CN115785281A - 含有狂犬病病毒g蛋白的融合蛋白的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括狂犬病病毒G蛋白胞外域片段、GCN4片段和标签；该融合蛋白具有免疫原性，可被中和性抗狂犬病毒单克隆抗体CTB012所辨识，显示该融合蛋白构型正确，可用于检测含有抗狂犬病毒抗体的样品。本发明的表达、纯化系统保留了狂犬病病毒G蛋白四级结构，且方法简单、成本低廉、耗时较短。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和抗体药物领域，具体涉及含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白的制备方法及应用。
背景技术
狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一种动物源性传染病，可以感染不同种类的温血动物，包括人类、宠物、野生动物等，是目前人类已知的最致命的人畜共患传染疾病之一。该病可严重损伤中枢神经系统，感染者一旦发病，出现神经性症状。
狂犬病病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)，丽沙病毒属(Lyssavirus)，该属目前有17种病毒和一种新发现的病毒组成。在透射电子显微镜下，病毒的结构为特征弹状和螺旋对称，一端为圆形，一端为扁平。基因组编码5种结构蛋白，从3'到5'端依次为N-P-M-G-L，即核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和聚合酶。G蛋白作为跨膜刺突蛋白是主要的抗原决定簇。
狂犬病病毒G蛋白，长度524个氨基酸，是狂犬病毒粒子的表面蛋白，在病毒颗粒表面形成三聚体刺突。狂犬病病毒G蛋白的N端结构域在狂犬病毒脂质包膜上向外延伸，而C端结构域插入病毒颗粒包膜下方，并于M蛋白相结合帮助狂犬病毒形成正常形态。在狂犬病毒感染过程种，狂犬病病毒G蛋白具有多种重要作用：帮助病毒吸附于神经元特异性受体、刺激机体产生病毒中和抗体、神经元凋亡、病毒释放。结构上，狂犬病病毒G蛋白由胞外域、跨膜区、胞内域三个部分组成。有研究使用电子显微镜及负染色法，在病毒颗粒表面、及溶出的狂犬病病毒G蛋白(沉降系数9S)溶液中，皆观察到三角对称的刺突结构，三角形边长介于8-9nm。有研究解出狂犬病病毒G蛋白胞外域在中性(pH8.0)及酸性(pH6.5)环境下的结构变化，前者弯折，后者延展，然两个结晶结构皆为单体。已有研究使用单克隆抗体RVA122结合并稳定狂犬病病毒G蛋白的四级结构，结合冷冻电子显微镜技术，方得到高分辨率的溶液狂犬病病毒G蛋白三聚体结构，俯视该结构(RCSB PDB ID:7U9G)可见边长约9nm的正三角形，作为唯一的病毒表面分子，狂犬病病毒G蛋白是发展被动免疫单克隆抗体药物所使用的抗原。
狂犬病病毒G蛋白的表现普遍存在产量低、蛋白质折迭、及糖链修饰等问题。传统作法以活病毒感染BHK21仓鼠细胞，再从病毒颗粒上用表面活性剂溶出狂犬病病毒G蛋白。曾尝试多种表面活性剂，有的无法溶出膜蛋白，多数溶出沉降系数为4S的疑似单体结构，仅有3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS)溶出沉降系数为9S的三聚体结构。而后亦有文献尝试转染昆虫或人类细胞，外泌表达基因重组的狂犬病病毒G蛋白胞外域，然而多数未能正确折迭。少数成功案例中，目前已发表的论文，在狂犬病病毒G蛋白胞外域的羧基端，连接一个能自发生成三聚体的亮氨酸拉链GCN4，并使用辨认构象表位的单克隆抗体验证其抗原性。有文献表明设计用昆虫细胞外泌表达狂犬病病毒G蛋白胞外域，然而最后从细胞裂解液中纯化出目标蛋白。
酵母转录激活因子GCN4在酵母细胞中调控氨基酸的生物合成，是一个非常典型的含碱性区-亮氨酸拉链(basic region-leucine zipper)结构域的DNA结合蛋白，它的bZIP结构域位于C端约60个氨基酸残基处。GCN4的两个结构单元：拉链区(zipper region)和碱性区(basic region)分工明确，两者相互依赖又相互独立，发挥着各自的功能。
本发明使用温和、成本低廉的聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween-20)辅以超声波破碎机，制备表达狂犬病病毒G蛋白的细胞裂解液，使用高亲和力、结合构象表位的CTB012-conjugated Sepharose亲和力管柱回收正确折迭的狂犬病病毒G蛋白三聚体。此表达、纯化系统保留G蛋白四级结构，取代传统使用、昂贵的CHAPS并使用耗时的蔗糖浓度梯度超高速离心方式纯化方式。
本发明制备的融合蛋白可作为抗原，用于检测每批次抗狂犬病毒抗体与狂犬病毒的结合强度和含有抗狂犬病毒抗体的样品，且制备方法简单、成本低廉、耗时短。
发明内容
本发明的术语和声明：
本发明中，术语“融合蛋白”是指由两个或多个相同或不同的多肽序列融合得到的新的多肽序列。术语“融合”是指肽链直接连接或借助一个或多个连接肽连接。术语“连接肽”是指可以连接两个多肽序列的短肽，一般长度为1-30个氨基酸。
