CN110093360A

CN110093360A - 一种表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法

Info

Publication number: CN110093360A
Application number: CN201910300524.5A
Authority: CN
Inventors: 郭霄峰; 范汝琪; 罗均; 王扬; 吕子煜; 张博越; 吴玉婷; 何红玲; 姜贺; 陈路漫
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2019-04-15
Publication date: 2019-08-06
Anticipated expiration: 2039-04-15
Also published as: CN110093360B

Abstract

本发明公开了一种表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法。其中编码融合表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；融合表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明首次融合表达了狂犬病病毒G蛋白与Fc片段。本发明利用杆状病毒表达系统构建的重组杆状病毒对外源蛋白表达稳定，而且其效价稳定。该融蛋白因融合了Fc片段，能利跨越粘膜屏障，转运到粘膜固有层，被抗原递呈细胞摄取后，再递呈给T细胞，引起机体的适应性免疫，这将为狂犬病口服疫苗的研究和制备提供一个新的策略，在狂犬病的防治方面具有广阔的研究前景。

Description

一种表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法。

背景技术

狂犬病作为一种重大的人畜共患病，遍及世界大部分地区，全世界一半以上人口居住的国家都有狂犬病流行，一旦出现临床症状，致死率几乎100％。它是由弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)中一种具有囊膜的狂犬病病毒(RABV)引起的致死性、高度嗜神经性人兽共患烈性传染病。

99％的人狂犬病感染都来自病犬，狂犬病通过感染家畜和野生动物经咬伤或抓伤(通常经由唾液)传播至人。全球每年约有60,000的人死于狂犬病，特别是在非洲和亚洲地区，在美洲蝙蝠是主要的感染来源。最近几年，在澳大利亚和西欧也有从蝙蝠传播给人的报道。此外，狐狸、浣熊、臭鼬、豺狼、猫鼬和其他食肉动物也能传播狂犬病，但几率较低。因此控制犬的狂犬病，特别是对流浪犬只的管理，是预防人间狂犬病的关键所在。

据WHO报道，犬免疫接种率达到70％就足以控制犬间传播的狂犬病。但是《中国狂犬病防治现状》中的数据表明，全国约有犬7500万，其中农村地区散养的犬、猫占90％～95％，极易发生动物间疫病传播及动物伤亡情况。此外，调查表明，我国农村地区犬和猫免疫率极低不足以形成免疫屏障，而且，我国狂犬病病例多未进行暴露后处理或处理不规范。因此，面对这种极为严峻的形势，唯一简便有效的方法就是研制口服疫苗建立免疫群，达到消除狂犬病的目的。但是，造成我们狂犬病免疫不足的一个很重要的原因是目前狂犬病的免疫方法是目前针对狂犬病的免疫方式是注射免疫，注射疫苗要严格遵循动物医生制定的免疫时间表，定期去专业机构进行注射。因此目前缺乏一种更简便的免疫方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法。

本发明的第一个目是提供一种编码融合表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的基因。

本发明的第二个目是提供一种融合表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的蛋白。

本发明的第三个目是提供一种重组载体。

本发明的第四个目是提供一种重组杆状病毒。

本发明的第五个目是提供一种重组细胞。

本发明的第六个目是提供所述蛋白的制备方法。

本发明的第七个目是提供权所述基因、所述蛋白、所述重组载体、所述重组杆状病毒、或所述重组细胞中的一种或几种在制备狂犬病疫苗中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明将能刺激机体产生中和抗体的狂犬病病毒G蛋白与IgG2a Fc通过杆状病毒Bac To Bac真核表达系统融合表达的制备方法，以期给狂犬病病毒口服疫苗提供研究基础。

RABV编码5种结构蛋白质，分别是核蛋白(N)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，跨膜糖蛋白(G)，病毒聚合酶蛋白(L)。G蛋白是唯一刺激机体产生中和抗体的表面抗原，同时也能诱导T细胞，刺激机体产生细胞免疫产生中和抗体，中和抗体能在中枢神经系统(CNS)中清除狂犬病病毒。

新生儿Fc受体在上世纪70年代在新生喷齿类动物肠道上皮细胞首次被发现，这种蛋白可以介导母源跨越哨齿类新生动物的肠道进入血液中，IgG转运的时间和途径因哺乳动物种类而异，但是，在已经研究的物种中，转运全都是通过FcRn介导的。正是由于FcRn的胞转作用，母源IgG可以从肠上皮细胞进入到血液中，而近几年一些研究，根据FcRn与IgGFc片段相互结合这一功能特点，构建Fc片段的融合蛋白进行小鼠体内实验，由于小鼠的上呼吸道上皮细胞表达FcRn，因此在上呼吸道腔中可以将Fc融合蛋白转运到血液中，这将为大分子物质提供了新型的给药途径。还有一些研究将Fc片段的融合蛋白作为免疫性抗原，通过粘膜免疫能有效的诱导粘膜免疫反应和全身性免疫反应，这个思路给我们在病原粘膜免疫上带来一个新的策略，如果这一新的策略可以得到广泛的应用，那么粘膜疫苗的制备、传递过程将大大简化。

