CN113252893A - 一种应用狂犬病毒g蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法、g蛋白的编码基因及试纸 - Google Patents

一种应用狂犬病毒g蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法、g蛋白的编码基因及试纸 Download PDF

Info

Publication number
CN113252893A
CN113252893A CN202110695172.5A CN202110695172A CN113252893A CN 113252893 A CN113252893 A CN 113252893A CN 202110695172 A CN202110695172 A CN 202110695172A CN 113252893 A CN113252893 A CN 113252893A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
rabies virus
antibody
serum
test paper
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110695172.5A
Other languages
English (en)
Inventor
邓柏林
赵浩军
郑雪莹
范君文
郑金来
谷传慧
李扬
郭俊林
李志军
于国际
王培�
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Standard Zai Hui Bio Technology Co ltd
Center For Animal Disease Control And Prevention Of Beijing
Original Assignee
Beijing Standard Zai Hui Bio Technology Co ltd
Center For Animal Disease Control And Prevention Of Beijing
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Standard Zai Hui Bio Technology Co ltd, Center For Animal Disease Control And Prevention Of Beijing filed Critical Beijing Standard Zai Hui Bio Technology Co ltd
Priority to CN202110695172.5A priority Critical patent/CN113252893A/zh
Publication of CN113252893A publication Critical patent/CN113252893A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/145—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus, Duvenhage virus, Mokola virus or vesicular stomatitis virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种应用狂犬病毒G蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法、G蛋白的编码基因及试纸，属于生物技术领域。以优化的狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，表达纯化获得G蛋白，以此G蛋白制成用于检测狂犬病病毒抗体的G蛋白胶体金试纸。该试纸从一端至另一端依次包括：样品垫、金垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫，其彼此相互重叠并贴于PVC底板的上表面。本发明的优点：不仅能够检测犬血清中的狂犬病病毒抗体，也可以检测猫血清中的狂犬病病毒抗体，且分离血清不用稀释；通过定量检测，可以准确获得狂犬病病毒抗体的浓度，对疫苗免疫效果的评价更客观准确。

