CN108226533A - 新布尼亚病毒抗原抗体检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新布尼亚病毒抗原抗体检测试剂盒，包括新布尼亚病毒抗原检测试纸卡和/或新布尼亚病毒抗体检测试纸卡和层析稀释液，其中，新布尼亚病毒抗原检测试纸卡包含新布尼亚病毒抗原胶体金层析检测试剂，新布尼亚病毒抗体检测试纸卡包含新布尼亚病毒抗体胶体金层析检测试剂，所述层析稀释液由終浓度1％casein，0.4％Tween‑20和10mMPBS缓冲系统组成；所述试剂盒具有特异性、敏感性等特点，在消除、控制新布尼亚病的工作中可起到重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及试剂盒领域，尤其是一种新布尼病毒亚抗原抗体检测试剂盒。
背景技术
新布尼亚病毒，是布尼亚病毒科的一个新发现病毒种类，全称为“发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒”(SFTSV)。自然感染见于蚊、蜱虫、白蛉等，对人可引起发热，体内血小板减少、出血症状。
新布尼亚病毒主要由蜱虫传播，也可以通过蚊子、白蛉等媒介传播。蜱虫叮咬携带病原体的野生动物、家畜或老鼠后,再叮咬人时,病原体可随之进入人体引起发病。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种新布尼亚病毒抗原抗体检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种新布尼亚病毒抗原抗体检测试剂盒，包括新布尼亚病毒抗原检测试纸卡和/或新布尼亚病毒抗体检测试纸卡和层析稀释液，其中，新布尼亚病毒抗原检测试纸卡包含新布尼亚病毒抗原胶体金层析检测试剂，新布尼亚病毒抗体检测试纸卡包含新布尼亚病毒抗体胶体金层析检测试剂，所述层析稀释液由終浓度1％casein，0.4％Tween-20和10mMPBS缓冲系统组成，其中，
所述新布尼亚病毒抗原检测试纸卡是由下述方法得到的：
病毒亲和纯化抗体的标记：选择胶体金用0.2M K2CO3调节其pH值，加入新布尼亚病毒亲和纯化抗体，室温标记和封闭，离心后用复溶液悬浮；
鸡IgY的标记：选择胶体金用0.2M K2CO3调节其pH值，用鸡IgY室温标记，标记后室温封闭；离心后用复溶液悬浮；
免疫金的制备：将病毒亲和纯化抗体免疫金和鸡IgY免疫金混合铺金，过夜烘干；
包被：
C线：在NC膜上包被抗鸡IgY多抗，加入保护剂做保护；
T线：在NC膜上包被重组抗原亲和纯化抗体,加入保护剂做保护；
所述新布尼亚病毒抗体检测试纸卡是由下述方法得到的：
病毒抗原的标记：选择胶体金用0.2M K2CO3调节pH值，加入新布尼亚病毒抗原，室温标记和封闭，离心后复溶液将沉淀复溶；
鸡I gY的标记：选择胶体金用0.2M K2CO3调节其pH值，用鸡IgY室温标记，标记后室温封闭；离心后用复溶液悬浮；
免疫金的制备：将病毒抗原免疫金和鸡IgY免疫金混合铺金，过夜烘干；
包被：
C线：在NC膜上包被抗鸡IgY多抗，并用抗体保护剂保护；
G线：在NC膜上包被抗人IgG单抗，并加入保护剂进行保护；
M线：在NC膜上包被抗人IgM单抗，并加入保护剂进行保护。
优选的，上述新布尼亚病毒抗原抗体检测试剂盒，其新布尼亚病毒抗原检测试剂盒包含30ul滴管，新布尼亚病毒抗原检测试纸卡，层析稀释液及新布尼亚病毒抗原检测试剂盒说明书；其新布尼亚病毒抗体检测试剂盒包含5ul直吸管，新布尼亚病毒抗体检测试纸卡，层析稀释液及新布尼亚病毒抗体检测试剂盒说明书；或者为抗原抗体二合一检测试剂盒，即包括30ul滴管+5ul直吸管，新布尼亚病毒抗原检测试纸卡+新布尼亚病毒抗体检测试纸卡，层析稀释液(可共用)及新布尼亚病毒抗原抗体检测试剂盒说明书。
上述新布尼亚病毒抗原抗体检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
