CN111521787A - 新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡，包括样品垫、结合垫、分析膜以及吸收垫；所述的结合垫上包被有标记物标记的新布尼亚病毒重组抗原；所述的分析膜上设置有第一检测线和第二检测线，其中，所述的第一检测线上包被有抗人IgG，所述的第二检测线上包被有抗人IgM。本发明采用免疫层析技术，可以实现新布尼亚病毒IgG和IgM的同时快速免疫分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡及其制备方法。
背景技术
布尼亚病毒(Bunya virus)是具球形、有包膜和分节段负链RNA的1目病毒。因首先从乌干达西部的布尼亚韦拉分离到本目而得名。代表种-布尼亚韦拉病毒。直径90～100纳米，从包膜伸出许多糖蛋白突起，内有3个螺旋对称的核壳，分别含大(L)、中(M)、小(S)3个RNA节段，其总分子量为(6～7)×106。多数具有3种主要的病毒粒蛋白质。，病毒粒成熟时芽生细胞高尔基区表面光滑的小泡内或其附近。其中S片段属于双义RNA，分别编码核蛋白(nucleocapsid protein，NP)和非结构蛋白。在布尼亚病毒感染的临床病例中，病毒NP是主要的免疫原，患者体内相应的抗体水平较高。
发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是布尼亚病毒的一个新发现病毒种类，简称新布尼亚病毒。该病毒感染人体引起的发热伴血小板减少综合征(SFTS)以发热、血小板和白细胞减少为主要临床表现，多数病例有乏力，消化道症状，肌肉酸痛和淋巴结肿大等临床症状。病情危重者可发生休克、呼吸衰竭、弥漫性血管内凝血等多脏器功能衰竭而死亡。SFTS是一种新发出血热，为急性传染性疾病，SFTS感染的全国平均死亡率为5.3％在部分流行地区该病的病死率高达30％。
当人体受病毒侵害时，人体免疫系统启动应答机制，血液浆细胞产生抗体，根据结构的不同将免疫球蛋白分为五种，IgM、IgA、IgG、IgD和IgE。其中，IgM是胎儿合成的第一种Ig，主要存在于生物体血液中，对防止菌血症起主要作用，IgM抗体是免疫应答中首先分泌的抗体，一经感染快速产生，经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，IgM占血清免疫球蛋白总量的5％～10％，IgM阳性可作为病毒早期感染的诊断指标。因此，新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测有助于新布尼亚病毒感染的诊断。
目前新布尼亚病毒检测方法主要采用胶体金法、酶联免疫法和PCR-荧光探针法。申请号201711468267.3公开了用胶体金法测试新布尼亚病毒IgG、IgM，该专利可以同时测定新布尼亚病毒IgG、IgM，但是仅是定性，且胶体金检测灵敏度仍有待提高。申请号201210121489.9公开了用酶联免疫法测试新布尼亚病毒IgM，该专利仅测试新布尼亚病毒IgM，因此其检测结果仅针对新布尼病毒的早期感染情况进行评估，且酶联免疫法操作繁琐，特异性和灵敏性也有待提高。PCR-荧光探针法灵敏度和特异性都比较好，但检测物为病毒RNA，使用PCR-荧光探针法无法得到新布尼亚病毒IgG、IgM半定量结果，而且一般耗时较长，虽可同时检测较多样本，但需要大型仪器，检测过程复杂步骤多。
发明内容
本发明的目的是提供一种新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡及其制备方法，该试剂卡可以同时对新布尼亚病毒IgG、IgM含量进行半定量检测，检测灵敏度高，特异性好，并且操作简单、快捷。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明一方面提供一种新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡，包括样品垫、结合垫、分析膜以及吸收垫；其中，所述的结合垫上包被有标记物标记的新布尼亚病毒重组抗原；所述的分析膜上设置有第一检测线和第二检测线，其中，所述的第一检测线上包被有抗人IgG，所述的第二检测线上包被有抗人IgM。
