CN112394181A - 联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及其制备方法 - Google Patents

联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及其制备方法，采用免疫捕获法的检测原理，以发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原作为胶体金标记抗原，链霉亲和素作为间接质控标记原料，以抗人IgM单克隆抗体、抗人IgG单克隆抗体作为检测线包被用的抗体，以生物素‑BSA偶联物作为质控线原料，选择金标链霉亲和素及生物素‑BSA偶联物的组合作为间接质控，能有效准确地检测血液中是否存在抗发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或IgG抗体，本发明具有灵敏度高以及特异性强的特点，同时成本低、使用方便，可用于临床医生对发热伴血小板减少综合征病毒感染者的辅助诊断。

Description

联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体 金试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及其制备方法，具体地说是一种通过免疫捕获法实现定性检测人血清中的发热伴血小板减少综合征病毒特异性IgM抗体、IgG抗体，从而用于对发热伴血小板减少综合征病毒感染患者的辅助诊断。
背景技术
发热伴血小板减少综合征病毒，主要以发热、胃肠道症状、血小板减少和白细胞减少为主要临床表现的感染性病例，少数患者因多器官衰竭死亡的情况。
发热伴血小板减少综合征病毒感染宿主后首先有特异性IgM抗体出现，当达到峰值后滴度逐渐降低，IgM 抗体阳性表明正在感染，而血清中IgG抗体出现比较晚，在血清中可存在时间相对长。因此，发热伴血小板减少综合征病毒特异性IgM抗体的检出对于发热伴血小板减少综合征病毒早期（急性）感染的诊断、病情轻重、转归及防治效果的判断具有重要意义，发热伴血小板减少综合征病毒特异IgG抗体阳性说明存在既往感染。
现有用于发热伴血小板减少综合征病毒的检测试剂存在灵敏度低及特异性差的缺点，时常出现试剂诊断假阴性、假阳性的困扰，没有精准的诊断难以有精准的治疗，因此如何精准地筛查病例，是亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高以及特异性强的联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法。
本发明提供技术方案如下：一种联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，包括盒体、位于所述盒体内的粘贴底板，所述粘贴底板上延长度方向依次粘贴有样本垫、胶体金结合垫、NC膜、吸样垫，所述NC膜上靠近所述胶体金结合垫侧设有IgM检测线和IgG检测线，所述NC膜上靠近所述吸样垫侧设有质控线，其特征在于：所述胶体金结合垫上喷涂有胶体金结合物，所述胶体金结合物包含胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原以及胶体金标记的链霉亲和素；
所述IgM检测线上包被有抗人IgM单克隆抗体；
所述IgG检测线上包被有抗人IgG单克隆抗体；
所述质控线上包被有生物素-BSA偶联物。
本发明提供一种联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，采用免疫捕获法的检测原理，以发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原作为胶体金标记抗原，链霉亲和素作为间接质控标记原料，以抗人IgM单克隆抗体、抗人IgG单克隆抗体作为检测线包被用的抗体，以生物素-BSA偶联物作为质控线原料，选择金标链霉亲和素及生物素-BSA偶联物的组合作为间接质控，能有效准确地检测血液中是否存在抗发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或IgG抗体，本发明具有灵敏度高以及特异性强的特点，同时成本低、使用方便，可用于临床医生对发热伴血小板减少综合征病毒感染者的辅助诊断。
作为本发明的进一步改进，所述胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原的制备方法包括以下步骤：
S101、胶体金溶液制备：取1mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液中，加热至沸腾，再加入1-2mL1.0-1.3wt%柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却；
S102、金标液制备：取1mL胶体金溶液加入20μL 0.1M K2CO3溶液，然后加入20-25μg发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原混匀后，再加入100μL 10％BSA溶液混匀；