(1)通过分子克隆、蛋白表达和验证以及蛋白纯化的方式获得NP蛋白；
(2)SFTSV病毒免疫豚鼠，获得的多抗血清经过NP蛋白亲和纯化得到抗SFTSV NP豚鼠多抗；
(3)NP蛋白免疫豚鼠获得NP蛋白多抗血清后与NP蛋白亲和纯化获得亲和纯化抗NP蛋白多抗；
(4)利用步骤(2)中产物进行新布尼亚病毒抗原检测免疫金的制备；利用步骤(3)中产物进行新布尼亚病毒抗原检测包被膜的制备；利用步骤(1)中产物进行新布尼亚病毒抗体检测免疫金的制备。
本发明的有益效果是：
所述新布尼亚病毒抗原抗体检测试剂盒能够检测新布尼亚病毒抗原抗体。其中，新布尼亚病毒抗原检测试剂能够方便、快捷的检测出病例血清中是否含有新布尼亚病毒抗原，可为病情诊断提供依据；新布尼亚病毒抗体检测试剂盒可以为人群免疫监测提供灵敏快捷的工具；IgM抗体检测同抗原检测联合使用具有早期诊断的价值，具有特异性、敏感性等特点，在消除、控制新布尼亚疾病的工作中可起到重要作用。
附图说明
图1为技术路线。
图2为电泳结果。
图3为上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳结果。
图4为经Ni柱亲和纯化后的SDS-PAGE检测蛋白纯度结果。
图5为经离子交换层析后的SDS-PAGE检测蛋白纯度的结果。
图6为纯化病毒图谱。
图7为纯化结果图。
具体实施方式
实施例1
一种新布尼亚病毒抗原抗体检测试剂盒，如图1所示方法获得，具体如下：
材料方法与结果
1.NP蛋白的制备
1.1序列合成：
NCBI上搜索基因序列(GenBank:KC292285.1)，送往金唯智生物科技有限公司合成。
1.2分子克隆：
(1)将合成的含有目的基因序列对应的穿刺菌扩增，获得扩增质粒；
(2)将质粒进行双酶切(BamHⅠ&NdeⅠ)，同时使用相同的限制性内切酶酶切表达质粒pET-28a，37℃酶切1小时；
(3)核酸电泳，将目的片段回收，方法参考天根琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书；
(4)连接：
体系如下：
室温连接25分钟；
(5)转化T1感受态
将连接产物加入T1感受态中，冰浴30min；42℃热激90sec，迅速放入冰上，静置2min；加入1ml LB液体培养基，37℃培养1小时；5000rmp，离心3min，弃900μl上清，重悬菌体，涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上；37℃培养过夜；
(6)挑取单克隆，37℃过夜震荡培养；
(7)提取质粒，具体步骤参考天根质粒小提试剂盒说明书；
(8)双酶切验证：
酶切体系如下：
电泳结果见图2。
1.3表达验证
(1)将酶切正确的质粒转化入表达菌株BL21(DE3)，转化方法同转化T1感受态；
(2)挑取三个单克隆于5ml LB液体培养基，37℃过夜震荡培养；
(3)吸取1mL培养物转接至50ml LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600为0.6左右；
(4)加入终浓度为1mM IPTG，25℃诱导过夜；
(5)收集菌体，9500rmp,5min，4℃；
(6)用10ml Lysis Buffer(T20N200)重悬菌体，超声破碎10min，取破碎液1ml，离心，12000rpm，10min，4℃，取上清，沉淀用等体积的8M尿素重悬，将上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果见图3。
1.4蛋白纯化
(1)按照上述表达条件扩大培养至1L表达体系；
(2)培养4L合并纯化，25℃过夜诱导后，收集菌体，5000rmp，15min，4℃；
(3)30ml/L Lysis Buffer重悬菌体，超声破碎30min，然后高压破碎4轮；