Description

一种应用狂犬病毒G蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法、 G蛋白的编码基因及试纸
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用狂犬病毒G蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法、G蛋白的编码基因及试纸。
背景技术
狂犬病是目前致死率高达100%的疾病，暂时没有有效的治疗方法。对狂犬病的预防和控制，迄今为止最好的方法就是狂犬疫苗的接种。疫苗接种后，抗体效价的高低直接决定了免疫效果。因此，如何快速准确的评价抗体滴度效价是科研工作者要解决的问题。
目前，国际上通用的狂犬抗体检测方法有酶联免疫吸附试验、快速荧光灶抑制试验、中和免疫荧光试验、小鼠中和试验等。其中中和免疫荧光试验是公认的金标准的方法，但是该方法涉及细胞及病毒的培养、对环境和人员要求很高，无法方便、快速的对狂犬病毒抗体水平进行监测，不利于较大范围的推广和实施。狂犬病毒表达多种蛋白，比如N蛋白和G蛋白。N蛋白是核蛋白，由N蛋白免疫产生的抗体不具有中和活性。狂犬病G蛋白是决定RV致病性的主要因素,也是唯一的刺激机体产生中和抗体的抗原，所以监测G蛋白抗体更有意义。虽然，与中和免疫荧光试验相比而言，酶联免疫吸附试验操作简单，但是目前市售的酶联免疫吸附试验试剂盒都是采用N蛋白研制而成的，不能代表中和抗体的效价。
虽然G蛋白是唯一产生中和抗体的蛋白，但是该蛋白在天然状态下是以糖基化的形式存在。如果采用原核表达该蛋白，则无法进行糖基化修饰，不同于天然状态，因此只能选择真核表达方式进行表达。
免疫胶体金技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，使用方便，反应快速，能在15-20分钟内完成，便于基层和现场使用，具有成本低、标记物稳定等特点。如配合免疫层析定量分析仪可实现定量检测，便于人们对狂犬抗体效价的准确了解和评估。
专利申请人为获得稳定的、与天然状态相同的糖基化G蛋白，对G蛋白的基因序列进行了优化并采用真核表达方式进行表达，实验显示这种优化是成功的。除犬只外，宠物猫也被要求进行狂犬疫苗的免疫，因此也需检测猫的狂犬抗体效价。因此，研究者在以G蛋白研制胶体金试纸时，检测线上同时包被了鼠抗犬和鼠抗猫的抗体来实现犬和猫均可进行检测的目的。狂犬G蛋白抗体效价的高低反应了保护力的高低，因此准确测量抗体滴度效价对免疫效果的评估具有指导意义。为实现该目的，研究者配套免疫层析定量分析仪实现定量检测，可准确测量狂犬抗体的效价。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种应用狂犬病毒G蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法、G蛋白的编码基因及试纸。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种应用狂犬病毒G蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法，其中，
1）采用狂犬病毒G蛋白制成胶体金试纸；
2）取待测犬血清或猫血清70µL滴入试纸条中，反应15-20分钟；
3）启动KRD-105免疫层析定量分析仪，将反应后的试纸条插入仪器中进行检测；
4）免疫层析定量分析仪自动检测并给出狂犬抗体效价水平。
上述技术方案所述的检测狂犬病毒抗体的方法，其中：待测样品为犬血清或猫血清，不必稀释，可直接进行检测。
上述技术方案所述的检测狂犬病毒抗体的方法中狂犬病毒G蛋白的编码基因，其中：所述编码基因为人工优化了基因序列并在真核表达系统CHO-S细胞表达、纯化，使蛋白表达更稳定、产量更高，优化后的编码基因的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
上述技术方案所述的应用狂犬病毒G蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法中所用试纸，其中：所述试纸从一端至另一端依次包括：样品垫、金垫、包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜以及吸水垫，其彼此相互重叠并贴于PVC底板上。
所述金垫为重组表达的G蛋白经胶体金标记后喷在玻璃纤维素膜上，并干燥制成；
所述检测线为鼠抗犬二抗和鼠抗猫二抗的混合物；
所述质控线为G蛋白的单抗。
上述技术方案所述的试纸，其中：金垫上胶体金标记的狂犬病毒G蛋白的浓度为0.1-1.0mg/mL。
上述技术方案所述的试纸，其中：检测线包被的鼠抗犬和鼠抗猫IgG的单克隆抗体浓度为0.5-2.0mg /mL。
上述技术方案所述的试纸，其中，质控线包被的G蛋白抗体，浓度为0.5-2.0mg/mL。
本发明具有以下有益效果：
1、解决现有技术尤其是荧光抗体检测操作复杂，难以推广普及的问题；2、不仅能够检测犬血清中的狂犬抗体，也可以检测猫血清中的狂犬抗体；3、可以准确定量获得狂犬病抗体的浓度对疫苗免疫效果的评价更客观准确。
附图说明
图1为pcDNA3.1(+)-G重组表达载体的双酶切鉴定。
图2为pcDNA3.1(+)-G重组表达载体的双酶切后G基因测序鉴定
图3为湿转Western Blot检测结果。
图4为Ni离子亲和层析图。
图5为胶体金试纸条结果判定方式。
图6为免疫层析定量分析仪。
图7为不同犬血清抗体浓度显色反应后的灰度值趋势。
图8为不同猫血清抗体浓度显色反应后的灰度值趋势。
图9为胶体金试纸条的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明一种应用狂犬病毒G蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法、G蛋白的编码基因及试纸作进一步的说明。
本发明以下实施例中的操作步骤均按照本领域的一般操作步骤以及产品说明书中的操作步骤进行。
实施例1：狂犬病病毒G蛋白的制备与鉴定：
1.1材料：
供体质粒pcDNA3.1、大肠杆菌Mach1T1感受态细胞、DL2000 DNA Marker均购自、蛋白质分子质量标准均购自Takara公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶Hind Ⅲ、EcoRⅠ均购自NEB公司；CHO-S细胞购自Invitrogen公司；质粒小提试剂盒、DNA胶回收试剂盒、基因组提取试剂盒均购自Axygen公司；G蛋白的单抗购自北京三联博悦生物技术有限公司。
1.2方法：
1.2.1病毒G基因合成，及pcDNA3.1(+)-G重组表达载体的构建和鉴定：
参考 NC_001542.1（NCBI）和 P03524-strain ERA（UniProt），同时为了改善蛋白的稳定性并提高在真核生物的表达量，对基因序列进行了优化。基因序列如SEQ No.1所示（该序列对应的氨基酸序列为MGWSCIILFLVATATGVHSKFPIYTILDKLGPWS
PIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYILAIKMNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYRWLRTVKTTKESLVIISPSVADLDPYDRSLHSRVFPSGKCSGVAVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKWCPPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVRKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVRTWNEILPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLESSVIPLVHPLADPSTVFKDGDEAEDFVEVHLPDVHNQVSGVDLGLPNWGKYGGGGSHHHHHH）；在SEQ No.1所示基因对应氨基酸的前面添加了促进真核表达体系分泌表达的信号肽（MVPQALLFVPLLVFPLCFG），且在SEQ No.1所示基因中设计了含有利于后期纯化的His标签（HHHHHH）；然后与克隆载体pcDNA3.1(+)进行连接得到pcDNA3.1(+)-G重组表达载体，以上合成和连接过程由北京博迈德基因技术有限公司完成。
双酶切鉴定：将pcDNA3.1(+)-G重组表达载体5µL，Hind Ⅲ和EcoRⅠ各1µL，10×Buffer 4µL，混合在29µL ddH2O中，37℃作用2h，进行双酶切，如图1所示，并将酶切产物送北京博迈德基因技术有限公司进行测序分析，结果如图2所示。
1.2.2 CHO-S细胞电转：
将1×107CHO-S细胞和10ug重组质粒混匀于200µL电击杯中，1100v电击30ms后，取出电击后的细胞悬液于30mLCD08培养基中，37℃、5% CO2、65rpm、125mL摇瓶培养。
1.2.3 湿转Western Blot检测:
48h后 4000rpm 离心10min，收培养基和胞体，培养基电泳上样50uL，取适量胞体进行还原处理后上样50uL。SDS-PAGE结束后取胶进行转膜（300mA/1h），转膜后封闭1h，加Anti-6His-HRP抗体孵育1h后进行显色处理。结果显示目的蛋白进行了表达，并且在细胞与培养基中同时存在，如图3所示（图3为湿转Western Blot检测结果，其中图3A为在培养基中表达，图3B为在细胞中表达）。
1.2.4 狂犬病病毒重组G蛋白的纯化：
培养基共收集约60mL蛋白液，进行Ni柱亲和层析
首先使用0.44μm的滤膜对蛋白液进行过滤，将蛋白样品缓慢加入到纯化柱中，再用平衡液（PBS，pH7.2）平衡柱子，直到紫外吸收达到稳定基线；
洗脱：用5-10倍柱子体积的洗脱液（含0.5M Imidazole的PBS，pH7.2）洗脱，并收集洗脱液；
选用层析柱HisTrap FF，5mL（GE 货号：17531901），先用0.1M NaoH把柱子洗干净，然后用平衡液平衡，挂镍，再平衡4个柱体积，上样，上样后用平衡液冲洗3个柱体积，在用淋洗液冲洗3个柱体积，再用洗脱液先行洗脱，根据UV收集洗脱液，然后再用0.1M NaOH冲洗3个柱体积，用水冲洗3个柱体积，再用20%乙醇保存层析柱。Ni离子亲和层析图见图4（图4 为Ni离子亲和层析图）。
亲和纯化后的样品利用10KD超滤管进行超滤浓缩换液至1×PBS，终体积约500µL，约80μg，-20℃保存，得到的重组G蛋白即为人工合成狂犬病病毒G基因（RV-G基因）经重组质粒在真核表达系统CHO-S细胞表达、纯化后的G蛋白。使用NanoDrop2000超微量分光光度计外（Thermo）测定G蛋白浓度为1.3mg/mL。
实施例2：胶体金检测试纸条的制备和使用：
2.1胶体金溶液的制备及检验：155mL纯化水置磁力加热搅拌器上，加热搅拌直至沸腾。加入5mL 1%氯金酸溶液，煮沸后匀速搅动下加入6mL新配的1%柠檬酸三钠溶液，继续加热煮沸5分钟。停止加热，冷却至室温（15-25℃），2-8℃避光保存。应为红色澄清液体，无混浊和表面悬浮物；
2.2重组G蛋白的标记及检验：取1mL胶体金溶液于离心管中，转移到三角瓶中，加入15µL 0.2mol/L碳酸钾。取10μg实施例1纯化的重组G蛋白，加入到胶体金溶液中，迅速混匀，室温（15-25℃）放置30分钟。加入10µL 20%牛血清白蛋白溶液，混匀，室温（15-25℃）平衡5分钟。加入10µL 20% PEG20000溶液，混匀，室温（15-25℃）平衡30分钟。将金标抗体溶液转移至离心管中，以10000r/min离心10分钟，小心吸出上清液，弃去。向沉淀中加入100µL金标复溶液（含有2％蔗糖、1％酪蛋白、0.5％BSA、0.1 Triton X100、0.1％ SDS的硼酸缓冲液），混匀，2-8℃避光保存。应为红色澄清液体，无混浊和表面悬浮物；
2.3金垫的制备：取干净的玻璃纤维素膜，浸泡在金垫处理液中（含有1％蔗糖、0.5％BSA、0.1 Triton X100的硼酸缓冲液）。使玻璃纤维素膜全部浸湿，持续3分钟。取出，置干燥室（相对湿度≤30%）干燥过夜（16-24小时）。将标记好重组G蛋白与金标复溶液按照1∶1的比例混匀，用喷金划膜仪以8µL/cm的速度均匀喷在浸泡过的玻璃纤维素膜上，再干燥。金垫应颜色均匀，无污迹和折痕；
2.4硝酸纤维素包被膜的制备及检验，将NC膜裁成20mm×30cm的条状，拿出PVC板（30cm×6cm），板上有三条宽窄不等的双面胶条，窄的一边为上。将处于PVC板中间位置的双面胶条揭开，将裁好的空白NC膜正面朝上贴附于胶条上。用记号笔做标记，要求贴好空白膜的PVC板上有上下标示，并用喷金划膜仪进行划膜。点膜针头固定于NC膜的上方，轻微接触到NC膜，质控线（C线）距膜上端0.7cm，检测线（T线）距质控线（C线）0.7cm。用PBS（0.1mol/L，pH值7.2）将重组G蛋白的单抗（购自北京三联博悦生物技术有限公司）稀释至1.0mg/mL制备质控线（C线）；鼠抗犬IgG和鼠抗猫IgG分别稀释至1.0mg/mL后，等体积混合，制备检测线（T线）。喷金划膜仪的速度应设定为1.0µL/cm，将所划膜的板子置干燥室（相对湿度≤30%）干燥过夜（16-24小时）。干燥后，外观应洁白，膜正面呈光泽，与水接触应立即浸润，膜表面应无破损；
2.5样品垫的制备及检验：取玻璃纤维素膜置样品垫处理液（磷酸氢二钠：0.58％，磷酸二氢钾：0.052％，蔗糖：1.0％，tween-20：0.5mL/l，表面活性剂：1.0mL/l。）中浸泡完全。将浸泡完全的样品垫摆放在清洗干净的干燥网上，置干燥室（相对湿度≤30%）内干燥（16-24小时）。干燥后，样品垫表面应完整、整洁，质地均匀，厚度和宽度应一致；
2.6试纸条组装：在相对湿度≤30%的条件下，将金垫贴在已粘贴NC膜的PVC背板上，金垫上沿压着硝酸纤维素膜的下沿粘贴，并超过膜下沿0.1~0.2cm；将样品垫贴于金垫的下方，使样品垫与金垫重叠0.1~0.2cm，压平；贴吸水纸将已经贴好样品垫的底板最上方的双面胶条揭开，将吸水纸沿硝酸纤维素膜贴在膜的上方，使吸水垫与硝酸纤维素膜重叠0.1~0.2cm，压平。将已组装好的板子修剪整齐，装入塑料卡中压紧测试卡；试纸条的结构如图9所示；
2.7试纸条的使用方法及判定：在15~25℃的工作温度条件，吸取70µL待测血清，滴加到测试卡加样孔中，水平静置15~20分钟，进行判定（判定结果如图5所示）：
若在试纸条上仅出现一条红色条带（C线），则判为阴性结果（如图5A）；
若在试纸条上出现两条红色条带（T线和C线），则判为阳性结果（如图5B）；C线变红是由于胶体金标记的G蛋白和C线上的单抗反应后，引起胶体金的聚集而变红色；T线变红是由于二抗结合待测抗体，才能再结合G蛋白的反应，引起的胶体金的聚集而变红。
若在试纸条上C线处不出现红色条带，判为无效结果（如图5C和D）。
2.8 试纸条的定量读数检测：免疫层析定量分析仪如图6所示，使用可见光，通过建立抗体滴度和试纸条显色灰度值的相关性标准曲线，可以定量读取抗体浓度值，方便携带，操作简单。检测灵敏度能达到0.125U/mL。