S103、金标液纯化：将金标液离心后弃去上清，加入PB清洗液混匀沉淀，离心后弃去上清，再加入金标复溶液溶解，即得。
本申请发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原的最适标记pH条件为1ml胶体金中加入0.1M的K2CO3 20μl，此条件下胶体金颜色仍保持红色，稳定性最好；最适标记量为20-25μg/ml，当少于20μg/ml时，呈现出由红变蓝的聚沉现象，而20-25μg/ml范围仍保持红色不变；本申请金标液纯化采用高速或超速离心，相较凝胶过滤纯化，凝胶纯化过程中，凝胶填料经胶体金过滤后不能再生，成本较高，而离心法方法简单，纯化的胶体金颗粒如在短期内尽快点喷玻璃纤维后烘干，即可长期保存。本申请弃去上清后收集沉淀，加入原胶体金溶液1/3体积的PB清洗液混匀沉淀。
作为本发明的进一步改进，所述胶体金标记的链霉亲和素的制备方法包括以下步骤：
S201、胶体金溶液制备：取1mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液中，加热至沸腾，再加入1-2mL1.0-1.3wt%柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却；
S202、金标液制备：取1mL胶体金溶液加入5μL 0.1M K2CO3溶液，然后加入20-25μg链霉亲和素混匀后，再加入20μL 10％BSA溶液混匀；
S203、金标液纯化：将金标液离心后弃去上清，加入PB清洗液混匀沉淀，离心后弃去上清，再加入金标复溶液溶解，即得。
本申请链霉亲和素的最适标记pH条件为1ml胶体金中加入0.1M的 K2CO3 5μl，此条件下胶体金颜色仍保持红色，稳定性最好；最适标记量为20-25μg/ml，当少于20μg/ml时，呈现出由红变蓝的聚沉现象，而20-25μg/ml范围仍保持红色不变；本申请金标液纯化采用高速或超速离心，相较凝胶过滤纯化，凝胶纯化过程中，凝胶填料经胶体金过滤后不能再生，成本较高，而离心法方法简单，纯化的胶体金颗粒如在短期内尽快点喷玻璃纤维后烘干，即可长期保存。本申请弃去上清后收集沉淀，加入原胶体金溶液1/3体积的PB清洗液混匀沉淀。
所述0.1M的 K2CO3的制备为称取1.38g K2CO3，加纯化水溶解后定容至100ml。
所述PB清洗液为称取BSA 0.1g溶于20ml的0.1M PB（pH7.0±0.1）中，充分溶解后稀释至1000ml。
所述金标复溶液为PG2复溶液，具体为称取Tris 2.42g、BSA 10g、NaN3 0.2g、蔗糖200g及海藻糖 50g，先用800ml纯化水将其充分溶解，调整pH值至8.0±0.1，最后稀释至1000ml。
本申请选择捕获法检测人血清内发热伴血小板减少综合征病毒特异性IgG以及IgM，因目前没有针对发热伴血小板减少综合征病毒的抗体，所以本申请选择金标链霉亲和素及生物素-BSA偶联物的组合作为间接质控，
作为本发明的进一步改进，所述胶体金结合物中，胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原和胶体金标记的链霉亲和素以1:1的体积比混匀。
作为本发明的进一步改进，所述胶体金结合物中胶体金的粒径为25-35nm。本申请选择柠檬酸三钠还原法来制备胶体金，相较于鞣酸-柠檬酸三钠还原法中，所配鞣酸溶液一定要避光保存，而且开始温度必须控制在60℃，控温操作较为不便，制作胶体金的体积较小，大量制备不太方便，故选择柠檬酸三钠还原法来制备胶体金。胶体金是氯金酸在还原剂的作用下，聚合成的具有一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水性胶体溶液，根据实验目的的需要，可以采用不同的方法制备出直径大小不同的胶体金颗粒，本申请通过测试25nm和30nm的胶体金能同时满足最低检出量质控品和阴性血清的检出时间和检测结果的要求。因此选择25-35nm的胶体金用于标记，确定胶体金颗粒的制备工艺：1mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液中，加热至沸腾，再加入1-2mL1.0-1.3wt%柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却备用。据此工艺生产的胶体金颗粒满足试剂的检测要求。
作为本发明的进一步改进，所述质控线上生物素-BSA偶联物的包被浓度为0.04-0.07mg/mL；优选生物素-BSA偶联物的包被液选择pH为7.4的15mM PBS，此条件下检测线最清晰，包被效果最好。
所述IgM检测线上抗人IgM单克隆抗体包被浓度为1.8－2.3mg/mL；优选抗人IgM单克隆抗体包被液选择的pH为7.4的10mM PB溶液，此条件下检测线最清晰，包被效果最好。
所述IgG检测线上抗人IgG单克隆抗体包被浓度为1.8－2.3mg/mL。优选抗人IgG单克隆抗体包被液选择pH为7.8的10mM PBS包被缓冲液，此条件下检测线最清晰，包被效果最好。
包被步骤为：
S301、 分别用包被液将质检合格的抗人IgM单克隆抗体、抗人IgG单克隆抗体和生物素-BSA偶联物稀释至使用浓度。
S302、分别将抗人IgM单克隆抗体、抗人IgG单克隆抗体装入加样泵1、加样泵2中。