本发明中，术语“抗体”指特异性结合和识别抗原的包括免疫球蛋白基因的构架区的多肽或其片段。术语抗体的使用意指包含全抗体和其抗原结合片段。术语抗体包含单特异性抗体、双特异性抗体和多特异性抗体，只要其表现所期望的生物活性或功能即可。
本发明中，术语“载体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制。其他载体可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。
本发明中，术语“表达载体”是指包含适当的调控序列，例如启动子、终止子、增强子等的本领域的常规表达载体，所述表达载体是质粒。所述表达载体较佳地包括pcDNA3.1、pCMV或pSV40。
本发明中，术语“宿主细胞”为本领域常规的各种宿主细胞，只要能使载体稳定地自行复制，且所携带的核酸分子可被有效表达即可。其中所述宿主细胞为真核表达细胞，所述宿主细胞较佳地包括293E、HEK293F或Expi293。
本发明中，术语“结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。例如，使用表面等离子体共振术(Surface PlasmonResonance，缩写SPR)在BIACORE仪中测定抗体与抗原的结合亲和力或使用ELISA测定抗体与抗原结合的相对亲和力。
本发明中，术语“亲和(能)力”、“结合(能)力”或“结合亲和(能)力”可互换使用，是指两个分子之间的结合相互作用的强度。
本发明中，术语“氨基酸”：包含天然氨基酸、合成氨基酸、以及以类似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名法委员会(BiochemicalNomenclature Commission)所推荐的单字母符号来提及。
本发明中，术语“标签”是指可被特异性识别的标志物，在核酸分子中也指序列条形码。在蛋白表达的时候，为了便于蛋白的纯化或辨识，会在蛋白多肽的一段连接可以和其他物质结合的片段，即为标签。
本发明中，术语“胞外域”是指膜蛋白位于细胞外的区段。
本发明中，术语“氨基酸序列”是氨基酸相互连接形成肽链(或多肽)的顺序。
本发明中，术语“密码子优化”是指通过基因工程技术，根据宿主的密码子偏好性调整基因的同义密码子，达到消除稀有密码子的目的，并且优化如mRNA二级结构相关参数，从而提高翻译效率。当异源基因在宿主中无法有效表达时，可以考虑进行密码子优化，调整同义密码子和相关的调控元件，提高翻译效率。
本发明中，术语“信号肽”是指是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(长度5-30个氨基酸)肽链。常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列。
本发明中，术语“终止密码子”是指信使核糖核酸分子中作为转译多肽链终止信号的三联体密码子，可终止蛋白质合成。
本发明中，术语“重组质粒”指的是目的基因和载体结合后的产物。
本发明的第一目的在于提供一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白，具有较好的免疫原性。
本发明的第二目的在于提供上述融合蛋白的制备方法，该制备方法简单、成本低廉、保留了狂犬病病毒G蛋白的四级结构。
本发明技术方案包括：
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白，所述融合蛋白包括狂犬病病毒G蛋白胞外域片段、GCN4片段和标签；
所述狂犬病病毒G蛋白胞外域片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述GCN4片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
优选地，所述融合蛋白的密码子优化并加上分泌信号肽及终止密码子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
优选地，所述标签选自poly-Arg、poly-His、Flag、c-myc、HA中的至少一种。
进一步优选地，所述标签为Flag，Flag标签能够在不破坏融合蛋白的四级结构，透过固着于固相的抗Flag单克隆抗体结合，能将带有标签的狂犬病病毒G蛋白呈现于表面，以利于侦测抗狂犬病病毒G蛋白抗体。
优选地，所述Flag标签的氨基酸序列为DYKDDDDK。
具体的，所述poly-Arg是指多聚精氨酸。
具体的，所述poly-His是指多聚组氨酸。
具体的，所述Flag指一段由8个氨基酸残基组成的。Flag标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统已广泛应用于各种细胞类型，包括细菌、酵母和哺乳动物细胞。
具体的，所述HA标签(氨基酸序列：YPYDVPDYA)是一段来源于人流感病毒血凝素(HA)蛋白第98-106位氨基酸的短序列。HA标签的分子量为1.1KDa。