(4)离心分离沉淀：4℃，18000rpm，40min，收集上清，记为Load；
(5)Ni柱亲和纯化，上样前先用Lysis Buffer平衡，上样流速：2ml/min，流穿液记为Flow；
(6)Lysis Buffer冲洗三个柱体积；
(7)含20mM咪唑的Lysis buffer冲洗三个柱体积；
(8)含50mM咪唑的Lysis buffer冲洗三个柱体积；
(9)然后用含500mM咪唑的Lysis buffer洗脱目的蛋白NP；
(10)SDS-PAGE检测蛋白纯度，结果见图4。
(11)取纯度较高，蛋白量较大的第三管蛋白进行阳离子交换层析；
(12)平衡离子柱，平衡buffer(T20N50)；
(13)稀释蛋白至盐浓度为50mM，稀释蛋白记为Load，上样，流速为2ml/min，流穿液记为Flow；
(14)用平衡buffer冲洗3个柱体积，记为Wash；
(15)用A buffer(T20N80)冲洗3个柱体积，样品编号An；
(16)用B Buffer(T20N150)冲洗3个柱体积样品编号Bn；
(17)用C buffer(T20N200)冲洗3个柱体积样品编号Cn；
(18)用D buffer(T20N1000)冲洗3个柱体积样品编号Dn；
(19)SDS-PAGE电泳检测纯度，结果见图5。
1.5结论
得到纯度为100％目的蛋白NP：B3、浓度为2.1mg/ml，体积为12ml；B2、浓度为0.256mg/ml，体积为9ml；B4、浓度为0.35mg/ml，体积为11.5ml。
2.SFTSV纯化病毒的制备
2.1病毒液的获得
河南CDC赠予，1.5L灭活病毒液，滴度1×107IFU/ml。
2.2病毒纯化
(1)过滤：Vero细胞培养的SFTSV病毒液1.5L，4500rpm离心40min，去沉淀，再用过滤器过滤至澄清；
(2)浓缩：用100kd 0.1m2的膜包超滤浓缩病毒液至60ml。用TNE buffer洗膜。得到的60ml弄浓缩液再经4500rpm离心30min，弃沉淀置4℃备用；
(3)蔗糖梯度密度离心：蔗糖梯度60％，30％，15％，35000rpm，离心22h；
(4)离心后收样，用分部收集器收集样品，用紫外检测仪扫描280蛋白图谱。对各管样本进行蔗糖含量及抗原含量测定，绘制曲线；
(5)合并抗原含量高峰管，用Sephacryl-100HR进行脱糖，上样及洗脱流速3.5ml/min；
(6)再纯化：用4FF柱层析进行分离，上样速度10ml/min，柱50cm×1.6cm，280nmA＝1.0，收集第一峰，再用100kd膜包超滤浓缩；
(7)最终得到纯化病毒，如下图6所示。
3.豚鼠抗NP蛋白和SFTSV多抗血清制备
3.1实验动物：豚鼠购自维通利华，雌性，6-8周龄，体重250-300g；完全弗氏佐剂，货号F5881，批号SLBN9312V；不完全弗氏佐剂，货号：F5506，批号：SLBM7415V。
3.2免疫程序：初免----二免(初免两周后)----三免(二免两周后)----终免(三免三周后)----采血，期间，每次免疫前都采血留样检测抗体水平。
3.3免疫剂量和方式：按照0.5ml/只，腹部皮下免疫。
3.4采血及血清效价检测：最终心脏采血，将血液室温放置1-3小时，3000rpm/min离心15min，收集血清，测定NP蛋白和SFTSV多抗血清效价均可达到1:1000000以上。
4.豚鼠抗NP蛋白和SFTSV多抗血清纯化
4.1辛酸-硫酸铵法粗纯：
(1)以0.06M醋酸-醋酸钠溶液4倍稀释血清，调节pH值4.5；
(2)按照每ml血清体积加入40微升滴加辛酸，室温搅拌30分钟；
(3)10000g离心力4度离心30分钟，弃沉淀，上清加入等量体积的0.2M PBS并调节pH 7.4；
(4)加入等量体积的饱和硫酸铵溶液4℃过夜静置；
(5)次日离心3000rpm 30分钟，收集沉淀；
(6)透析于0.01M磷酸盐缓冲液pH 7.4。
4.2亲和层析