S303、设定包被程序：设定划线速度为100mm/s，喷液量为0.1μL/mm。
S304、 进入工作状态，按启动键，开始包被，做标记符号。
S305、IgM检测线及IgG检测线包被完毕后，对加样泵1及加样泵2按照喷金划线机清洗程序进行清洗，然后将生物素-BSA偶联物装入加样泵1中 。
S306、设定质控线包被程序：设定划线速度为100mm/s，喷液量为0.1μL/mm。
S307、进入工作状态，按启动键，开始质控线包被。
一种联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、胶体金结合垫的制备：将胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原以及胶体金标记的链霉亲和素混匀后喷涂在玻璃纤维膜上，干燥得到胶体金结合垫；
S2、NC膜的制备：将抗人IgM单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上形成IgM检测线，将抗人IgG单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上形成IgG检测线，将生物素-BSA偶联物包被在硝酸纤维素膜上形成质控线，干燥得到NC膜；
S3、切割装配：在粘贴底板的长度方向上依次粘贴样本垫、步骤S1制得的胶体金结合垫、步骤S2制得的NC膜以及吸样垫，切割成3.5mm±0.5mm宽的试纸条，装入盒体，即得。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中，所述胶体金结合垫上金标N蛋白的喷涂量为0.5-1μL/mm。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中，抗人IgM单克隆抗体、抗人IgG单克隆抗体和生物素-BSA偶联物在硝酸纤维素膜上的喷液量均为0.1μL/mm。此条件下，检测发热伴血小板减少综合征病毒特异性IgG抗体和发热伴血小板减少综合征病毒特异性IgM抗体的阴、阳性符合率均可达到100%。
本申请采用喷涂胶体金，动力是气压。优点是可定量，喷点均匀，表现在释放时金呈均匀浪涌状一次冲过膜，批内差小，较浸泡法节约金标抗体用量，从而节约成本，并能缩短干燥时间及降低由此可能引起的抗体失活的风险。
作为本发明的进一步改进，步骤S1、S2中，所述干燥是在湿度低于40%、温度20~37℃条件下干燥。当干燥温度为45~50℃，使部分原料发生变性导致符合率降低，影响产品灵敏度，而当湿度控制在低于40%的条件下，20~37℃的干燥温度均能保持金标记原料的活性。
本申请的检测原理：本申请是基于抗原与抗体结合的原理，采用免疫捕获法检测人血清中的发热伴血小板减少综合征病毒特异性抗体IgM/IgG。利用硝酸纤维素膜(NC膜)制备胶体金免疫层析试剂条，在硝酸纤维素膜上的检测区（M）包被抗人IgM 单克隆抗体，在检测区（G）包被抗人IgG单克隆抗体，在质控区（C）包被生物素-BSA偶联物，将发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原及链霉亲和素偶联在胶体金上作为金结合物，其中金标记链霉亲和素为间接质控。检测时，如果样本中含有发热伴血小板减少综合征病毒特异性IgG抗体和特异性 IgM抗体，在检测区M和G均出现一条紫红色条带；若样本中仅含特异性IgM抗体，在检测区M出现一条紫红色条带，G不出现紫红色条带；若样本中仅含特异性IgG抗体，在检测区G出现一条紫红色条带，M不出现紫红色条带；若样本中不含有发热伴血小板减少综合征病毒特异性抗体，则检测区（M和G）内均不会出现紫红色条带。但由于体系中使用金标记链霉亲和素作为间接质控，故无论样本中是否存在发热伴血小板减少综合征病毒特异性IgM/IgG抗体，金标记链霉亲和素均会与C线包被的生物素-BSA偶联物发生反应形成紫红色条带，其是判定是否有足够样本及层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂条的内控标准。
本发明相对于现有技术，有以下优点：
本发明提供一种联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，采用免疫捕获法的检测原理，以发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原作为胶体金标记抗原，链霉亲和素作为间接质控标记原料，以抗人IgM单克隆抗体、抗人IgG单克隆抗体作为检测线包被用的抗体，以生物素-BSA偶联物作为质控线原料，选择金标链霉亲和素及生物素-BSA偶联物的组合作为间接质控，能有效准确地检测血液中是否存在抗发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或IgG抗体，本发明具有灵敏度高以及特异性强的特点，同时成本低、使用方便，可用于临床医生对发热伴血小板减少综合征病毒感染者的辅助诊断。
本发明一种联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法，制备工艺简单，产品使用简便通过免疫捕获法实现定性检测人血清中的发热伴血小板减少综合征病毒特异性IgM抗体、IgG抗体，从而用于对发热伴血小板减少综合征病毒感染患者的辅助诊断，具有检测灵敏度高、特异性强的特点。