优选地，所述的GCN4片段可以与抗狂犬病病毒G蛋白胞外域片段直接相连，也可以之间间隔若干个氨基酸残基，本发明对此不作限制。
优选地，所述融合蛋白从氨基端到羧基端依次为狂犬病病毒G蛋白胞外域片段、GCN4片段、Flag标签。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了所述融合蛋白的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)将狂犬病病毒G蛋白胞外域片段连接GCN4片段，加上标签，得融合蛋白，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
(2)融合蛋白进行密码子优化并加上分泌信号肽及终止密码子，所得核苷酸序列如SEQ ID NO:4；
(3)将步骤(2)所得核苷酸序列亚克隆至表达载体中，得到含有融合蛋白的重组质粒；
(4)再将重组质粒转染至表达细胞中；
(5)细胞裂解液纯化融合蛋白。
具体的，所述亚克隆是指初步克隆的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的DNA片段，将目的基因所对应的DNA找出来，并对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。
优选地，所述狂犬病病毒株G蛋白的毒株选自CVS株、SAD株、Flury株、LEP株、HEP株、ERA株、CTN-1株、SAG株、SRV9株中的一种。
进一步优选地，所述狂犬病病毒G蛋白的毒株为CVS株。
更进一步优选地，所述狂犬病病毒G蛋白的毒株为CVS-11株。
优选地，步骤(1)中所述狂犬病病毒G蛋白的胞外域片段长度为1-440残基。
优选地，所述步骤(3)中表达载体为pSV40。
优选地，所述步骤(4)中融合蛋白的表达细胞为哺乳动物细胞。
进一步优选地，所述步骤(4)中融合蛋白的表达细胞为Expi293细胞。
优选地，所述步骤(5)中使用聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween-20)辅以超声波破碎机，制备表达狂犬病病毒G蛋白的细胞裂解液。
优选地，所述步骤(5)中纯化的方法为使用共轭CTB012 Sepharose亲和力管柱回收狂犬病病毒G蛋白。
优选地，转染试剂为聚乙烯亚胺(PEI)，PEI(linear PEI,40kDa)试剂是一种新型纳米聚合物转染试剂。能够高效率转染多种细胞系，包括贴壁细胞和悬浮细胞，具有更高的转染效率，同时也具有低度、高效、操作简单等特性。
在本发明的优选实施例中，表达抗狂犬病病毒G蛋白的裂解液为使用聚氧乙烯山梨糖醇月桂酸酯(Tween-20)辅以超声波破碎机，使用高亲和力、结合构象表位的CTB012-conjugated Sepharose亲和力管柱回收正确折迭的G蛋白三聚体，具有很多优势。此表达、纯化系统保留抗狂犬病病毒G蛋白四级结构，取代传统使用、昂贵的CHAPS并使用耗时的蔗糖浓度梯度超高速离心方式纯化方式。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了所述的融合蛋白在如下(1)-(4)中至少一种的应用；
(1)制备狂犬病疫苗；
(2)制备狂犬病病毒G蛋白抗体；
(3)制备狂犬病病毒G蛋白抗原检测试剂盒；
(4)制备狂犬病病毒G蛋白抗体检测试剂盒。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明提供的融合蛋白含有狂犬病病毒G蛋白胞外域片段和GCN4片段和标签，该融合蛋白具有免疫原性。
(2)本发明的融合蛋白可被中和性抗狂犬病单克隆抗体CTB012所辨识，显示该融合蛋白构型正确，可用于检测含有抗狂犬病毒抗体的样品。
(3)本发明使用聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯辅以超声波破碎机，制备表达狂犬病病毒G蛋白的细胞裂解液，使用共轭CTB012 Sepharose亲和力管柱回收正确折迭的G蛋白三聚体，该表达、纯化系统保留了狂犬病病毒G蛋白四级结构，且方法简单、成本低廉、耗时较短。
附图说明
图1为实施例1融合蛋白GP-GCN的还原性凝胶电泳分析
图2为实施例2融合蛋白GP-GCN的分子筛色谱法分析
图3为实施例3融合蛋白GP-GCN的ELISA原始量测值
图4为实施例4融合蛋白GP-GCN的免疫斑点试验
具体实施方式
实施例1、狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白的表达与纯化
狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白的表达