样品来源：50份犬血清来自北京市某犬场，50份猫血清来自北京市动物医院。
样品的中和抗体检测结果来源：委托军事医学研究院军事兽医研究所（OIE狂犬病参考实验室）检测抗体效价，结果如表1和表2。
表1 军事兽医研究所检测某犬场50份犬血清的RV抗体值
Figure 581494DEST_PATH_IMAGE001
表2 军事兽医研究所检测动物医院50份猫血清的RV抗体值
Figure 905159DEST_PATH_IMAGE002
分别建立检测犬和猫血清狂犬病病毒抗体的标准曲线：
选取已知浓度的犬血清19号、31号、39号、44号，均取70µL，等体积混合，得出其浓度为8.545U/mL，取出140µL稀释到149.5µL，得到8U/mL，然后取70µL进行倍比稀释，一直到0.125U/mL。试纸条加样显色后，通过免疫层析定量分析仪进行灰度值读数，结果如表3，其散点趋势如图7所示，呈线性相关（y = 27.043x + 8.0771，R2 = 0.9932）。
表3 试纸条对犬血清不同浓度抗体检测后，检测分析仪对其显色灰度值的检测
Figure 216054DEST_PATH_IMAGE003
同理，选取已知浓度的猫血清5号、13号、21号、41号，均取70µL，等体积混合，得出其浓度为8.3625U/mL，取出140µL稀释到146.3µL，得到8U/mL，然后取70µL进行倍比稀释，一直到0.125U/mL。试纸条加样显色后，通过免疫层析定量分析仪进行灰度值读数，结果如表4，其散点趋势如图8所示，呈线性相关（y = 26.152x + 7.8942， R2 = 0.9926）。
表4 试纸条对猫血清不同浓度抗体检测后，检测分析仪对其显色灰度值的检测
Figure 17788DEST_PATH_IMAGE004
免疫层析定量分析仪已经设置了检测犬或者猫血清中抗体的相关性函数，检测前选择血清来源。
实施例3：试纸条质量的评估：
3.1 特异性：
检测胶体金试纸条对常见病毒的特异识别，如乙型脑炎病毒、流感病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、猫细小病毒、猫杯状病毒。
材料与方法：收集到含有以下病毒抗体阳性的血清各100µL：乙型脑炎病毒、H3N2、犬瘟热病毒、犬细小病毒、猫细小病毒、猫杯状病毒、狂犬病病毒（分别来自犬和猫），以上血清均来自北京市动物疫病预防控制中心，使用SPF犬血清、健康猫（用病原学和血清学两种方法检测常见感染病毒，均为阴性的健康猫）血清作为阴性对照；按照胶体金试纸条使用条件，分别滴入试纸条的样品孔中。
结果显示只有来自犬和猫的狂犬病病毒抗体阳性的血清样品判定为阳性，其他均为阴性，说明本试纸具有较好的特异性。
3.2 试纸条定量检测结果和中和抗体检测结果比较：
使用免疫层析定量分析仪检测已知浓度的犬、猫血清样品，得出如下结果，如表5、表6所示。
表5 50份犬血清：分析仪检测抗体值对比OIE参考实验室检测的结果
犬血清编号 OIE实验室检测抗体值（U/mL） 免疫层析分析仪检测抗体值（U/mL）
1 3.42 3.20
2 1.5 1.61
3 4.5 4.77
4 4.5 4.25
5 0.38 0.30
6 3.42 3.64
7 4.5 4.78
8 1.14 1.22
9 1.14 1.06
10 3.42 3.23
11 1.14 1.22
12 1.14 1.05
13 0.22 0.18
14 1.14 1.23
15 0.87 0.93
16 0.66 0.71
17 0.22 0.28
18 1.97 2.10
19 5.92 6.28
20 1.97 1.82
21 1.14 1.22
22 0.66 0.61
23 2.6 2.77
24 0.29 0.22
25 4.5 4.27
26 0.17 0.21
27 1.5 1.60
28 0.66 0.71
29 1.14 1.06
30 1.5 1.41
31 10.26 12.31
32 4.5 4.77
33 0.87 0.81
34 0.5 0.55
35 0.5 0.46
36 1.5 1.62
37 0.5 0.45
38 1.5 1.43
39 13.5 16.34
40 1.97 2.12
41 3.42 3.21
42 1.97 1.85
43 2.6 2.78
44 4.5 4.23
45 0.5 0.55
46 0.5 0.56
47 1.5 1.62
48 0.5 0.55
49 1.14 1.23
50 3.42 3.63
表6 50份猫血清：分析仪检测抗体值对比OIE参考实验室检测的结果
猫血清编号 OIE实验室检测抗体值（U/mL） 免疫层析分析仪检测抗体值（U/mL）
1 1.72 1.78
2 0.9 0.93
3 0.29 0.33
4 1.39 1.44
5 11.23 11.4
6 3.88 3.99
7 1.98 2.1
8 0.24 0.2
9 1.54 1.6
10 1.77 1.9
11 1.34 1.4
12 1.58 1.67
13 4.45 4.55
14 1.66 1.72
15 5.87 5.69
16 2.89 2.96
17 3.68 3.6
18 0.54 0.6
19 10.13 10.28
20 3.45 3.55
21 7.64 7.43
22 0.55 0.58
23 0.21 0.25
24 3.76 3.83
25 1.89 1.97
26 1.69 1.8
27 1.32 1.3
28 0.28 0.24
29 1.89 1.94
30 2.5 2.45
31 0.76 0.74
32 2.97 2.9
33 1.69 1.77
34 1.78 1.93
35 1.17 1.2
36 2.66 2.74
37 0.88 0.93
38 1.5 1.58
39 0.43 0.46
40 1.92 1.99
41 4.83 4.94
42 3.4 3.52
43 1.98 2.14
44 0.58 0.54
45 2.97 3.09
46 1.17 1.22
47 2.74 2.8
48 0.74 0.72
49 2.3 2.41
50 0.68 0.7
3.3 敏感性：
选用已知浓度（OIE狂犬病参考实验室检测）犬血清10份，即编号为26、24、5、35、16、33、47、23、10、19，抗体值分别为0.17U/mL、0.29U/mL、0.38U/mL、0.5U/mL、0.66U/mL、0.87U/mL、1.5U/mL、2.6U/mL、3.42U/mL、5.92U/mL，SPF犬血清作阴性对照。
结果显示：SPF犬血清的检测结果为阴性；抗体值为0.5U/mL以上（含0.5U/mL）的血清均能明确判定为阳性；抗体值为0.5U/mL以下的3份血清：26、24、5，均判定为阴性。
同理，选用已知浓度（OIE狂犬病参考实验室检测）猫犬血清10份，即编号为23、8、28、3、39、18、22、44、50、48，抗体值分别为0.21U/mL、0.24U/mL、0.28U/mL、0.29U/mL、0.43U/mL、0.54U/mL、0.55U/mL、0.58U/mL、0.68U/mL、0.74U/mL，健康猫的血清作阴性对照。
结果显示：健康猫的血清的检测结果为阴性；抗体值为0.5U/mL以上（含0.5U/mL）的血清均能明确判定为阳性；抗体值为0.5U/mL以下的5份血清：23、8、28、3、39，均判定为阴性。
3.4 重复性：