本发明中的标记物为易测定且具有高度敏感性的物质，优选地，所述的标记物为荧光素、磷光素、荧光微球、磷光微球、磁性微球、发光底物、量子点中的一种或多种。优选地，所述的标记物的粒径为纳米级。
优选地，所述的抗人IgG抗体和所述的抗人IgM抗体为单克隆抗体和/或多克隆抗体。
进一步优选地，所述的抗人IgG抗体和所述的抗人IgM抗体为单克隆抗体。
优选地，所述的新布尼亚病毒重组抗原为真核表达和/或原核表达。
进一步优选地，所述的新布尼亚病毒重组抗原为真核表达。
优选地，所述样品垫和所述的结合垫采用玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜或纤维素滤纸或无纺布。
优选地，所述的分析膜材采用硝酸纤维素膜或者尼龙膜。
优选地，所述的分析膜上还设置有质控线。
本发明中，所述的结合垫上还包被有标记物标记的羊抗鸡IgY，所述的质控线上包被有抗鸡IgY。
优选地，所述的试剂卡采用荧光免疫分析仪进行检测或通过肉眼判读。荧光免疫层析法灵敏度高，特异性好，能半定量检测到痕量的新布尼亚病毒IgG抗体和新布尼亚病毒IgM抗体，因而有较大的技术优势。
优选地，所述的试剂卡的长度为5～10cm，宽度为2～8mm。
本发明的新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡可以对样本直接进行新布尼亚病毒IgG、IgM检测，也可以将样本稀释后加样，也可以是先加样本，然后再加稀释液进行检测。
所述的样本包括血清、血浆、全血和末梢血样本。
本发明的另一个方面是提供一种所述的新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备标记物标记的新布尼亚病毒重组抗原，其中，所述的标记物标记的新布尼亚病毒重组抗原的浓度为0.05mg/mL～5mg/mL；
(2)将步骤(1)制得物按照0.25～15μL/cm喷涂在所述的结合垫上；
(3)制备浓度独立为0.1～5mg/mL的抗人IgG和抗人IgM，然后用点膜仪以0.25～4.0μL/cm的喷量喷涂在分析膜材上分别形成所述的第一检测线和所述的第二检测线；
(4)将所述的样品垫、所述的结合垫、所述的分析膜以及所述的吸收垫组装在底板上制得所述的试剂卡。
本发明的制备方法中，在步骤(1)中可同时制备标记物标记的羊抗鸡IgY，并按步骤(2)喷涂在结合垫上，在步骤(3)中制备抗鸡IgY溶液并使用抗鸡IgY溶液在分析膜上形成质控线。
优选地，所述的底板可为PVC或其他替代板材。
本发明的检测原理为：
基于免疫层析技术，采用捕获法原理：样本(血清/血浆/全血/末梢血)加入试剂卡后，样本中待测物(IgG抗体、IgM抗体)分别与结合垫上的新布尼亚病毒重组抗原微球荧光探针结合形成复合物(即待测物-抗原纳米微球荧光探针复合物)，并通过毛细管作用层析至分析膜上与包被的二抗(两条检测线分别包被的二抗是抗人IgM抗体和抗人IgG抗体)形成复合物，即二抗-待测物-抗原纳米微球荧光探针复合物(T线)。另外，结合垫上的质控标记物同样通过毛细管作用层析至分析膜上与包被的质控线抗体形成控制线(C线)。当检测到样本中含有新布尼亚病毒IgG、IgM抗体时，含量越高信号越强，当无法检测到样本中新布尼亚病毒IgG、IgM抗体时，检测结果显示为阴性。
使用本发明的新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡，可以简化操作步骤，减少样本用量，节约时间和成本；并且可检样本种类多，包含血清、血浆、全血和末梢血样本，无需对样本进行前处理，操作简单，方便快捷。
由于采用上述技术方案，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明采用免疫层析技术，可以实现新布尼亚病毒IgG、IgM的同时快速免疫分析，即可用于半定量测定人血清、血浆、全血及末梢血中的新布尼亚病毒IgG、IgM，本发明的新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡属于体外诊断试剂。新布尼亚病毒IgM阳性可作为新布尼亚病毒早期感染的诊断指标。