近20年来昆虫细胞-杆状病毒表达系统(BEVS)被成功应用于表达了很多外源蛋白，杆状病毒表达系统现已广泛应用于疫苗的生产、生物制药和基因工程当中。目前国内外已经利用昆虫-杆状病毒表达系统已经成功开发上市了多种疫苗产品，包括人用上市疫苗、兽用上市疫苗等。将目标基因经过优化，然后通过分子生物学手段，构建获得充足杆状病毒，再通过杆状病毒感染昆虫细胞，经过获得目标蛋白。

因此本发明要求保护以下内容：

一种编码融合表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

一种融合表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

一种重组载体，携带有所述基因的载体。

优选地，所述载体为杆状病毒载体。

更优选地，所述杆状病毒载体为PfastBac DuaL

一种重组病毒，含有所述基因。

优选地，所述病毒为杆状病毒。

一种重组细胞，含有所述重组载体。

所述蛋白的制备方法，包括以下步骤：

S1.获得所述基因，并连接入病毒表达载体，得到重组病毒表达载体；

S2.利用重组病毒表达载体和真核表达系统，获得感染重组病毒的表达所述重组蛋白的重组细胞；

S3.纯化融合蛋白。

优选地，步骤S1中，所述病毒表达载体为杆状病毒表达载体。

更优选地，所述杆状病毒表达载体为PfastBac DuaL。

优选地，所述真核表达系统为BAC TO BAC真核表达系统。

所述制备方法，步骤S2包括以下步骤：

S21.将重组病毒表达载体转化至第一受体细胞中获得重组穿梭载体；

S22.将重组穿梭载体转染至第二受体细胞获得重组杆状病毒；

S23.重组杆状病毒感染第三受体细胞，获得表达所述蛋白的重组细胞。

优选地，第一受体细胞为大肠杆菌XL10-GoLd。

优选地，第二受体细胞为大肠杆菌DH10Bac。

优选地，第三受体细胞为Sf9细胞。

优选地，步骤S23中，重组杆状病毒感染Sf9细胞的条件为MOI＝1接种Sf9细胞。

优选地，步骤S23中，选用F3代重组杆状病毒。

所述制备方法，步骤S3包括以下步骤：

S31.步骤S2获得的重组细胞，27℃培养，96小时后收获细胞；

S32.洗涤细胞，裂解细胞，固液分离，用洗涤液A、B、C依次洗涤沉淀，溶解液溶解沉淀；

其中，洗涤液A为含50mM Tris-HCL、2Mm EDTA、100Mm NaCL、0.5％TritonX-100、2M尿素的水溶液，

洗涤液B为含50mM Tris-HCL、2Mm EDTA、100Mm NaCL、3％Triton X-100的水溶液，

洗涤液C为含50mM Tris-HCL、2Mm EDTA、100Mm NaCL、0.5％TritonX-100、2M盐酸胍的水溶液，

溶解液为含50mM Tris-HCL、100Mm NaCL、5mM DTT、8M尿素的水溶液。

优选地，用pH＝8的PBS洗涤1次。

优选地，裂解细胞的条件为pH＝8的PBS，冰上超声裂解10min。

优选地，12000rpm，4℃，离心20min固液分离。

所述基因、所述蛋白、所述重组载体、所述重组杆状病毒、或所述重组细胞中的一种或几种在制备狂犬病疫苗中的应用，也属于本发明的保护范围

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次融合表达了狂犬病病毒G蛋白与Fc片段。本发明利用杆状病毒表达系统构建的重组杆状病毒对外源蛋白表达稳定。该融合蛋白因融合了Fc片段，能利用Fc与FcRn结合进行跨膜转运将蛋白抗原狂犬病病毒G蛋白跨越粘膜屏障，转运到粘膜固有层，被抗原递呈细胞(APC)摄取后，再递呈给T细胞，引起机体的适应性免疫，这将为狂犬病口服疫苗的研究和制备提供一个新的策略，狂犬病口服疫苗也为对非宠物犬的免疫提供一种新思路，因此在狂犬病的防治方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为SHG-Fc融合蛋白的DNA序列连接策略示意图。

图2为SHG-Fc融合蛋白的蛋白结构示意图。

图3为SHG-Fc DNA片段扩增电泳图：泳道1为SHG-Fc DNA片段，泳道2为阴性对照，M为DL5000的DNA Marker。

图4为SHG-Fc-PfastBac DuaL菌液PCR鉴定电泳图；泳道1为SHG-Fc-PfastBacDuaL菌液鉴定；泳道2为阴性对照；M为DL5000的DNAMarker。