用同一批次内的试纸条检测相同狂犬病毒IgG抗体阳性的犬、猫血清各三份，检测结果均为阳性，用同一批次内的试纸卡检测相同狂犬病毒IgG抗体阴性的犬、猫血清各三份，检测结果均为阴性。重复三次的检测结果相同。
用不同批次的试纸条检测相同狂犬病毒IgG抗体阳性的犬、猫血清各三份，检测结果均为阳性，不同批次内的试纸卡检测相同狂犬病毒IgG抗体阴性的犬、猫血清各三份，检测结果均为阴性，重复三次的检测结果相同。
表明试纸重复性好。
3.5 临床样品检测方法比对：
收集100份犬血清样品，分别使用本试纸条和ELISA试剂盒（辛百克斯和唐山怡安）进行检测，其中试纸条共检测出阳性样品75份，阴性样品25份，辛百克斯ELISA试剂盒共检测出阳性样品78份，阴性样品22份；唐山怡安ELISA试剂盒共检测出阳性样品76份，阴性样品24份，详见表7。
结果显示：本试纸条和辛百克斯ELISA试剂盒总符合率为93%，和唐山怡安ELISA试剂盒总符合率为91%。
表7：犬血清中狂犬病病毒抗体检测方法比对（本试纸条和ELISA试剂盒）
Figure 363319DEST_PATH_IMAGE005
本试纸条和辛百克斯ELISA试剂盒总符合率=（73+20）/100*100%=93%。
本试纸条和唐山怡安ELISA试剂盒总符合率=（71+20）/100*100%=91%。
同理，将收集到的100份猫血清样品，分别使用本试纸条和ELISA试剂盒（辛百克斯和唐山怡安）进行检测，其中试纸条共检测出阳性样品80份，阴性样品20份，辛百克斯ELISA试剂盒共检测出阳性样品79份，阴性样品21份；唐山怡安ELISA试剂盒共检测出阳性样品75份，阴性样品25份，详见表8。
结果显示：本试纸条和辛百克斯ELISA试剂盒总符合率为91%，和唐山怡安ELISA试剂盒总符合率为89%。
表8：猫血清中狂犬病病毒抗体检测方法比对（本试纸条和ELISA试剂盒）
Figure 451361DEST_PATH_IMAGE006
本试纸条和辛百克斯ELISA试剂盒总符合率=（75+16）/100*100%=91%。
本试纸条和唐山怡安ELISA试剂盒总符合率=（72+17）/100*100%=89%。
3.6性状：
铝箔袋应封闭良好，表面光洁、无裂纹，内附干燥剂一包；试纸条塑料外壳应无破损、表面光洁，试纸条样品孔和检测窗口应清洁、无异物，检测窗口应位置适中，C、T标识清晰。
3.7保存：
试纸条应在2~30℃保存，暂定保存时间应不超过12个月。
实施例4：本方法与现有方法的比较
4.1 与酶联免疫吸附试验比较：本方法与市售唐山怡安ELISA试剂盒的比较结果如表9所示。
表9 本方法与市售唐山怡安ELISA试剂盒比较
Figure 390498DEST_PATH_IMAGE007
4.2 本方法与中和抗体荧光方法比较的结果如表10所示。
表10 本方法与中和抗体荧光方法的比较
Figure 995923DEST_PATH_IMAGE008
不论是与常用的ELISA试剂盒，还是金标准的荧光中和抗体方法进行比较，本方法操作简单、检测快速、实现定量检测，利于推广和使用。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京市动物疫病预防控制中心
北京标驰泽惠生物科技有限公司
<120> 一种应用狂犬病毒G蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法、G蛋白的编码基因及试纸
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1431
<212> DNA
<213> Rabies virus
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1431)
<400> 1
aagcttgcca ccatgggctg gagctgcatc atcctgtttc tggtggctac cgctaccggc 60
gtgcacagca agtttcctat ctacaccatc ctggacaagc tgggcccttg gagccctatc 120
gatatccacc acctgtcctg ccctaacaat ctggtggtgg aggatgaggg ctgtaccaat 180
ctgtccggct tttcctatat ggagctgaag gtgggctata tcctggccat caagatgaat 240
ggcttcacct gcaccggcgt ggtgaccgag gctgagacct acaccaattt cgtgggctat 300
gtgaccacca ccttcaagcg gaagcacttt cggcctaccc ctgacgcctg cagggccgct 360
tataactgga agatggctgg cgaccctcgg tatgaggaga gcctgcacaa cccttaccct 420
gattacaggt ggctgaggac cgtgaagacc accaaggagt ccctggtgat catctccccc 480
tccgtggctg acctggaccc ttacgatagg tccctgcaca gccgggtgtt cccttccggc 540
aagtgcagcg gcgtggccgt gagctccacc tactgctcca ccaaccacga ctacaccatc 600
tggatgcccg agaaccccag gctgggcatg tcctgcgaca tcttcaccaa tagccggggc 660
aagagggcca gcaagggcag cgagacctgc ggctttgtgg atgagcgggg cctgtacaag 720
agcctgaagg gcgcttgtaa gctgaagctg tgtggcgtgc tgggcctgcg gctgatggat 780
ggcacctggg tggccatgca gacctccaat gagaccaagt ggtgccctcc tgatcagctg 840
gtgaacctgc acgactttag gtccgacgag atcgagcacc tggtggtgga agagctggtg 900
aggaagcggg aggagtgcct ggatgccctg gagagcatca tgaccaccaa gtccgtgagc 960
tttaggcggc tgtcccacct gaggaagctg gtgcccggct tcggcaaggc ttacaccatc 1020
tttaacaaga ccctgatgga ggccgacgcc cactacaaga gcgtgcggac ctggaacgag 1080
atcctgccta gcaagggctg tctgcgggtg ggcggcaggt gccatcctca cgtgaacggc 1140
gtgtttttca acggcatcat cctgggcccc gacggcaatg tgctgatccc tgagatgcag 1200
agcagcctgc tgcagcagca catggagctg ctggagagca gcgtgatccc cctggtgcac 1260
cccctggctg atccctccac cgtgttcaag gatggcgatg aggctgagga tttcgtggag 1320
gtgcacctgc ccgacgtgca caatcaggtg agcggcgtgg acctgggcct gccaaattgg 1380
ggcaagtacg gcggcggcgg cagccatcac caccaccatc actgagaatt c 1431