附图说明
图1为具体实施方式的试剂卡的结构示意图；其中，1、样品垫；2、结合垫；3、分析膜；4、吸收垫；5、底板；31、检测线；32、质控线；
具体实施方式
下面结合具体的实施案例对本发明的技术方案进一步描述，但本发明不只限于下面的实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。本实施例中采用的试剂或原料均可市购获得，或者按照本领域常规方法制备得到。
实施例1
一种新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡的制备方法：具体制备步骤包括：
1)新布尼亚病毒重组抗原标记荧光微球、抗鸡IgY抗体标记荧光微球：
1.1微球活化：向1mg/ml荧光微球中加入用50mM，pH 7.0MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)溶解的5mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和5mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，活化60min，15000rpm离心30min，弃上清，沉淀用pH 7.0的50mM PBS(磷酸盐缓冲液)重悬，得到1mg/ml活化的荧光微球溶液；
1.2标记：将1.0mg新布尼亚病毒重组抗原(来自东部战区疾病预防控制中心医药生物技术研究所)、羊抗鸡IgY分别加入2mL1 mg/ml活化的荧光微球中，室温混匀1h，15000rpm离心30min，弃上清，沉淀用含5mg BSA(乙酰胺)的50mM PBS(磷酸盐缓冲液)溶液封闭1h，搅拌混匀，15000rpm离心30min，收集的沉淀保存于pH 7.0含0.5％BSA(牛血清白蛋白)的20mM Tris缓冲液中，得到浓度为0.1mg/mL新布尼亚病毒重组抗原标记荧光微球溶液、0.1mg/ml抗鸡IgY抗体标记荧光微球溶液；
2)结合垫制作：将步骤1)新布尼亚病毒重组抗原标记荧光微球溶液、羊抗鸡IgY抗体标记荧光微球溶液按照体积比1∶1混合成荧光微球混合液，按照10μL/cm喷涂在结合膜材上，即为结合垫干燥备用；
3)分析膜制作：分别将抗人IgG、抗人IgM和抗鸡IgY稀释至1mg/ml，在点膜仪上以1μL/cm的喷量喷涂在硝酸纤维素膜上，形成新布尼亚病毒IgG检测线、新布尼亚病毒IgM检测线和质控线，即为分析膜，干燥备用；
4)试剂盒的组装：将样品垫1、结合垫2、分析膜3和吸收垫4依次搭接地粘贴在PVC底板5上且结合垫2部分搭接在分析膜3的一侧，吸收垫4部分搭接在分析膜3的另一侧，样品垫1部分搭接在结合垫2上制成试纸条(如图1所示)；然后将试纸条裁切成长度为6.5cm，宽度为4mm的纸条，并装入卡壳以及包装中，即得新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡；试剂条可装入任意形式外卡壳，也可不装外卡壳直接使用。本实施例中，样品垫1和结合垫2的材质为玻璃纤维素膜。
试验例1
1、血清中新布尼亚病毒IgG、新布尼亚病毒IgM的检测
(1)样本的前处理
检测前将样本恢复至室温20-25℃；
(2)用实施例1制得的试纸卡进行检测
①开启荧光免疫分析仪；
②正面朝上平放检测卡，将10μL样本加入加样口，加入一定体积60～120μL样本稀释液，室温反应5-15min后，将检测卡放入荧光免疫分析仪中进行检测；
③截留在检测线和质控线的荧光微球在最佳激发光下，发出强烈的荧光条带；
④采用荧光免疫分析仪读取检测线和质控线的荧光强度，分析仪可通过内置的判读标准同时给出样品中新布尼亚病毒IgG、新布尼亚病毒IgM的半定量结果。
4、检出限：用新布尼亚病毒IgG、新布尼亚病毒IgM浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的样本进行测试，浓度为20ng/mL、50ng/mL的样本应均为阳性，浓度为10ng/mL的样本应均为阴性，检出限为10ng/mL。检测结果见表1。