图5为SHG-Fc-PfastBac DuaL质粒双酶切鉴定电泳图；泳道1为SHG-Fc-Bacmid；M为DL10000的DNA Marker。

图6为以M13F/R为引物鉴定Bacmid PCR结果电泳图；泳道1为rBac-SHG-Fc；泳道2为阴性对照；M为DL10000的DNA Marker。

图7为转染、接毒后发生细胞病变(CPE)图；a：正常Sf9细胞；b：rAc-SHG-Fc-SS感染细胞。

图8为重组病毒的IFA鉴定图(100×)。

图9为测定细胞滴度感染病毒的Sf9-EP细胞自发光图(100×)。

图10为表达的重组蛋白SDS-PAGE鉴定结果图：1：为阴性细胞；2：PfastBacDuaL空载质粒；3：SHG-Fc/wt表达上清；4：SHG-Fc/wt表达细胞；M：ProteinLadder。

图11为重组蛋白表达的Western bLot鉴定图：泳道1为SHG-Fc蛋白；泳道2为阴性细胞；A：人RABV阳性血清；B：小鼠IgG-Fc多克隆抗体；C：小鼠His-tag单克隆抗体。

图12为纯化后的重组蛋白SDS-PAGE鉴定结果图：1为纯化后的SHG-Fc融合蛋白；M：Protein Ladder。

图13为狂犬病人免疫球蛋白的重组蛋白间接Elisa结果图。

图14为小鼠免疫检测抗体的间接Elisa结果图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1SHG-Fc融合蛋白SHG-Fc重组表达载体的构建

一、SHG-Fc融合蛋白的DNA序列的设计

将狂犬病病毒GD-SH毒株G蛋白的胞外区的3’端用一段Linker(氨基酸序列为GSGGGGSGGGGSGS)与IgG2a Fc片段(铰链区和恒定区的CH2、CH3)连接，其中，Fc序列位于狂犬病病毒G蛋白序列的羧基端，且突变Fc片段的补体位点，将IgG2a Fc片段第318位Glu，320位Lys，322位Lys三个氨基酸替换为ALa，得到的SHG-Fc融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，对应的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步，在5’端插入杆状病毒GP64信号肽以及小鼠Kappa链先导序列，图1为连接示意图，并由公司合成该序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，对应的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，其蛋白结构如图2所示。

二、SHG-Fc融合蛋白的编码基因的扩增

1、实验方法

(1)利用引物SHG-Fc-F/SHG-Fc-R扩增SHG-Fc基因，引物序列如下：

SHG-Fc上游引物：

5’-ATTCTCGAGGCCACCATGCTACTAGTAAATCAGTCACACC-3’

SHG-Fc下游引物：

5’-TGAGGTACCTTAGTGGTGGTGGTGATGGTGTTTAC-3’

SHG-Fc基因扩增的PCR体系为：

扩增的PCR反应条件为：98℃30s；98℃6s，60℃30s，72℃50s，运行40个循环；最后72℃延伸7min。

(2)PCR反应结束后，取5μL PCR产物于1.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

2、实验结果

电泳结果显示，SHG-Fc扩增PCR获得一条特异的DNA电泳带，大小约为2208bp，与试验预期相符，见图3所示。

三、重组质粒的构建

1、实验方法

(1)将PCR扩增产物进行凝胶DNA回收，将回收的SHG-Fc片段和载体PfastBac DuaL用Xho1和Kpn1核酸限制性内切酶进行双酶切。

双酶切体系如下：

上述体系混匀后，在37℃水浴锅孵育3h。对SHG-Fc DNA片段、PfastBacDuaL酶切产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化。回收产物用分光光度计测定浓度，按照分子量的比例为2:1至10:1(SHG-Fc DNA片段、PfastBacDuaL)进行连接，连接体系如下：

上述体系混匀后，置于连接仪中，16℃连接过夜，连接产物直接用于转化，也可储存于-20℃。

(2)连接产物转化XL10-GoLd感受态细胞，筛选阳性克隆。取待检菌液作为模板进行菌液PCR初步鉴定。鉴定引物为SHG-Fc-F/SHG-Fc-R，连接成功的阳性重组质粒PCR产物长度为2208bp，扩增体系如下：

扩增的PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃50s，运行35个循环；最后72℃延伸7min。

扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，选取能扩出强且特异性条带的对应菌液按照Magen质粒小提试剂盒说明书进行质粒小提。