4.2.1NP抗原偶联CNBr-activated Sepharose 4B柱材
(1)调整NP蛋白浓度3-5mg/ml；
(2)称取需要重量的柱材干粉，1:100(w/v)溶解于溶胀液中，可使用玻璃棒轻柔搅拌至完全溶解；
(3)使用抽滤系统用溶胀液1:200(w/v)进行充分的洗涤；
(4)待洗涤结尾溶胀液接近抽干时加入偶联液，洗涤并换液为偶联液；
(5)室温放置2h，间歇轻柔混匀(15min一次)，之后4℃静置过夜；
(6)利用抽滤装置抽去多余溶液，并使用少量偶联液流洗，收集这些液体，确定偶联效率使用；
(7)使用封闭液1:20(W/V)重悬柱材，4℃封闭2h，间歇轻柔混匀(15min一次)；
(8)用酸性洗液、碱性洗液1:50-1:100(W/V)交替流洗3次，最终将柱材1:10(W/V)重悬于重悬液中，长期不使用可加入终浓度0.1％的叠氮钠；
(9)联柱材装入层析柱中；
(10)偶联效率的测定：本次试验偶联效率为90％。
4.2.2豚鼠多抗利用偶联柱的亲和纯化
(1)使用5-10倍柱体积的平衡液充分平衡，使检测基线平直；
(2)上样，观察检测峰收集流穿液；
(3)使用平衡液洗涤杂蛋白，同时继续根据检测峰收集流穿液；
(4)利用洗脱液洗脱目的蛋白，根据检测峰收集洗脱峰；
(5)加入约1/10洗脱峰体积的中和液，并配合pH检测最终调节pH至7.4；
(6)待基线平直，改换平衡液中和柱材pH；
(7)改换保存液，将柱子上下口封闭4℃保存；
(8)纯化结果如下图7。
5.新布尼亚病毒抗体胶体金层析检测试剂
5.1标记的优化
(1)0.2M K2CO3加量的优化：
0,2.5,5,7.5,10,12.5,15,17.5,20ul/ml设置梯度试验；
(2)NP抗原加入量：使用12ug/ml进行标记；
(3)标记方式的优化：搭桥标记与直接标记，性能相近，选择直接标记；
(4)悬浮体积的优化：250,500,750,1000ul/ml设置梯度试验悬浮免疫金；
标记条件的初步确认：40nm胶体金，0.2M K2CO3 15ul/ml，Np抗原12ug/ml，标记20min RT；封闭液100ul/ml，封闭15min RT；500ul/ml利用pH8.5的金标悬浮液悬浮；55℃5h/45℃过夜烘干。
5.2包被条件的初步确认：
抗鸡IgY多抗1mg/ml,終浓度0.1％BSA,，20mM PB pH7.4补足体系。
抗人IgG单抗0.5mg/ml,，20mM PB pH7.4补足体系。
抗人IgM单抗1mg/ml,，20mM PB pH7.4补足体系。
5.3加样方式及判读时间
5ul血清+3d层析稀释液，10-15min判读。(d＝滴)
5.4层析稀释液配方确定
终浓度1％casein，0.4％Tween-20，10mM PBS缓冲系统。
6.新布尼亚病毒抗原胶体金层析检测试剂
6.1标记的优化
(1)0.2M K2CO3加量的优化：0,5,10,15,20,25,30ul/ml设置梯度试验.
(2)病毒免疫豚鼠多抗Np亲和纯化抗体加入量：使用12ug/ml进行标记。
(3)标记方式的优化：选择直接标记。
(4)悬浮体积的优化：500,1000,1500,2000，2500，3000ul/ml设置梯度试验悬浮免疫金。
病毒亲和纯化抗体的标记：40nm胶体金，0.2M K2CO3 25ul/ml，新布尼亚病毒抗原12ug/ml，标记20min RT；封闭液100ul/ml，封闭15min RT；2.5ml/ml利用pH8.5的金标悬浮液悬浮；
鸡IgY的标记：40nm胶体金，0.2M K2CO3 12ul/ml，鸡IgY 8ug/ml，标记20min RT；封闭液100ul/ml，封闭15min RT；160ul/ml利用pH8.5的金标悬浮液悬浮；
免疫金的制备：1份病毒亲和纯化抗体免疫金+1份鸡IgY免疫金混合铺金，55℃5h/45℃过夜烘干。
6.2包被条件的确认：
抗鸡IgY多抗1mg/ml,终浓度0.1％BSA,，20mM PB pH7.4补足体系。