Claims (7)

1.一种应用狂犬病毒G蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法，其特征在于，
1）采用狂犬病毒G蛋白制成胶体金试纸；
2）取待测犬血清或猫血清70µL滴入试纸条中，反应15-20分钟；
3）启动KRD-105免疫层析定量分析仪，将反应后的试纸条插入仪器中进行检测；
4）免疫层析定量分析仪自动检测并给出狂犬抗体效价水平。
2.根据权利要求1所述的检测狂犬病毒抗体的方法，其特征在于：待测样品为犬血清或猫血清，不必稀释，可直接进行检测。
3.权利要求1所述的检测狂犬病毒抗体的方法中狂犬病毒G蛋白的编码基因，其特征在于：所述编码基因为人工优化了基因序列并在真核表达系统CHO-S细胞表达、纯化，使蛋白表达更稳定、产量更高，优化后的编码基因的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
4.权利要求1所述的应用狂犬病毒G蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法中所用试纸，其特征在于：所述试纸从一端至另一端依次包括：样品垫、金垫、包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜以及吸水垫，其彼此相互重叠并贴于PVC底板上；
所述金垫为重组表达的G蛋白经胶体金标记后喷在玻璃纤维素膜上，并干燥制成；
所述检测线为鼠抗犬二抗和鼠抗猫二抗的混合物；
所述质控线为G蛋白的单抗。
5.根据权利要求4所述的试纸，其特征在于：金垫上胶体金标记的狂犬病毒G蛋白的浓度为0.1-1.0mg/mL。
6.根据权利要求4所述的试纸，其特征在于：检测线包被的鼠抗犬和鼠抗猫IgG的单克隆抗体浓度为0.5-2.0mg /mL。
7.根据权利要求4所述的试纸，其特征在于，质控线包被的G蛋白抗体，浓度为0.5-2.0mg/mL。
CN202110695172.5A 2021-06-23 2021-06-23 一种应用狂犬病毒g蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法、g蛋白的编码基因及试纸 Pending CN113252893A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110695172.5A CN113252893A (zh) 2021-06-23 2021-06-23 一种应用狂犬病毒g蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法、g蛋白的编码基因及试纸