提取后的重组质粒采用Xho1和Kpn1核酸限制性内切酶进行双酶切鉴定，在双酶切鉴定中见到目的条带。

将鉴定正确的质粒送上海英骏生物工程有限公司进行序列测定，正确，质粒命名为SHG-Fc-PfastBac DuaL。

2、实验结果

菌液PCR鉴定结果如图4所示。双酶切鉴定结果见图5。经过序列测序成功制备得到SHG-Fc融合蛋白SHG-Fc重组表达载体。

实施例2重组质粒转化至DH10Bac大肠杆菌中获得重组穿梭载体Bacmid

一、实验方法

1、重组质粒转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细菌

按照Bac-to-Bac表达系统说明书进行重组质粒SHG-Fc-PfastBac DuaL转化DH10Bac感受态细胞，在DH10Bac中Helper质粒的辅助作用下，重组质粒SHG-Fc-PfastBacDuaL和杆状病毒骨架载体Bacmid之间发生同源重组得到含SHG-Fc基因的重组Bacmid质粒rBac-SHG-Fc，实现了把外源基因转入杆状病毒骨架载体，最终以10^-1、10^-2两个梯度涂板。

2、重组细菌的挑选和质粒提取

经过48h培养，挑取平板上大的白色菌落进行第二次蓝白斑筛选，挑取二次筛选仍为白色的菌落接种3.0mL含四环素(10μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)的LB培养基中，过夜培养；按照说明书提供的方法提取重组Bacmid质粒rBac-SHG-Fc，溶于30μL无菌双蒸水中，然后进行1％(g/mL)的琼脂糖凝胶电泳。

3、重组质粒的PCR鉴定

提取的重组质粒rBac-SHG-Fc作为模板，M13-F(5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’)和M13R(5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’)PCR鉴定。

PCR鉴定体系如下：

PCR扩增反应程序：

二、实验结果

扩增出目的条带大小约4792bp与试验预期相符，电泳图见图6所示。

实施例3重组杆状病毒的获取

一、实验方法

1、重组质粒转染Sf9细胞

转染在6孔板上进行，细胞处于对数期(1.5～2.5×10⁶个细胞/mL)，且存活率高于95％，按照转染试剂CeLLfectin^TM II Reagent(Thermo Fisher)说明书步骤操作，转染同时设立野生型Bacmid转染对照，以获得野生型杆状病毒。转染结束后，把细胞放入温箱，每天观察细胞病变。

2、重组病毒的获得与增殖

转染后每天观察细胞病变情况，继续培养至第5天，收获培养上清，2000×g，离心10min，将上清转移至新的灭菌离心管中，此即为第一代病毒(P1viraLstock)。将第一代重组病毒rAc-SHG-Fc按Bac-to-Bac(Thermo Fisher)表达系统说明书的方法感染处于对数生长期的Sf9细胞进行病毒扩增，27℃培养3～4d至细胞出现明显病变时，即可收获上清得到第二代病毒(P2)；用同样的方法获得第三代病毒(P3)，近期使用的病毒均置于4℃避光保存，长期保存则放于-80℃，野生杆状病毒亦用同样方法扩增保存。

3、测定重组病毒滴度

实验室保存的Sf9-EP细胞被杆状病毒(AcNPV)感染，在荧光显微镜下能看到自发绿色荧光，因此可根据Sf9-EP细胞接种病毒，使用TCID50来测定杆状病毒的滴度，按照常规病毒TCID50的测定方法，接种病毒后7-10d在荧光显微镜下观察细胞自发光情况，待荧光孔数稳定后，记录该TCID50孔数，根据公式则可计算病毒的滴度。

二、实验结果

在转染后72h可以看到细胞出现变大变圆、生长停滞、颗粒状外观的病变表现，如图7所示。感染病毒后的Sf9-EP细胞后在蓝光的激发下会自发绿光，如图8所示，可根据具有荧光斑点，按Kaber法测定病毒滴度。

实施例4融合蛋白SHG-Fc的鉴定

一、重组质粒转染Sf9细胞

1、实验方法

在48孔板中按1×10⁶个/mL密度铺上Sf9细胞，待细胞贴壁稳定后，按MOI＝0.5接种重组杆状病毒，同时设野生型杆状病毒感染和正常Sf9细胞对照，细胞出现病变后，弃培养上清液，用预冷的80％丙酮固定，PBS洗3次，分别加入1∶500稀释的兔抗小鼠IgG-Fc多克隆抗体、1∶500稀释的小鼠His-tag蛋白单克隆抗体，4℃过夜孵育，PBS洗3次，分别加入1∶200稀释的FITC-羊抗兔IgG和FITC-羊抗鼠IgG，37℃孵育45min，PBS洗3次，于荧光显微镜下观察。