采用Koraka等人的融合蛋白设计，取狂犬病毒株CVS-11的G蛋白胞外域片段1-440残基(不含分泌信号肽)(SEQ ID NO:1)，经七肽序列，连接一个能自发生成三聚体的亮氨酸拉链GCN4片段(氨基酸序列为SEQ ID NO:2)，并加上Flag(DYKDDDDK)标签，该融合蛋白简称GP-GCN。GP-GCN融合蛋白的氨基酸序列为(SEQ ID NO:3)，密码子优化并加上分泌信号肽及终止密码子的核苷酸序列为(SEQ ID NO:4)。将此序列亚克隆至pSV40载体上，由CMV启动子驱动表现。建构完成的表现质粒纯化并以纯水回溶，储存于-20℃备用。
狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白的纯化
使用哺乳类细胞Expi293瞬间转染表达系统。
细胞准备：Expi293细胞接种密度3.2×105cells/mL于Expi293TM ExpressionMedium(Gibco,A14351-01)，于37℃、8％CO2摇瓶培养4天，至活细胞密度达约3-5×106cells/mL，且细胞活率大于95％。以300xg室温离心5分钟收集2.3×108个活细胞，倒掉旧的培养液并以80mL已预温的新培养液悬浮并转移至一个0.5L的平底摇瓶，放回培养箱。
瞬间转染准备：以4.5mL Opti-MEM(Gibco)稀释180μg 40kDa PEI MAX(Polysciences,XR-IPC-24765)；另以4.5mL Opti-MEM稀释90μg表现质粒(DNA)。静置5分钟后，将后者倒入前者并迅速混合。再静置10分钟后，倒入含有细胞的摇瓶并迅速混合。转染完的细胞放回培养箱，3小时后添加525μl的0.5M丙戊酸钠；3天后，90mL培养液分45mL两管，800xg离心收集细胞体，暂存于-80℃。
裂解缓冲液选用温和的表面活性剂Tween-20以维持G蛋白的四级结构，辅以超声波破碎机处理降低黏稠度，约9×108的细胞体，以15mL裂解缓冲液悬浮(50mMTris pH7.5,150mMNaCl,10％Glycerol,0.5％Tween-20,1mM EDTA,0.4mM PMSF)并以超声波破碎机Qsonica(型号Q700，探针直径3mm,设定参数：Amplitude＝10.Pulse＝2s on/3soff.Elapsed time＝2min)。裂解液以19,000xg低温离心45分钟，0.22um过滤后即可用于纯化。
将已过滤的细胞裂解液灌入CTB012-conjugated Sepharose亲和力管柱，然后以缓冲液(20mMTris pH7.5,150mMNaCl,0.05％Tween-20)洗去非目标蛋白，最后以酸性缓冲液(12.5mMNaOAc,250mM arginine,0.05％Tween-20,pH4.1)洗脱。每1mL的洗脱蛋白，添加0.15mL水及0.1mL 1M Tris pH7.5中和，得最终储存配方：80mMTris,10mM acetate,200mMarginine,0.04％Tween-20,pH7.5。以浓缩离心管(Amicon,10kDmwco)浓缩至蛋白质浓度约1mg/mL，分装储存于-20℃或4℃。
GP-GCN理论分子量为55.45kDa，SDS-PAGE的结果见图1，图1中显示GP-GCN的分子量大于理论值并呈现异质性，代表GP-GCN具有糖链修饰。
实施例2融合蛋白GP-GCN的分子量分析
使用HiLoad 16/600Superdex 200pg(Cytiva)作分子筛色谱法分析GP-GCN多聚体的大小。色谱分析于蛋白质液相层析仪(AKTAprimer plus)上进行，使用Tris缓冲液(20mMTris,0.15M NaCl,pH7.5)，控制流速1mL/min。分子量标准品使用Gel FiltrationStandard(Biorad,cat.1511901)。样品含50μg GP-GCN融合蛋白。结果见图2，GP-GCN纯度达90％以上，由分子量标准品估算GP-GCN融合蛋白聚合体的分子量约647kDa。
实施例3融合蛋白GP-GCN的酶联免疫吸附测定(ELISA)
使用抗Flag-tag单克隆抗体(Clone:5A8E5,GenScript)包被ELISA板(25ng/孔)，于4℃包被16小时，利用封闭液(1％BSA,0.05％Tween-20,0.01％ProClin300于PBS中)于室温封闭1小时后，用PBST缓冲液洗涤ELISA板，加入C端带有Flag-tag的GP-GCN融合蛋白(40ng/孔)，于室温结合1小时后，用PBST缓冲液洗涤ELISA板，加入20μg/mL起始浓度2倍梯度稀释(共15稀释点)的抗狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体CTB012，于室温结合1小时后，用PBST缓冲液洗涤ELISA板，加入HRP抗人IgG.Fc抗体(Jackson immunoresearch)，于室温结合1小时后，用PBST缓冲液洗涤ELISA板，加入TMB显色液，5分钟后用1M H2SO4终止显色，使用酶标仪在450nm波长测定光密度值。为了测试GP-GCN融合蛋白的储存稳定性，于4℃储存1、2、4、6周，及-20℃储存6周后，分别再以CTB012做ELISA测定，并以4parameter logisticcurve fit估算EC50值，结果显示GP-GCN融合蛋白于4℃及-20℃储存6周后，CTB012与GP-GCN融合蛋白的结合活性相当，结果见图3和表1。