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110695172.5A CN113252893A (zh) 2021-06-23 2021-06-23 一种应用狂犬病毒g蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法、g蛋白的编码基因及试纸

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113252893A true CN113252893A (zh) 2021-08-13

Family

ID=77189299

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110695172.5A Pending CN113252893A (zh) 2021-06-23 2021-06-23 一种应用狂犬病毒g蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法、g蛋白的编码基因及试纸

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113252893A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116063410A (zh) * 2022-10-20 2023-05-05 北京标驰泽惠生物科技有限公司 一种狂犬病毒g蛋白的突变体及其应用
WO2023245885A1 (zh) * 2022-06-21 2023-12-28 龙湖现代免疫实验室 一种狂犬病毒的单克隆抗体2f2及通用型狂犬病毒抗体快速检测试纸

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1035126A (zh) * 1987-12-26 1989-08-30 财团法人化学及血清疗法研究所 编码狂犬病毒糖蛋白的基因片段及用此片段制备狂犬病毒糖蛋白的方法
CN1963509A (zh) * 2005-11-10 2007-05-16 北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司 一种狂犬病毒保护性抗体胶体金检测试纸条
CN101029894A (zh) * 2007-04-04 2007-09-05 长春西诺生物科技有限公司 动物狂犬病毒抗体双抗原夹心胶体金检测试纸及制备方法
CN101852803A (zh) * 2010-06-11 2010-10-06 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种用于检测犬、猫的狂犬病毒抗体的胶体金试纸卡及其制备方法和应用
CN103954777A (zh) * 2014-05-20 2014-07-30 北京凯思百奥科技发展有限公司 一种狂犬病病毒单克隆抗体及其应用
CN104928302A (zh) * 2015-05-22 2015-09-23 华南农业大学 一株通过基因修饰以优化表达后的狂犬病病毒糖蛋白及其单克隆抗体和应用
CN109627295A (zh) * 2018-12-29 2019-04-16 四川大学 一种通用型狂犬病相关病毒g蛋白胞外段的制备方法
CN110093360A (zh) * 2019-04-15 2019-08-06 华南农业大学 一种表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法
CN110156878A (zh) * 2019-05-24 2019-08-23 北京标驰泽惠生物科技有限公司 猪伪狂犬病毒gE-gI蛋白及其表达质粒、制备方法和应用
CN110269933A (zh) * 2019-07-17 2019-09-24 苏州世诺生物技术有限公司 一种狂犬病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用
CN110981968A (zh) * 2019-12-17 2020-04-10 天康生物(上海)有限公司 含有狂犬病病毒g蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
CN112142851A (zh) * 2019-06-28 2020-12-29 浙江海隆生物科技有限公司 一种狂犬病毒表面的亚单位融合蛋白tG及其制备方法和应用
CN112210565A (zh) * 2020-10-15 2021-01-12 中国科学院深圳先进技术研究院 一种新型g基因及其在高效逆向跨单突触中的应用
CN112430273A (zh) * 2019-08-26 2021-03-02 浙江海隆生物科技有限公司 一种狂犬病毒表面的亚单位融合蛋白mG及其制备方法和应用