2、实验结果

显微镜观察显示，重组病毒感染细胞胞浆内有特异荧光出现，而野生型杆状病毒感染细胞和正常细胞中无特异荧光出现，如图9所示。

二、SDS-PAGE检测

1、实验方法

将扩增得到的重组杆状病毒rAc-SHG-Fc接种Sf9细胞，同时设立Sf9阴性细胞对照，在感染看到细胞病变后用灭菌的离心管收集，2000g离心10min，弃去细胞培养上清，PBS洗涤细胞，再按原体积和PBS 1:10比例加入PBS重悬细胞，加入5×Loading Buffer煮沸处理10min。取10μL样品进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝R-250染色后脱色观察。

2、实验结果

结果如图9所示，经洗涤液洗涤纯化后，溶解于8moL尿素中，SDS-PAGE检测可见单一条带，蛋白纯度可达95％。

二、Western bLot检测

Western-bLot鉴定采用实验室保存的人RABV阳性血清和兔抗小鼠IgG-Fc多克隆抗体(北京博奥森生物技术公司)进行蛋白鉴定。SDS-PAGE电泳结束后，用湿转的方法将蛋白转印到PVDF硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶粉室温封闭2h，封闭结束后室温在摇床上用TBST清洗4次转印蛋白的PVDF膜，再分别加入1∶5000稀释的人RABV阳性血清和1∶5000稀释的兔抗小鼠IgG-Fc多克隆抗体抗体，4℃过夜孵育，同上述洗涤方法PBST洗涤3次，随后分别加入1∶10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(博奥森生物公司)和HRP标记的羊抗人IgG(南京诺维赞生物公司)，室温孵育2h，上述洗涤方法PBST洗涤3次，加入超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天)，按试剂盒说明书操作，随后用Tanon Fine-Do X6全自动化学发光图像分析系统进行发光成像检查，观察特异性蛋白条带。

2、实验结果

结果如图11所示，均可见融合蛋白SHG-Fc能够对目的蛋白狂犬病病毒G蛋白和小鼠IgG 2a Fc片段进行有效的表达。

实施例5融合蛋白SHG-Fc的蛋白纯化

一、实验方法

将扩增得到的病毒按MOI＝1接种Sf9细胞，27℃培养，96小时后收获细胞，PBS洗涤1次，加入PBS，冰上超声裂解细胞10min，裂解物经12000rpm，4℃，离心20min，取离心后的沉淀，用洗涤液A、B、C依次洗涤1h，经洗涤液洗涤后的沉淀蛋白溶解到8moL的尿素溶解液中。

洗涤液A、B、C以及溶解液的配方如下：

溶解液为含50mM Tris-HCL、100Mm NaCL、5mM DTT、8M尿素的水溶液。

二、实验结果

SDS-PAGE试验结果表明其蛋白纯度能达到90％，如图12所示。

实施例6重组蛋白间接ELISA分析

一、重组蛋白的间接ELISA鉴定

1、实验方法

为测定重组蛋白的免疫原性，用人免疫狂犬病疫苗的阳性血清作为一抗，进行间接ELISA鉴定，用未免疫狂犬病疫苗的人的血清作为阴性对照，以下为间接ELISA操作步骤：

(1)重组蛋白的包被：将实施例5获得重组蛋白经过透析复性后(pH＝8的PBS透析液)用包被液稀释为10μg/ml的浓度，每孔100μl加入到96孔酶标板中，每个蛋白做一个重复孔，放置4℃条件下让特异性抗原和固相载体过夜结合。

(2)封闭：次日，弃上清，用TBST清洗酶标板四次，每次清洗时放置于震荡板内震荡清洗1min，每次清洗都在滤纸上进行充分排干残留的液体，每孔加入200μl的封闭液，放于湿盒内，37℃条件下孵育3h。

(3)孵育一抗：封闭结束后，同上述方法用TBST洗涤四次，将人免疫狂犬病疫苗的阳性血清1：4000稀释于一抗稀释液中，并设置阴性孔，每孔加入100μl，放于湿盒内，37℃条件下孵育1h。

(4)孵育二抗：一抗孵育结束后，同上述方法用TBST洗涤四次，将HRP标记的山羊抗人IgG按照1：5000的比例用TBST稀释，每孔加入100μl，放于湿盒内，37℃条件下孵育40min。

(5)显色：二抗孵育结束后，同上述方法用TBST洗涤四次，避光条件下每孔加入100μl的TMB底物显色液，室温避光孵育8min待显色，再每孔加入50μl的终止液终止反应。

(6)酶标仪度数：放置酶标仪中读取A450参数数据。

2、实验结果

间接Elisa结果图13所示，SHG-Fc重组蛋白与阴性对照相比有较强的免疫反应。说明本发明获得的重组蛋白具有抗原性。

二、重组蛋白免疫小鼠血清间接ELISA抗体测定

1、实验方法

将实施例5获得的纯化后溶解在溶解液(含50mM Tris-HCL、100Mm NaCL、5mM DTT、8M尿素的水溶液)中的重组蛋白，用pH＝8的PBS透析后，蛋白与等体积的弗氏佐剂进行乳化，每只小鼠按照100μg的剂量进行肌注免疫(肌注PBS作为阴性对照)，一免后7天用相同的剂量进行二次免疫，二免后7天和14天，用眼眶静脉丛采血方法采取小鼠血液，血液放置37℃1h后4℃过夜使血清最大程度的析出，同上述方法使用间接ELISA检测小鼠血清的抗体。