表1 GP-GCN结合CTB012的EC50(μg/mL)
| 储存温度 | 初始化 | 1周 | 2周 | 4周 | 6周 |
| 4℃ | 0.029 | 0.028 | 0.045 | 0.066 | 0.050 |
| -20℃ | - | - | - | - | 0.056 |
实施例4融合蛋白GP-GCN的免疫斑点试验(Dot Immunobinding Assay)
为了测试GP-GCN融合蛋白能否做为快筛试剂的固着性抗原，以检验血液中的抗狂犬病病毒G蛋白抗体，取侧向流体免疫层析法普遍使用的硝酸纤维素膜，以简易的免疫斑点试验，测试固着在硝酸纤维素膜上、干燥储存的GP-GCN融合蛋白是否仍具有免疫原性。
首先以PBS序列稀释GP-GCN，然后在干燥的硝酸纤维素膜上，点2μl分别含有40、20、10、5ng的GP-GCN斑点。待斑点彻底干燥，以封闭液(1％BSA,0.05％Tween-20,0.01％ProClin300于PBS中)于室温封闭1小时，再用1/2倍稀释的PBST缓冲液清洗。最后放在纸上约10分钟待膜干燥，然后储存于干燥箱(室温、湿度50％)3天。
免疫斑点试验：取出干燥的膜，分别加入0.5μg/mL的抗狂犬病病毒G蛋白的单克隆抗体CTB011及CTB012，于室温结合半小时后，用PBST缓冲液洗涤ELISA板，加入HRP抗人IgG.Fc抗体(Jackson immunoresearch)，于室温结合半小时后，用PBST缓冲液洗涤ELISA板，加入HRP酵素冷光试剂，结果见图4，结果显示GP-GCN融合蛋白固定于硝酸纤维素膜上，仍可让中和性抗体CTB011和CTB012所辨识。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (11)
1.一种含有狂犬病病毒G蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括狂犬病病毒G蛋白胞外域片段、GCN4片段和标签；
所述狂犬病病毒G蛋白胞外域片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述GCN4片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的密码子优化并加上分泌信号肽及终止密码子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述标签选自poly-Arg、poly-His、Flag、c-myc、HA中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述标签为Flag。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从氨基端到羧基端依次为狂犬病病毒G蛋白胞外域片段、GCN4片段、Flag标签。
6.根据权利要求1-5任一项所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)将狂犬病病毒G蛋白胞外域片段连接GCN4片段，加上标签，得融合蛋白，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
(2)融合蛋白进行密码子优化并加上分泌信号肽及终止密码子，所得核苷酸序列如SEQID NO:4；
(3)将步骤(2)所得核苷酸序列亚克隆至表达载体中，得到含有融合蛋白的重组质粒；
(4)再将重组质粒转染至表达细胞中；
(5)细胞裂解液纯化融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述狂犬病病毒G蛋白的胞外域片段长度为1-440残基。
8.根据权利要求6所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中表达细胞为哺乳动物细胞。
9.根据权利要求6所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中使用聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯辅以超声波破碎机，制备表达狂犬病病毒G蛋白的细胞裂解液。
10.根据权利要求6所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中纯化的方法为使用共轭CTB012 Sepharose亲和力管柱回收狂犬病病毒G蛋白。
11.权利要求1-5任一项所述的融合蛋白、权利要求6-10任一项所述的制备方法制备的融合蛋白在如下(1)-(4)中至少一种的应用；
(1)制备狂犬病疫苗；
(2)制备狂犬病病毒G蛋白抗体；
(3)制备狂犬病病毒G蛋白抗原检测试剂盒；
(4)制备狂犬病病毒G蛋白抗体检测试剂盒。
Priority Applications (1)
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