NP蛋白亲和纯化抗体0.7mg/ml,，20mM PB pH7.4补足体系。
6.3加样方式及判读时间
30ul血清+2d层析稀释液，10-15min判读。(d＝滴)
6.4层析稀释液配方的确认
终浓度1％casein，0.4％Tween-20，10mM PBS缓冲系统。采用上述自制试剂盒和新布尼亚病毒核酸检测试剂盒(PCR法；北京鑫诺美迪检测技术有限公司)共同检测100份急性期病人血清，抗原检测试剂盒检出率为21％，IgM检出率45％，IgG检出率10％。抗原和IgM抗体联合用于检测早期病毒感染检出率为55％，新布尼亚核酸检测试剂盒(PCR法)PCR检出率为61％。
上述参照具体实施方式对该一种新布尼亚病毒抗原抗体检测试剂盒进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种新布尼亚病毒抗原抗体检测试剂盒，其特征在于：包括新布尼亚病毒抗原检测试纸卡和/或新布尼亚病毒抗体检测试纸卡和层析稀释液，其中，新布尼亚病毒抗原检测试纸卡包含新布尼亚病毒抗原胶体金层析检测试剂，新布尼亚病毒抗体检测试纸卡包含新布尼亚病毒抗体胶体金层析检测试剂，所述层析稀释液由終浓度1％casein，0.4％Tween-20和10mMPBS缓冲系统组成，其中，
所述新布尼亚病毒抗原检测试纸卡是由下述方法得到的：
病毒亲和纯化抗体的标记：选择胶体金用0.2M K2CO3调节其pH值，加入新布尼亚病毒亲和纯化抗体，室温标记和封闭，离心后用复溶液悬浮；
鸡IgY的标记：选择胶体金用0.2M K2CO3调节其pH值，用鸡IgY室温标记，标记后室温封闭；离心后用复溶液悬浮；
免疫金的制备：将病毒亲和纯化抗体免疫金和鸡IgY免疫金混合铺金，过夜烘干；
包被：
C线：在NC膜上包被抗鸡IgY多抗，加入保护剂做保护；
T线：在NC膜上包被重组抗原亲和纯化抗体,加入保护剂做保护；
所述新布尼亚病毒抗体检测试纸卡是由下述方法得到的：
病毒抗原的标记：选择胶体金用0.2M K2CO3调节pH值，加入新布尼亚病毒抗原，室温标记和封闭，离心后复溶液将沉淀复溶；
鸡IgY的标记：选择胶体金用0.2M K2CO3调节其pH值，用鸡IgY室温标记，标记后室温封闭；离心后用复溶液悬浮；
免疫金的制备：将病毒抗原免疫金和鸡IgY免疫金混合铺金，过夜烘干；
包被：
C线：在NC膜上包被抗鸡IgY多抗，并用抗体保护剂保护；
G线：在NC膜上包被抗人IgG单抗，并加入保护剂进行保护；
M线：在NC膜上包被抗人IgM单抗，并加入保护剂进行保护。
2.根据权利要求1所述的新布尼亚病毒抗原抗体检测试剂盒，其特征在于：新布尼亚病毒抗原检测试剂盒包含30ul滴管，新布尼亚病毒抗原检测试纸卡，层析稀释液及新布尼亚病毒抗原检测试剂盒说明书，其新布尼亚病毒抗体检测试剂盒包含5ul直吸管，新布尼亚病毒抗体检测试纸卡，层析稀释液及新布尼亚病毒抗体检测试剂盒说明书；或者为抗原抗体二合一检测试剂盒，即包括30ul滴管+5ul直吸管，新布尼亚病毒抗原检测试纸卡+新布尼亚病毒抗体检测试纸卡，层析稀释液及新布尼亚病毒抗原抗体检测试剂盒说明书。
3.权利要求1所述新布尼亚病毒抗原抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)通过分子克隆、蛋白表达和验证以及蛋白纯化的方式获得NP蛋白；
(2)SFTSV病毒免疫豚鼠，制得的多抗血清经过NP蛋白亲和纯化得到抗SFTSV NP豚鼠多抗；
(3)NP蛋白免疫豚鼠获得NP蛋白多抗血清后与NP蛋白亲和纯化获得亲和纯化抗NP蛋白多抗；
(4)利用步骤(2)中产物进行新布尼亚病毒抗原诊断免疫金的制备；利用步骤(3)中产物进行新布尼亚病毒抗原诊断包被膜的制备；利用步骤(1)中产物进行新布尼亚病毒抗体检测免疫金的制备。
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