CN118010992A - 新孢子虫融合蛋白作为新孢子虫检测抗原中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了新孢子虫融合蛋白作为新孢子虫检测抗原中的应用，本发明利用新孢子虫融合蛋白作为诊断靶标，将新孢子虫融合蛋白作为新孢虫抗体的抗原，制备成双抗原夹心金标法检测试纸卡，制得的检测试纸卡具有灵敏度更高，特异性更强优点，因此可用于新孢虫的检测。
Description
技术领域
本发明涉及检测领域，具体涉及新孢子虫融合蛋白作为新孢子虫检测抗原中的应用。
背景技术
新孢子虫病(Neosporiasis)，是一种全球性寄生虫病，由犬新孢子虫(Neosporacan-inum)引起。1984年新孢子虫病首次在挪威发现，四年后年被Dubey博士命名为犬新孢子虫。其终末宿主为犬和狐狸；中间宿主：猪牛羊马兔等等，该病会导致死胎、流产、新生儿的运动神经发育障碍等现象，其中对牛的危害尤为严重。该病呈世界性分布，各大洲数十余国家均有关于新孢子虫病的流行的报道，部分牛群血清抗体的阳性率达到80％左右。1957年美国最先报道了新孢子虫病的爆发，我国在北京首次发现新孢子虫病，又在十多个省份均发现新孢子虫病例。我国奶牛的血清抗体阳性率为30％左右。
目前诊断新孢子虫病的技术较多，其中新孢子虫病的分离培养技术由于寄生虫活力低和数量少，分离新孢子虫需要至少30天的时间，耗时长，检出率低。针对患病动物特别是野生动物来说存在毒力和患病周期的不确定性，因此新孢子虫的分离培养需要更加简便的方法；组织病理学作为有价值的诊断工具，但对新孢子虫的检测灵敏度较低；超微结构分析可以用来识别不同的寄生虫种类的特征，以及鉴别速殖子和囊肿受感染的细胞，但TEM样品制备复杂，耗时较长；目前已有多种形式的PCR(如实时荧光定量PCR、巢式PCR、多重PCR等)应用于新孢子虫病的诊断，但新孢子虫具有广泛的基因多样性，这种多样性可能会导致其生物学行为的多样性；间接免疫荧光是第一种用来检测新孢子虫病的血清学试验，由于它需要维持新孢子虫速殖子感染的细胞系，从而导致了较高的诊断费用；免疫印迹试验和酶联免疫吸附试验都具有较高的敏感性和特异性，常被用作血清学诊断试验的确证试验，但该技术操作不够简便。由于我国每年会从欧美等国引进大量的种牛和商品牛，为了避免该病的带入，新孢子虫病需要有高效、快速、准确的诊断方法，是成功控制和根除新孢子虫病的基础。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种新孢子虫融合蛋白作为新孢子虫检测抗原中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、新孢子虫融合蛋白作为新孢子虫检测抗原中的应用。
本发明优选的，所述新孢子虫融合蛋白为新孢子虫融合蛋白重组蛋白。
2、双抗原夹心金标法检测新孢子虫的试纸条，所述试纸条以新孢子虫融合蛋白作为检测线。
本发明优选的，所述试纸条还包括质控线，所述质控线上包被羊抗鼠IgG。
本发明优选的，所述检测线上新孢子虫融合蛋白标记鼠IgG。
本发明优选的，所述检测线上新孢子虫融合蛋白的浓度为1mg/mL。
本发明优选的，所述质控线上羊抗鼠IgG浓度为2mg/ml。
本发明的有益效果在于：本发明公开了新孢子虫融合蛋白作为新孢子虫检测抗原中的应用，本发明利用新孢子虫融合蛋白作为诊断靶标，将新孢子虫融合蛋白作为新孢子虫抗体的抗原，制备成双抗原夹心金标法检测试纸卡，制得的检测试纸卡具有灵敏度更高，特异性更强优点，对新孢子虫病的诊断具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为新孢子虫重组蛋白纯化的凝胶电泳结果图(从左到右通道依次为：Marker；1：0.5M Imidazole洗脱；2：50mM Imidazole洗脱；3流穿；4：细胞破碎后上样)。
图2为新孢子虫病抗体检测试剂条/卡的组装图(样品垫1、金标垫2、NC膜3、滤纸4、底板5。NC膜上设置有检测线31(T线)，质控线32(C线)，检测线31靠近金标垫，质控线32靠近滤纸4)。
图3为新孢子虫病抗体检测试剂条/卡检测结果图。
图4为部分临床样本验证结果图。
具体实施方式