表1检测试剂卡的最低检测限结果
5、阴性符合率：检测5份新布尼亚病毒IgG、新布尼亚病毒IgM的阴性参考品(N1-N5)，结果应均为阴性，检测结果见表2。
表2检测试剂卡的阴性符合率结果
从表2中可见，检测试剂卡的阴性符合率为100％。
6、阳性符合率：检测5份新布尼亚病毒IgG、新布尼亚病毒IgM的阳性参考品(P1-P5)，结果应均为阳性，检测结果见表3。
表3检测试剂卡的阳性符合率结果
从表3中可见，检测试剂卡的阳性符合率为100％。
7、重复性：取同一批号的检测试剂卡10人份，检测重复性参考品(新布尼亚病毒IgG、IgM，浓度为50ng/mL)，检测结果一致，检测结果应均为阳性，检测结果见表4。
表4检测试剂卡的重复性结果
表1～表4中，“-”表示阴性，“+”表示弱阳性，“++”表示阳性，“+++”表示强阳性。
本发明的试剂条可用于血清、血浆、全血及末梢血的样本中新布尼亚病毒IgG、IgM半定量(定性)检测，且无需对样本进行前处理，操作简单，方便快捷。检测时仅需将样本加入加样口，然后加入一定体积0～200μL样本稀释液(如0.09％NaCl)，3～30min后通过配套仪器进行检测并自动计算，即可得到样本中IgG、IgM的含量。本发明的新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡仅需对一份样本进行一次加样和一次检测即可同时得到新布尼亚病毒IgG和IgM的半定量结果，简化了操作步骤，减少了样本用量，节约了检测时间，节省了检测成本，本发明的新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡检测灵敏度高，特异性好。
以上对本发明做了详尽的描述，目的在于让本领域内的技术人员了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡，其特征在于：包括样品垫、结合垫、分析膜以及吸收垫；所述的结合垫上包被有标记物标记的新布尼亚病毒重组抗原；所述的分析膜上设置有第一检测线和第二检测线，其中，所述的第一检测线上包被有抗人IgG，所述的第二检测线上包被有抗人IgM。
2.根据权利要求1所述的联合检测试剂卡，其特征在于：所述的标记物为荧光素、磷光素、荧光微球、磷光微球、磁性微球、发光底物、量子点中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的联合检测试剂卡，其特征在于：所述的新布尼亚病毒重组抗原为真核表达和/或原核表达。
4.根据权利要求1所述的检测试剂卡，其特征在于：所述的抗人IgG和所述的抗人IgM为单克隆抗体和/或多克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的检测试剂卡，其特征在于：所述的样品垫和所述的结合垫采用玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜或纤维素滤纸或无纺布；所述的分析膜材采用硝酸纤维素膜或者尼龙膜。
6.根据权利要求1所述的联合检测试剂卡，其特征在于：所述的分析膜上还设置有质控线。
7.根据权利要求1所述的联合检测试剂卡，其特征在于：所述的试剂卡采用免疫分析仪进行检测或通过肉眼判读。
8.一种如权利要求1至7中任一项所述的新布尼亚病毒IgG、IgM联合检测试剂卡的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)制备标记物标记的新布尼亚病毒重组抗原，其中，所述的标记物标记的新布尼亚病毒重组抗原的浓度为0.05mg/mL～5mg/mL；
(2)将步骤(1)制得物按照0.25～15μL/cm喷涂在所述的结合垫上；
(3)制备浓度独立为0.1～5mg/mL的抗人IgG和抗人IgM，然后用点膜仪以0.25～4.0μL/cm的喷量喷涂在分析膜材上分别形成所述的第一检测线和所述的第二检测线；
(4)将所述的样品垫、所述的结合垫、所述的分析膜以及所述的吸收垫组装在底板上制得所述的试剂卡。
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