附图说明
图1是本发明联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式说明本发明的具体技术方案。
联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，包括盒体、位于所述盒体内的粘贴底板1，所述粘贴底板1上延长度方向依次粘贴有样本垫2、胶体金结合垫3、NC膜4、吸样垫5，所述NC膜4上靠近所述胶体金结合垫3侧设有IgM检测线41和IgG检测线42，所述NC膜4上靠近所述吸样垫5侧设有质控线43，所述胶体金结合垫3上喷涂有胶体金结合物，所述胶体金结合物包含胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原以及胶体金标记的链霉亲和素；
所述IgM检测线41上包被有抗人IgM单克隆抗体；
所述IgG检测线42上包被有抗人IgG单克隆抗体；
所述质控线43上包被有生物素-BSA偶联物。
优选的，所述胶体金结合物中，胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原和胶体金标记的链霉亲和素以1:1的体积比混匀。
优选的，所述胶体金结合物中胶体金的粒径为25-35nm。
优选的，所述质控线43上生物素-BSA偶联物的包被浓度为0.04-0.07mg/mL，所述IgM检测线41上抗人IgM单克隆抗体包被浓度为1.8－2.3mg/mL，所述IgG检测线42上抗人IgG单克隆抗体包被浓度为1.8－2.3mg/mL。
本发明提供一种联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，采用免疫捕获法的检测原理，以发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原作为胶体金标记抗原，链霉亲和素作为间接质控标记原料，以抗人IgM单克隆抗体、抗人IgG单克隆抗体作为检测线包被用的抗体，以生物素-BSA偶联物作为质控线原料，选择金标链霉亲和素及生物素-BSA偶联物的组合作为间接质控，能有效准确地检测血液中是否存在抗发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或IgG抗体，本发明具有灵敏度高以及特异性强的特点，同时成本低、使用方便，可用于临床医生对发热伴血小板减少综合征病毒感染者的辅助诊断。
实施例1、联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法：
S1：、胶体金结合垫3的制作：取1mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液中，加热至沸腾，再加入2mL1.0wt%柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却得胶体金溶液；取1mL胶体金溶液加入20μL 0.1M K2CO3溶液，然后加入23μg发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原混匀后，再加入100μL 10％BSA溶液混匀，得金标发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原液；将金标发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原液离心后弃去上清，加入PB清洗液混匀沉淀，离心后弃去上清，再加入金标复溶液溶解，得胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原；取1mL胶体金溶液加入5μL 0.1M K2CO3溶液，然后加入23μg链霉亲和素混匀后，再加入20μL 10％BSA溶液混匀，得金标链霉亲和素液；将金标链霉亲和素液离心后弃去上清，加入PB清洗液混匀沉淀，离心后弃去上清，再加入金标复溶液溶解，得胶体金标记的链霉亲和素；将胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原和胶体金标记的链霉亲和素以1:1体积比混合均匀后，以1.0μL/cm喷涂在玻璃纤维膜上，干燥得到胶体金结合垫3；
S2、NC膜4的制备：将抗人IgM单克隆抗体以2.0mg/mL浓度包被在硝酸纤维素膜上形成IgM检测线41，将抗人IgG单克隆抗体以2.0mg/mL浓度包被在硝酸纤维素膜上形成IgG检测线42，将生物素-BSA偶联物以0.04mg/mL浓度包被在硝酸纤维素膜上形成质控线43，干燥得到NC膜4；
S3、切割装配：如图1所示，在干燥环境下（温度37℃，湿度＜40%)取粘贴底板1，在粘贴底板1中央贴上包被好抗体的NC膜4，吸样垫5紧贴粘贴底板1叠压NC膜4上缘，NC膜4下缘粘贴胶体金结合垫3，胶体金结合垫3下缘粘贴上样品垫2，完成试剂大板的组装；用切割机将贴好的粘贴底板1切成适当宽度3.5mm宽的试纸条；将裁切好的试纸条正确放在盒体（图中未画出）内。
实施例2、联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法：