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1、新孢子虫融合蛋白基因表达载体的构建
由于不同物种对同义密码子的使用频率是不同的，而这种密码子偏好性对翻译过程有影响。如果一条mRNA有很多成簇的稀有密码子，这会对核糖体的运动速度造成负面影响，大大降低蛋白表达水平。
新子孢虫融合蛋白基因是使用surface protein Nc-p43(GenBank:AAC15250.1)，具体为Nc-p43(100-400aa)。由于不同物种对同义密码子的使用频率是不同的，而这种密码子偏好性对翻译过程有影响。如果一条mRNA有很多成簇的稀有密码子，这会对核糖体的运动速度造成负面影响，大大降低蛋白表达水平。
本发明利用大肠杆菌作为表达系统，为了获得更高的表达效率和更高的表达量，在进行外源蛋白表达时进行了密码子优化，反翻译成核苷酸序列，氨基酸序列及优化后的核酸序列如下：
氨基酸序列为(SEQ ID NO.1)：
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RVGCKAGKNVCLLNVYVQSRESEVIGQVAHCAYSSNVRLRPITVNPENNGVTLICGPDGK
AFPDDYMNHHCTELDECKERPYSAVFPGFSSSFWTGEASGVAGATLTIPKDQFPSTAQTIYL
GCTGHPDDKQVTCVVPVNIEEVAKPAGAGSNPGGGSQPDQSSEKRDGEQVNKGKPPTGGS
RGTTTGKLNASLNAKDKGETGGENGDSPVLRGDACDELPSYVALSAASLTATAIFAY
核酸序列为(SEQ ID NO.2)：
CTGAGCGAAGATGATGGCCTGATTGTGTGCAACGAAAGCGATGGCGAAGATGAATGC
GAAAAAAACGCGGCGCCGCTGAGCACCTTTCTGCCGGGCGCGAAAAAAGAATGGGTG
ACCGGCACCCTGCAGCAGGGCATTAAAATTACCATTCCGGATGAACATTATCCGGCGA
CCAGCAAAGCGTTTCGCGTGGGCTGCAAAGCGGGCAAAAACGTGTGCCTGCTGAACGT
GTATGTGCAGAGCCGCGAAAGCGAAGTGATTGGCCAGGTGGCGCATTGCGCGTATAGC
AGCAACGTGCGCCTGCGCCCGATTACCGTGAACCCGGAAAACAACGGCGTGACCCTGA
TTTGCGGCCCGGATGGCAAAGCGTTTCCGGATGATTATATGAACCATCATTGCACCGA
ACTGGATGAATGCAAAGAACGCCCGTATAGCGCGGTGTTTCCGGGCTTTAGCAGCAGC
TTTTGGACCGGCGAAGCGAGCGGCGTGGCGGGCGCGACCCTGACCATTCCGAAAGATC
AGTTTCCGAGCACCGCGCAGACCATTTATCTGGGCTGCACCGGCCATCCGGATGATAA
ACAGGTGACCTGCGTGGTGCCGGTGAACATTGAAGAAGTGGCGAAACCGGCGGGCGC
GGGCAGCAACCCGGGCGGCGGCAGCCAGCCGGATCAGAGCAGCGAAAAACGCGATGG
CGAACAGGTGAACAAAGGCAAACCGCCGACCGGCGGCAGCCGCGGCACCACCACCGG
CAAACTGAACGCGAGCCTGAACGCGAAAGATAAAGGCGAAACCGGCGGCGAAAACGG
CGATAGCCCGGTGCTGCGCGGCGATGCGTGCGATGAACTGCCGAGCTATGTGGCGCTG
AGCGCGGCGAGCCTGACCGCGACCGCGATTTTTGCGTAT
由生工生物工程(上海)股份有限公司合成重组基因序列，并与pET30a质粒连接，形成重组表达载体。
实施例2、新孢子虫融合蛋白的表达