2、实验结果

实验结果图14所示，间接ELISA结果显示二免后的血清抗体要比14天后的OD450值要大，且在血清1：9920稀释度上血清抗体仍旧较高。说明了本发明获得的重组蛋白具有免疫原性。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白及其制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2061

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagttcccaa tctacaccat ccctgataag ctgggtccat ggtccccaat cgacatccac 60

cacctgagct gccctaacaa cctggttgtt gaggacgagg gctgcactaa ccgttccggc 120

ttctcctaca tggaactgaa ggttggctac atctccgcta tcaaggtcaa cggattcaca 180

tgtaccggcg tggtgaccga ggccgagact tacactaact tcgtgggata cgtgaccaca 240

accttcaagc gcaagcactt ccgccccacc cctgacgcct gccgcagcgc ctacaactgg 300

aagatggccg gtgaccctcg ttacgaagag agcctccaca acccctaccc cgactaccac 360

tggctgagga cggtgaagac aactaaggaa tccttcgtga tcatcagccc ctccgtcgct 420

gacctggacc cttacgacaa gagcctgcac agccgcgtgt tccctcgcgg caagtgctcc 480

ggaacaacag tcagctccac ctactgttcc actaaccacg actacacaat ctggatgcct 540

gagaaccctc gcctcggcac ctcctgtgac atcttcacca acagccgcgg caagcgcgct 600

agcaagggtt ctaagacctg tggtttcgtt gacgagcgcg gtctgtacaa gagcctgaag 660

ggtgcttgta agctgaagct gtgcggcgtg ctgggtctgc gtctgatgga cggtacatgg 720

gtggctatcc aaacctcgga cgagaccaag tggtgtcctc ccgaccagct ggtgaacctg 780

cacgacttcc acagcgacga gatcgaacac ctcgtggttg aagaactcgt gaagaagcgt 840

gaggaatgcc tcgatgctct ggagagcatc atgactacta agagcgtgag cttcaggcgc 900

ttgagccacc tgcgtaagct ggtccctggt ttcggtaaag cctacactat cttcaacaag 960

actctgatgg aagccgacgc ccactacaag tccgtgcgta catggaacga gatcatccct 1020

tccaagggct gtctccgtgt tggtggtcgc tgtcacccac acgtgaacgg cgtgttcttc 1080

aacggcatca tcctcggccc cgacggccac gtgctgatcc ctgagatgca gtcttccctc 1140

ctgcagcagc acatggaact gctcgaatcc agcgtgatcc ccctgatgca cccactcgct 1200

gaccccagca cagtgttcaa ggacggtgac gaggccgagg acttcgtgga agtccacctg 1260

cctgacgtcc acaagcaggt gtccggcgtg gacctcggtc tgccttcttg gggaaagggt 1320

agcggtggcg gtggctcagg aggaggcggc tccggcagcg aaccacgcgg tcccacaatc 1380

aagccttgtc ccccctgtaa gtgccccgcc ccaaacctgc tgggcggccc ttccgtcttc 1440

atcttcccac ctaagatcaa ggacgttctg atgatctcac tgtcccctat cgtgacctgc 1500

gtggtggtgg acgtgtcaga ggacgacccc gacgtgcaaa tcagctggtt cgttaacaac 1560

gtggaagtcc acaccgctca gactcagacc caccgcgaag actacaatag cactttgcgt 1620

gtcgttagtg ctctgccaat ccaacaccag gactggatgt ccggaaaggc tttcgcctgc 1680

gccgtgaaca ataaggacct ccccgcccct atcgagcgta ctatttctaa gcctaaaggt 1740

agcgttagag ctccacaagt gtacgtcctg ccacctcctg aagaagaaat gactaagaag 1800

caagtgacac tgacctgtat ggtgactgac ttcatgcctg aagacatcta cgttgagtgg 1860

actaataacg gtaaaactga actgaattac aagaatactg agccagttct cgatagtgat 1920

ggatcatact tcatgtacag caagctgcgc gtggaaaaga agaactgggt ggaacgtaac 1980

tcctactcct gctccgtcgt gcacgaaggc ctccacaacc accacaccac taagagcttc 2040

agccgtacac ctggtaaata a 2129

<210> 2

<211> 686

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro

1 5 10 15

Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp

20 25 30

Glu Gly Cys Thr Asn Arg Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu Leu Lys Val