S1：、胶体金结合垫3的制作：取1mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液中，加热至沸腾，再加入1mL1.3wt%柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却得胶体金溶液；取1mL胶体金溶液加入20μL 0.1M K2CO3溶液，然后加入25μg发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原混匀后，再加入100μL 10％BSA溶液混匀，得金标发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原液；将金标发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原液离心后弃去上清，加入PB清洗液混匀沉淀，离心后弃去上清，再加入金标复溶液溶解，得胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原；取1mL胶体金溶液加入5μL 0.1M K2CO3溶液，然后加入25μg链霉亲和素混匀后，再加入20μL 10％BSA溶液混匀，得金标链霉亲和素液；将金标链霉亲和素液离心后弃去上清，加入PB清洗液混匀沉淀，离心后弃去上清，再加入金标复溶液溶解，得胶体金标记的链霉亲和素；将胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原和胶体金标记的链霉亲和素以1:1体积比混合均匀后，以0.8μL/cm喷涂在玻璃纤维膜上，干燥得到胶体金结合垫3；
S2、NC膜4的制备：将抗人IgM单克隆抗体以1.8mg/mL浓度包被在硝酸纤维素膜上形成IgM检测线41，将抗人IgG单克隆抗体以1.8mg/mL浓度包被在硝酸纤维素膜上形成IgG检测线42，将生物素-BSA偶联物以0.07mg/mL浓度包被在硝酸纤维素膜上形成质控线43，干燥得到NC膜4；
S3、切割装配：如图1所示，在干燥环境下（温度20℃，湿度＜40%)取粘贴底板1，在粘贴底板1中央贴上包被好抗体的NC膜4，吸样垫5紧贴粘贴底板1叠压NC膜4上缘，NC膜4下缘粘贴胶体金结合垫3，胶体金结合垫3下缘粘贴上样品垫2，完成试剂大板的组装；用切割机将贴好的粘贴底板1切成适当宽度4mm宽的试纸条；将裁切好的试纸条正确放在盒体（图中未画出）内。
实施例3、联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法：
S1：、胶体金结合垫3的制作：取1mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液中，加热至沸腾，再加入1.5mL1.2wt%柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却得胶体金溶液；取1mL胶体金溶液加入20μL 0.1M K2CO3溶液，然后加入20μg发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原混匀后，再加入100μL 10％BSA溶液混匀，得金标发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原液；将金标发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原液离心后弃去上清，加入PB清洗液混匀沉淀，离心后弃去上清，再加入金标复溶液溶解，得胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原；取1mL胶体金溶液加入5μL 0.1M K2CO3溶液，然后加入20μg链霉亲和素混匀后，再加入20μL 10％BSA溶液混匀，得金标链霉亲和素液；将金标链霉亲和素液离心后弃去上清，加入PB清洗液混匀沉淀，离心后弃去上清，再加入金标复溶液溶解，得胶体金标记的链霉亲和素；将胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原和胶体金标记的链霉亲和素以1:1体积比混合均匀后，以0.5μL/cm喷涂在玻璃纤维膜上，干燥得到胶体金结合垫3；
S2、NC膜4的制备：将抗人IgM单克隆抗体以2.3mg/mL浓度包被在硝酸纤维素膜上形成IgM检测线41，将抗人IgG单克隆抗体以2.3mg/mL浓度包被在硝酸纤维素膜上形成IgG检测线42，将生物素-BSA偶联物以0.05mg/mL浓度包被在硝酸纤维素膜上形成质控线43，干燥得到NC膜4；
S3、切割装配：如图1所示，在干燥环境下（温度30℃，湿度＜40%)取粘贴底板1，在粘贴底板1中央贴上包被好抗体的NC膜4，吸样垫5紧贴粘贴底板1叠压NC膜4上缘，NC膜4下缘粘贴胶体金结合垫3，胶体金结合垫3下缘粘贴上样品垫2，完成试剂大板的组装；用切割机将贴好的粘贴底板1切成适当宽度3.0mm宽的试纸条；将裁切好的试纸条正确放在盒体（图中未画出）内。
对上述实施例1-3所制备联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒进行临床前自测试验，测试试验包括以下项目：