将新孢子虫融合基因质粒转化至大肠杆菌BL21中，涂布于含50μg/mL卡那霉素(上海生工，货号：K0408)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，用含有相同浓度的卡那霉素的300mL LB培养基37℃培养至OD600达0.6左右，用终浓度为1mM的IPTG(上海生工，货号：IB0168)进行诱导表达，诱导条件为：25℃，转速200rpm，4h。诱导之后，将培养液4℃，转速7000rpm，离心10min，收集菌体。
实施例3、新孢子虫融合蛋白的纯化及复性
用50mL上样缓冲液Binding Buffer(50mM Tris，0.2M Nacl，pH8.0)50mL破碎菌体；然后超声破碎，条件为600w，超声2s，间隔5s，共100次；最后12000rpm，30min，4℃离心收集上清，目的蛋白在上清中。接着过Ni柱一步纯化，用洗脱缓冲液Elution Buffer(50mMTris，0.2M Nacl，0.5M Imidazole，pH8.0)洗脱目的蛋白。利用PAGE凝胶电泳检测目的蛋白，结果如图1所示。纯化后的融合蛋白纯度很高，将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液(50mMTris，0.2M Nacl，pH8.0)透析，每隔12h换一次透析液，共3次。取出透析后的蛋白液，经0.22μm滤器过滤后，用NanoDrop测定浓度后，于-20℃保存备用。
实施例4、新孢子虫重组蛋白的应用
新孢子虫病抗体检测试纸条/卡的制备
(1)胶体金的烧制
在三角烧瓶中加入1000mL超纯水，在磁力加热搅拌器上加热至沸腾，然后加入10％氯金酸(sigma)4mL，再加入10％柠檬酸三钠溶液4.8mL，继续加热沸腾5min，然后冷却至室温后用0.22μm过滤器过滤胶体金后放置4℃备用。
(2)新孢子虫病融合蛋白的标记
取胶体金溶液100mL放入烧杯中，搅拌加入0.2M K2CO3调节金水pH，搅拌后加入1mg纯化后的新孢子虫病融合蛋白，室温搅拌30min，加入2mL Tris-casein(10：10g/L)溶液，室温搅拌30min后11000rpm离心20min，将上清小心吸出弃去，沉淀用金标稀释液(Tris2.5g/L，casein2.5g/L，0.03％ Proclin300)定容至1mL，此为标记好的新孢子虫病融合蛋白胶体金复合物。
(3)鼠IgG标记
取胶体金溶液100mL放入烧杯中，搅拌加入0.2M K2CO3调节金水pH至7.0，搅拌后加入1mg鼠IgG，室温搅拌30min，加入1mL Tris-casein(10：10g/L)溶液，室温搅拌30min后11000rpm离心20min，将上清小心吸出弃去，沉淀用金标稀释液(Tris2.5g/L，casein2.5g/L，0.03％ Proclin300)定容至1mL，此为标记好的鼠IgG胶体金复合物。
将上述金标复合物用金标稀释液稀释一定浓度，再加入0.2g/ml的蔗糖，37℃烘干8-12h后即制成金标垫。
(4)新孢子虫病融合蛋白的点膜
用点膜稀释液(2.9g/LNa2HPO4.12H2O，0.282g/L NaH2PO4.2H2O，8.775g/LNacl,200ul/LProclin)稀释新孢子虫病融合蛋白做为胶体金试纸条的检测线(Test-Line，T线)，用相同稀释液稀释羊抗鼠IgG至2mg/ml做为胶体金试纸条的质控线(Control-Line，C线)，将上述两种稀释之后的溶液划线至硝酸纤维素膜上，37℃烘干过夜。
(5)新孢子虫病抗体试纸条/卡的组装
将以上金标垫、包被好原料至硝酸纤维素膜(NC膜)的玻纤及滤纸、样品垫等安装底板上，组装成新孢子虫双抗原夹心法检测试纸条。具体安装方式如图2所示：分别将样品垫1、金标垫2、NC膜3和滤纸4安装在底板5上。其中样本垫1叠加一部分压在金标垫2上，金标垫2叠加一部分压在NC膜3上，滤纸4叠加一部分压在NC膜3上。其中NC膜3分为测试区和质控区，测试区设置检测线31(T线)，质控区设置质控线32(C线)，检测线31靠近金标垫，质控线32靠近滤纸4。
进一步，将组装好的试纸条用切条机切割成3mm条子，然后装入特别制定的塑料卡中，即成为成熟的检测试剂卡。
新孢子虫病抗体试纸条/卡的检测