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys Thr Gly Val

50 55 60

Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr Val Thr Thr

65 70 75 80

Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala Cys Arg Ser

85 90 95

Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu Glu Ser Leu

100 105 110

His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val Lys Thr Thr

115 120 125

Lys Glu Ser Phe Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp Leu Asp Pro

130 135 140

Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Arg Gly Lys Cys Ser

145 150 155 160

Gly Thr Thr Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His Asp Tyr Thr

165 170 175

Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Thr Ser Cys Asp Ile Phe

180 185 190

Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Lys Thr Cys Gly

195 200 205

Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Ala Cys Lys

210 215 220

Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp

225 230 235 240

Val Ala Ile Gln Thr Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Asp Gln

245 250 255

Leu Val Asn Leu His Asp Phe His Ser Asp Glu Ile Glu His Leu Val

260 265 270

Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp Ala Leu Glu

275 280 285

Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu Ser His Leu

290 295 300

Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile Phe Asn Lys

305 310 315 320

Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn

325 330 335

Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly Arg Cys His

340 345 350

Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly Pro Asp

355 360 365

Gly His Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln His

370 375 380

Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His Pro Leu Ala

385 390 395 400

Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe Val

405 410 415

Glu Val His Leu Pro Asp Val His Lys Gln Val Ser Gly Val Asp Leu

420 425 430

Gly Leu Pro Ser Trp Gly Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Ser Gly Ser Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro

450 455 460

Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

465 470 475 480

Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro

485 490 495

Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val

500 505 510

Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

515 520 525

Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala

530 535 540

Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Ala Phe Ala Cys

545 550 555 560

Ala Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser

565 570 575

Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro

580 585 590

Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val

595 600 605

Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly

610 615 620

Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp

625 630 635 640

Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp

645 650 655

Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His

660 665 670

Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

675 680 685

<210> 3

<211> 2214

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccaccatgc tactagtaaa tcagtcacac caaggcttca ataaggaaca cacaagcaag 60

atggtaagcg ctattgtttt atatgtgctt ttggcggcgg cggcgcattc tgcctttgcg 120

gcggagcact gcaacaagtt cccaatctac accatccctg ataagctggg tccatggtcc 180

ccaatcgaca tccaccacct gagctgccct aacaacctgg ttgttgagga cgagggctgc 240

actaaccgtt ccggcttctc ctacatggaa ctgaaggttg gctacatctc cgctatcaag 300

gtcaacggat tcacatgtac cggcgtggtg accgaggccg agacttacac taacttcgtg 360

ggatacgtga ccacaacctt caagcgcaag cacttccgcc ccacccctga cgcctgccgc 420

agcgcctaca actggaagat ggccggtgac cctcgttacg aagagagcct ccacaacccc 480

taccccgact accactggct gaggacggtg aagacaacta aggaatcctt cgtgatcatc 540

agcccctccg tcgctgacct ggacccttac gacaagagcc tgcacagccg cgtgttccct 600

cgcggcaagt gctccggaac aacagtcagc tccacctact gttccactaa ccacgactac 660

acaatctgga tgcctgagaa ccctcgcctc ggcacctcct gtgacatctt caccaacagc 720

cgcggcaagc gcgctagcaa gggttctaag acctgtggtt tcgttgacga gcgcggtctg 780

tacaagagcc tgaagggtgc ttgtaagctg aagctgtgcg gcgtgctggg tctgcgtctg 840

atggacggta catgggtggc tatccaaacc tcggacgaga ccaagtggtg tcctcccgac 900

cagctggtga acctgcacga cttccacagc gacgagatcg aacacctcgt ggttgaagaa 960

ctcgtgaaga agcgtgagga atgcctcgat gctctggaga gcatcatgac tactaagagc 1020

gtgagcttca ggcgcttgag ccacctgcgt aagctggtcc ctggtttcgg taaagcctac 1080

actatcttca acaagactct gatggaagcc gacgcccact acaagtccgt gcgtacatgg 1140

aacgagatca tcccttccaa gggctgtctc cgtgttggtg gtcgctgtca cccacacgtg 1200

aacggcgtgt tcttcaacgg catcatcctc ggccccgacg gccacgtgct gatccctgag 1260

atgcagtctt ccctcctgca gcagcacatg gaactgctcg aatccagcgt gatccccctg 1320

atgcacccac tcgctgaccc cagcacagtg ttcaaggacg gtgacgaggc cgaggacttc 1380

gtggaagtcc acctgcctga cgtccacaag caggtgtccg gcgtggacct cggtctgcct 1440

tcttggggaa agggtagcgg tggcggtggc tcaggaggag gcggctccgg cagcgaacca 1500

cgcggtccca caatcaagcc ttgtcccccc tgtaagtgcc ccgccccaaa cctgctgggc 1560

ggcccttccg tcttcatctt cccacctaag atcaaggacg ttctgatgat ctcactgtcc 1620

cctatcgtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcagaggacg accccgacgt gcaaatcagc 1680

