
利用权利要求7所述的双通量免疫层析检测卡或权利要求1-5所述的双通量免疫层析试纸条对待测样本进行检测，采用干式荧光分析仪器采集检测线T1线、检测线T2线和质控线C线的荧光强度值，计算T1/C值和T2/C值，T1/C值带入检测GP5抗体的Logistic曲线拟合方程得出待测样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5抗体的浓度；T2/C值带入检测N抗体的Logistic曲线拟合方程得出待测样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒N抗体的浓度；
其中，T1代表检测线T1线的荧光强度值，T2代表检测线T2线的荧光强度值，C代表质控线C线的荧光强度值。
10.一种检测待测样本中是否含有猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将灭活阴性血清用权利要求7所述的双通量免疫层析检测卡或权利要求1-5所述的双通量免疫层析试纸条进行检测，采用干式荧光分析仪器采集检测线T1线、检测线T2线和质控线C线的荧光强度值，计算T1/C值和T2/C值，进行n次平行测试，最终计算T10/C0+2SD10和T20/C0+2SD20，其中，T10/C0代表T1/C值的平均值，SD10代表T1/C值的标准差，T20/C0代表T2/C值的平均值T10/C0，SD20代表T2/C值的标准差：
利用权利要求7所述的双通量免疫层析检测卡或权利要求1-5所述的双通量免疫层析试纸条对待测样本进行检测，采用干式荧光分析仪器采集检测线T1线、检测线T2线和质控线C线的荧光强度值，计算T1/C值和T2/C值，对结果进行判读，判读标准为：T1/C≥T10/C0+2SD10和/或T2/C≥T20/C0+2SD20，判定为阳性，即待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒；T1/C<T10/C0+2SD10和T2/C<T20/C0+2SD20，判定为阴性，即待测样本不含猪繁殖与呼吸综合征病毒；
其中，T1代表检测线T1线的荧光强度值，T2代表检测线T2线的荧光强度值，C代表质控线C线的荧光强度值，n≥3。
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