加入10μL待检测样本(牛血清、血浆)至样本加样处(S)，再加入90μL样本稀释液至样本加样处(S)，室温放置10min后判定结果，结果判定标准如下(如图3所示)：
1)两条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，为阳性；
2)仅质控线出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性；
3)质控线未出现条带，表明此测试条已损坏，无论检测线是否出现条带，均应当更换新试纸条重新测试。
实施例5、新孢子虫病抗体试纸条/卡的临床标本验证
为了验证测试卡的准灵敏度，特异性及准确度，发明人进行了大量标本验证。共检测20份感染新孢子虫病阳性牛血清(样本编号1～20)，及50份正常未患病且未经免疫的牛血清(样本编号21～70)，部分检测结果如图4所示。其中灵敏度为：真阳性/(真阳性+假阴性)×100％，特异性为：真阴性/(真阴性+假阳性)×100％，准确度为：(真阳性+真阴性)/总标本数×100％。原始数据详见表1和表2.
表1、临床样本检测结果统计
表2、临床样本检测结果
由表1中结果得到数据真阳性20例，假阴性0例，真阴性49例，假阳性1例，灵敏度100％，95％置信区间为(83.16％-100.00％)；特异性为98％，95％置信区间为(89.35％-99.95％)；整体符合率为98.57％，95％置信区间为(92.30％-99.96％)。以上结果表明，利用本发明的新孢子虫病融合蛋白检测新孢子虫病抗体，具有非常高的灵敏度和特异性，可以作为制作新孢子虫病抗体检测试纸条的原料，并可以在临床检测中广泛应用。
与公开发表的文献比较，本项目采用的融合蛋白基因surface protein Nc-p43(GenBank:AAC15250.1),具有检测灵敏度高，特异性强的特点，公开文献1(MinLiao.Development of Rapid Immunochromatographic Test with Recombinant NcSAG1for Detection of Antibodies to Neospora caninumin Cattle.2005)采用的是Neospora caninum(NcSAG1)基因重组蛋白后，制备成检测新孢子虫病抗体胶体金试剂，其灵敏度为94.7％，特异性为and 93.5％；公开文献2(Bayin Chahan.Serodiagnosis ofNeospora caninuminfection in cattle by enzyme-linked immunosorbent assay withrecombinant truncated NcSAG1.2003)同样采用Neospora caninum(NcSAG1)基因重组蛋白后，制备的新孢子虫病抗体ELISA试剂盒，其灵敏度仅为90％；文献3(季新成.3种ELISA试剂盒对牛新孢子虫血清抗体比较检测.2012)表明：已上市的国外的3种检测新孢子虫血清抗体ELISA试剂盒，其灵敏度在85.7％～95.8；特异性在92.5％～98％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (7)
1.新孢子虫融合蛋白作为新孢子虫检测抗原中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述新孢子虫融合蛋白为新孢子虫融合蛋白重组蛋白。
3.双抗原夹心金标法检测新孢子虫的试纸条，其特征在于：所述试纸条以新孢子虫融合蛋白作为检测线。
4.根据权利要求3所述双抗原夹心金标法检测鸡球虫的试纸条，其特征在于：所述试纸条还包括质控线，所述质控线上包被羊抗鼠IgG。
5.根据权利要求3所述双抗原夹心金标法检测鸡球虫的试纸条，其特征在于：所述检测线上新孢子虫融合蛋白标记鼠IgG。
6.根据权利要求3所述双抗原夹心金标法检测鸡球虫的试纸条，其特征在于：所述检测线上新孢子虫融合蛋白的浓度为1mg/ml。
7.根据权利要求4所述双抗原夹心金标法检测鸡球虫的试纸条，其特征在于：所述质控线上羊抗鼠IgG浓度为2mg/ml。
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