tggttcgtta acaacgtgga agtccacacc gctcagactc agacccaccg cgaagactac 1740

aatagcactt tgcgtgtcgt tagtgctctg ccaatccaac accaggactg gatgtccgga 1800

aaggctttcg cctgcgccgt gaacaataag gacctccccg cccctatcga gcgtactatt 1860

tctaagccta aaggtagcgt tagagctcca caagtgtacg tcctgccacc tcctgaagaa 1920

gaaatgacta agaagcaagt gacactgacc tgtatggtga ctgacttcat gcctgaagac 1980

atctacgttg agtggactaa taacggtaaa actgaactga attacaagaa tactgagcca 2040

gttctcgata gtgatggatc atacttcatg tacagcaagc tgcgcgtgga aaagaagaac 2100

tgggtggaac gtaactccta ctcctgctcc gtcgtgcacg aaggcctcca caaccaccac 2160

accactaaga gcttcagccg tacacctggt aaacaccatc accaccacca ctaa 2286

<210> 4

<211> 735

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr

1 5 10 15

Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Glu His Cys Asn Lys Phe Pro Ile Tyr

35 40 45

Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His

50 55 60

Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn

65 70 75 80

Arg Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu Leu Lys Val Gly Tyr Ile Ser Ala

85 90 95

Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu

100 105 110

Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys

115 120 125

His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala Cys Arg Ser Ala Tyr Asn Trp Lys

130 135 140

Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro

145 150 155 160

Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val Lys Thr Thr Lys Glu Ser Phe Val

165 170 175

Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp Leu Asp Pro Tyr Asp Lys Ser Leu

180 185 190

His Ser Arg Val Phe Pro Arg Gly Lys Cys Ser Gly Thr Thr Val Ser

195 200 205

Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu

210 215 220

Asn Pro Arg Leu Gly Thr Ser Cys Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly

225 230 235 240

Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Lys Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg

245 250 255

Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly

260 265 270

Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp Val Ala Ile Gln Thr

275 280 285

Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His

290 295 300

Asp Phe His Ser Asp Glu Ile Glu His Leu Val Val Glu Glu Leu Val

305 310 315 320

Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr

325 330 335

Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro

340 345 350

Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala

355 360 365

Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser

370 375 380

Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly Arg Cys His Pro His Val Asn Gly

385 390 395 400

Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu Gly Pro Asp Gly His Val Leu Ile

405 410 415

Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu

420 425 430

Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val

435 440 445

Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro

450 455 460

Asp Val His Lys Gln Val Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Ser Trp

465 470 475 480

Gly Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser

485 490 495

Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro

500 505 510

Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

515 520 525

Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val

530 535 540

Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe

545 550 555 560

Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu

565 570 575

Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His

580 585 590

Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Ala Phe Ala Cys Ala Val Asn Asn Lys

595 600 605

Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser

610 615 620

Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met

625 630 635 640

Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro

645 650 655

Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn

660 665 670

Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met

675 680 685

Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser

690 695 700

Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr

705 710 715 720

Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys His His His His His His

725 730 735

Claims

1.一种编码融合表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种融合表达Fc片段的狂犬病病毒G蛋白的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，携带有权利要求1所述基因的载体。

4.一种重组杆状病毒，其特征在于，含有权利要求1所述基因。

5.一种重组细胞，其特征在于，含有权利要求3所述重组载体。

6.权利要求2所述蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.获得权利要求1所述基因，并连接入病毒表达载体，得到重组病毒表达载体；

S2.利用重组病毒表达载体和真核表达系统，获得感染重组病毒的表达权利要求2所述重组蛋白的重组细胞；

S3.纯化融合蛋白。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤S2包括以下步骤：

S22.将重组穿梭载体转染至第二受体细胞获得重组杆状病毒；

S23.重组杆状病毒感染第三受体细胞，获得表达权利要求2所述蛋白的重组细胞。

8.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤S3包括以下步骤：

S31.步骤S2获得的重组细胞，27℃培养，96小时后收获细胞；

其中，洗涤液A为含50mM Tris-HCL、2Mm EDTA、100Mm NaCL、0.5％Triton X-100、2M尿素的水溶液，

洗涤液C为含50mM Tris-HCL、2Mm EDTA、100Mm NaCL、0.5％Triton X-100、2M盐酸胍的水溶液，

溶解液为含50mM Tris-HCL、100Mm NaCL、5mM DTT、8M尿素的水溶液。

9.权利要求1所述基因、权利要求2所述蛋白、权利要求3所述重组载体、权利要求4所述重组杆状病毒、或权利要求5所述重组细胞中的一种或几种在制备狂犬病疫苗中的应用。