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1035126A (zh) * 1987-12-26 1989-08-30 财团法人化学及血清疗法研究所 编码狂犬病毒糖蛋白的基因片段及用此片段制备狂犬病毒糖蛋白的方法
CN1963509A (zh) * 2005-11-10 2007-05-16 北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司 一种狂犬病毒保护性抗体胶体金检测试纸条
CN101029894A (zh) * 2007-04-04 2007-09-05 长春西诺生物科技有限公司 动物狂犬病毒抗体双抗原夹心胶体金检测试纸及制备方法
CN101852803A (zh) * 2010-06-11 2010-10-06 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种用于检测犬、猫的狂犬病毒抗体的胶体金试纸卡及其制备方法和应用
CN103954777A (zh) * 2014-05-20 2014-07-30 北京凯思百奥科技发展有限公司 一种狂犬病病毒单克隆抗体及其应用
CN104928302A (zh) * 2015-05-22 2015-09-23 华南农业大学 一株通过基因修饰以优化表达后的狂犬病病毒糖蛋白及其单克隆抗体和应用
CN109627295A (zh) * 2018-12-29 2019-04-16 四川大学 一种通用型狂犬病相关病毒g蛋白胞外段的制备方法
CN110093360A (zh) * 2019-04-15 2019-08-06 华南农业大学 一种表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法
CN110156878A (zh) * 2019-05-24 2019-08-23 北京标驰泽惠生物科技有限公司 猪伪狂犬病毒gE-gI蛋白及其表达质粒、制备方法和应用
CN112142851A (zh) * 2019-06-28 2020-12-29 浙江海隆生物科技有限公司 一种狂犬病毒表面的亚单位融合蛋白tG及其制备方法和应用
CN110269933A (zh) * 2019-07-17 2019-09-24 苏州世诺生物技术有限公司 一种狂犬病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用
CN112430273A (zh) * 2019-08-26 2021-03-02 浙江海隆生物科技有限公司 一种狂犬病毒表面的亚单位融合蛋白mG及其制备方法和应用
CN110981968A (zh) * 2019-12-17 2020-04-10 天康生物(上海)有限公司 含有狂犬病病毒g蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
CN112210565A (zh) * 2020-10-15 2021-01-12 中国科学院深圳先进技术研究院 一种新型g基因及其在高效逆向跨单突触中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RONGQING ZHAO ET AL.: "Novel strategy for expression and characterization of rabies virus glycoprotein", 《PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023245885A1 (zh) * 2022-06-21 2023-12-28 龙湖现代免疫实验室 一种狂犬病毒的单克隆抗体2f2及通用型狂犬病毒抗体快速检测试纸
CN116063410A (zh) * 2022-10-20 2023-05-05 北京标驰泽惠生物科技有限公司 一种狂犬病毒g蛋白的突变体及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2402755B1 (en) Methods and compositions for detecting Herpes simplex virus type 2
CN111398603A (zh) 一种用于检测新型冠状病毒抗体的试纸条、制备方法及其应用
CN113252893A (zh) 一种应用狂犬病毒g蛋白快速定量检测狂犬病毒抗体的方法、g蛋白的编码基因及试纸
CN109406778B (zh) 一种检测烟叶中青枯病菌的时间分辨荧光定量试纸条及其制备方法和应用
CN112946260B (zh) 检测新冠肺炎病毒抗体的荧光免疫层析试剂及其制备方法
JP2023011764A (ja) レクチンの固定化方法
CN116068175A (zh) 一种基于e2蛋白二聚体的猪瘟病毒管式化学发光抗体检测试剂盒及其应用
CN113125753B (zh) 一种用于检测尘螨组分特异性抗体的试剂盒
CN114544934A (zh) 一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条及其应用
CN113514636A (zh) 一种新冠中和抗体荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法
CN117074671A (zh) 一种用于检测马传染性贫血病毒抗体的试剂盒
CN113075409B (zh) 一种γ干扰素试剂条、制备方法及其制备装置
CN114878809A (zh) 产气荚膜梭菌α毒素抗体荧光微球免疫层析检测试剂盒及其制备方法
CN116063410B (zh) 一种狂犬病毒g蛋白的突变体及其应用
CN110702925A (zh) 同时检测csfv、ppv、jev、prrsv抗体的荧光标记蛋白芯片制备和检测方法
JPH11346768A (ja) イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド蛋白質の抗原性を有する蛋白質及び抗イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド蛋白質抗体測定試薬
CN112903997B (zh) EB病毒衣壳抗原IgA抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法
CN113917134B (zh) 用于检测肝片形吸虫病抗体的免疫胶体金试纸条及其制备方法和应用
CN112903998B (zh) EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法
CN118010992A (zh) 新孢子虫融合蛋白作为新孢子虫检测抗原中的应用
CN116559450A (zh) 时间分辨荧光免疫层析法定量检测tk1的试剂盒及其应用
CN113637726A (zh) 一种牛支原体核酸检测胶体金免疫试纸条及其应用
CN115951049A (zh) 一种量子点荧光微球标记的双通量免疫层析检测卡及其应用
CN116735872A (zh) 一种用于检测犬埃里希体抗体的试剂盒
CN118010991A (zh) 鸡球虫棒状体蛋白家族中的rop35蛋白作为鸡球虫抗体检测中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210813