（1）灵敏度测试：
测试样品：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供的样本（年龄段22-77岁）共1036份，男675份，女361份；其中468份为发热伴血小板减少综合征病毒抗体阴性血清样本，264份为发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgM阳性血清样本，206份为发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgG阳性血清样本，98份为发热伴血小板减少综合征病毒抗体IgM及IgG均阳性血清样本；
检测参照：以国家药品监督管理局已批准的SFTSV实时定量PCR核酸检测试剂“从患者标本中检测到发热伴血小板综合征病毒核酸”作为该样本中是否存在SFTSV IgM抗体的判定依据；以免疫荧光试验（IFAT）的检测结果判定该样本中是否存在SFTSV IgG抗体作为检测IgG抗体的判定依据；
测试方法：用加样枪加100uL或用滴定管加3滴样本到实施例1-3制备的联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒样本垫上，用定时器计时，平放静置2-15分钟，观察并记录试剂盒的显色结果，测试结果如表1所示。
表1灵敏度测试结果
Figure DEST_PATH_IMAGE002AAA
由表1检测结果表面，实施例1-3制备的试剂盒检测发热伴血小板减少综合征病毒抗体阴性血清样本结果均为阴性，阴性符合率均为468/468；
检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM抗体阳性血清样本，IgM检测线显色率分别为262/264、261/264、261/264，且IgG检测线显色率为0/264；
检测发热伴血小板减少综合征病毒IgG抗体阳性血清样本，IgG检测线显色率分别为205/206、204/206、205/206，且IgM检测线显色率为0/206；
检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM及IgG抗体均阳性血清样本，IgM检测线显色率分别为96/98、95/98、96/98，IgG检测线显色率分别为97/98、96/98、97/98；
因此本申请实施例1-3制备的联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，检测发热伴血小板减少综合征病毒抗体阴性血清样本，能够有效准确地检测血液中是否存在抗发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或IgG抗体，均具有很好准确性和灵敏度。
（2）特异性测试：
测试样本及测试方法：收集发热伴血小板减少综合征病毒特异性IgM/IgG检测阴性的流感病毒抗体阳性血清20份、汉坦病毒感染阳性血清15份、乙型肝炎病毒表面抗原阳性血清18份、丙型肝炎病毒抗体阳性血清20份、HIV阳性血清16份、抗核抗体18份及类风湿因子阳性血清20份，用本试剂对这些样本进行检测，看是否会有假阳性情况产生，从而对本试剂交叉反应现象进行研究，测试结果如表2所示。
表2交叉测试结果
Figure 761654DEST_PATH_IMAGE003
根据表2试验结果，实施例1-3制备的试剂盒分别检测上述血清后均为阴性，无假阳结果产生，故说明所研制的联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒不与汉坦病毒感染、流感病毒抗体阳性血清、乙型肝炎病毒表面抗原阳性血清、丙型肝炎病毒抗体阳性血清、HIV阳性血清、抗核抗体阳性血清及类风湿因子阳性血清发生交叉反应，试剂特异性良好。
本发明提供一种联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，采用免疫捕获法的检测原理，以发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原作为胶体金标记抗原，链霉亲和素作为间接质控标记原料，以抗人IgM单克隆抗体、抗人IgG单克隆抗体作为检测线包被用的抗体，以生物素-BSA偶联物作为质控线原料，选择金标链霉亲和素及生物素-BSA偶联物的组合作为间接质控，能有效准确地检测血液中是否存在抗发热伴血小板减少综合征病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或IgG抗体，本发明具有灵敏度高以及特异性强的特点，同时成本低、使用方便，可用于临床医生对发热伴血小板减少综合征病毒感染者的辅助诊断。

Claims (9)

1.联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，包括盒体、位于所述盒体内的粘贴底板（1），所述粘贴底板（1）上延长度方向依次粘贴有样本垫（2）、胶体金结合垫（3）、NC膜（4）、吸样垫（5），所述NC膜（4）上靠近所述胶体金结合垫（3）侧设有IgM检测线（41）和IgG检测线（42），所述NC膜（4）上靠近所述吸样垫（5）侧设有质控线（43），其特征在于：所述胶体金结合垫（3）上喷涂有胶体金结合物，所述胶体金结合物包含胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原以及胶体金标记的链霉亲和素；
所述IgM检测线（41）上包被有抗人IgM单克隆抗体；
所述IgG检测线（42）上包被有抗人IgG单克隆抗体；
所述质控线（43）上包被有生物素-BSA偶联物；
所述胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原的制备方法包括以下步骤：
S101、胶体金溶液制备：取1mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液中，加热至沸腾，再加入1-2mL1.0-1.3wt%柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却；
S102、金标液制备：取1mL胶体金溶液加入20μL 0.1M K2CO3溶液，然后加入20-25μg发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原混匀后，再加入100μL 10％BSA溶液混匀；
S103、金标液纯化：将金标液离心后弃去上清，加入PB清洗液混匀沉淀，离心后弃去上清，再加入金标复溶液溶解，即得。
2.根据权利要求1所述的联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，其特征在于，所述胶体金标记的链霉亲和素的制备方法包括以下步骤：
S201、胶体金溶液制备：取1mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液中，加热至沸腾，再加入1-2mL1.0-1.3wt%柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却；
S202、金标液制备：取1mL胶体金溶液加入5μL 0.1M K2CO3溶液，然后加入20-25μg链霉亲和素混匀后，再加入20μL 10％BSA溶液混匀；
S203、金标液纯化：将金标液离心后弃去上清，加入PB清洗液混匀沉淀，离心后弃去上清，再加入金标复溶液溶解，即得。
3.根据权利要求1所述的联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，其特征在于：所述胶体金结合物中，胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原和胶体金标记的链霉亲和素以1:1的体积比混匀。
4.根据权利要求1所述的联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，其特征在于：所述胶体金结合物中胶体金的粒径为25-35nm。
5.根据权利要求1所述的联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，其特征在于：所述质控线（43）上生物素-BSA偶联物的包被浓度为0.04-0.07mg/mL，所述IgM检测线（41）上抗人IgM单克隆抗体包被浓度为1.8－2.3mg/mL，所述IgG检测线（42）上抗人IgG单克隆抗体包被浓度为1.8－2.3mg/mL。
6.一种根据权利要求1-5任一项所述的联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、胶体金结合垫（3）的制备：将胶体金标记的发热伴血小板减少综合征病毒重组抗原以及胶体金标记的链霉亲和素混匀后喷涂在玻璃纤维膜上，干燥得到胶体金结合垫（3）；
S2、NC膜（4）的制备：将抗人IgM单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上形成IgM检测线（41），将抗人IgG单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上形成IgG检测线（42），将生物素-BSA偶联物包被在硝酸纤维素膜上形成质控线（43），干燥得到NC膜（4）；
S3、切割装配：在粘贴底板（1）的长度方向上依次粘贴样本垫（2）、步骤S1制得的胶体金结合垫（3）、步骤S2制得的NC膜（4）以及吸样垫（5），切割成3.5mm±0.5mm宽的试纸条，装入盒体，即得。
7.根据权利要求6所述的联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述胶体金结合垫（3）上金标N蛋白的喷涂量为0.5-1μL/mm。
8.根据权利要求6所述的联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤S2中，抗人IgM单克隆抗体、抗人IgG单克隆抗体和生物素-BSA偶联物在硝酸纤维素膜上的喷液量均为0.1μL/mm。
9.根据权利要求6所述的联合检测发热伴血小板减少综合征病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤S1、S2中，所述干燥是在湿度低于40%、温度20~37℃条件下干燥。
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