CN112904002A - 一种基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于stern‑volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法，包括：步骤一、构建生物传感器：以水相合成法分别制备碲化镉量子点（CdTe QDs）和碳量子点（C QDs），并分别制备C QDs‑SrMV CP和CdTe QDs‑SrMV Ab，将C QDs‑SrMV CP和CdTe QDs‑SrMV Ab两种溶液混合制备生物传感器；步骤二、绘制标准曲线：配制SrMV CP蛋白的标准溶液，将其分别加入生物传感器中后，记录在360 nm激发下的发射光谱，绘制荧光强度变化值与SrMV CP蛋白浓度的线性曲线；步骤三：田间样品检测：向生物传感器中加入（未）感染SrMV病毒的田间样品，监测田间样品加入后生物传感器的荧光强度变化，根据标准曲线确定田间样品是否被SrMV感染，如感染即可求算其含量。本发明具有检测灵敏，特异性强，操作简便等特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物有机化学领域，更具体的说，本发明涉及一种基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法。
背景技术
高粱花叶病毒作为一种长期存在于甘蔗茎叶，通过茎类植物无性繁殖累积，机械损伤和蚜虫叮咬等方式严重影响甘蔗的品质和产量。甘蔗产量受多种因素影响，其中高粱花叶病毒是影响甘蔗产量的最重要因素之一，甘蔗作为一种重要可再生能源，是我国制糖产业的核心农作物。该病毒的累积和远距离传播严重影响我国糖类生产产量，也降低了甘蔗作为一种可再生新能源的发展前途，因此，构建一种快速，简单，高效，经济，灵敏的高粱花叶病毒检测方法，对提高甘蔗免于高粱花叶病毒，提高甘蔗产量具有很重要的意义。
目前对于高粱花叶病毒的检测，最广泛使用的是RT-PCR技术，免疫血清检测，ELISA试剂盒法，这些现有方法存在构建原理复杂，操作复杂以及检测时间长等问题，不利于大规模甄选样品。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法，不但能灵敏的检测出高粱花叶病毒，还能准确检测样本中高粱花叶病毒的浓度，具有检测灵敏度高，抗干扰能力强，适合大规模甄选样品等优点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法，包括以下步骤：
步骤一、构建生物传感器：以水相合成法分别制备碲化镉量子点（CdTe QDs）及碳量子点（C QDs），利用纳米材料表面上的羧基与蛋白末端氨基之间的酯化反应将碳量子点与SrMV病毒的外壳蛋白（CP）偶连制得C QDs-SrMV CP溶液；将碲化镉量子点与SrMV病毒的特异性抗体（Ab）偶联制得CdTe QDs-SrMV Ab溶液，将C QDs-SrMV CP溶液及CdTe QDs-SrMVAb溶液混合，制得生物传感器；
步骤二、绘制标准曲线：在PBS缓冲液中添加CdTe QDs-SrMV Ab，然后将C QDs-SrMV CP添加到溶液中并孵育，以确保形成CdTe QDs-SrMV Ab和C QDs-SrMV CP免疫复合物；在360 nm激发溶液并记录发射光谱；最后，在反应混合物中加入不同体积的SrMV-CP，孵育5min，在360nm处激发溶液并记录基线曲线，绘制荧光强度变化值与SrMV蛋白浓度的线性曲线；
步骤三：田间样品检测：向生物传感器中加入感染了SrMV病毒的田间样品，监测田间样品加入后生物传感器的荧光强度变化，根据标准曲线求算田间样品的SrMV含量。
作为优选的，在上述基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法中，所述碲化镉量子点的制备方法包括如下步骤：
S1、在N2氛围下，将Te粉及NaBH4加入蒸馏水中并与于室温下搅拌至出现白色沉淀，利用NaBH4还原Te粉制备NaHTe；
S2、将NaHTe溶液、CdCl2•2.5 H2O、巯基乙酸加入到氮气饱和双蒸馏水中，调整pH值至10.0；将混合物在回流系统中以92 ℃加热1h获得QD粗溶液；
S3、将QD粗溶液用乙醇洗涤并离心，将所得沉淀物重新溶解于蒸馏水中，得到碲化镉量子点溶液。
作为优选的，在上述基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法中，所述碳量子点的制备方法包括如下步骤：
S1、将柠檬酸钠、尿素、硫脲溶于超纯水中，将混合溶液转移到内衬为聚四氟乙烯的反应釜中，于烘箱中以185 ℃反应6 h；待反应结束冷却至室温，收集黄棕色的碳量子点溶液。
作为优选的，在上述基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法中，步骤二所述绘制荧光强度变化值与SrMV蛋白浓度的线性曲线为：将加入不同体积的SrMV-CP换算成对应浓度，检测每份加入不同浓度SrMV-CP的高粱标准溶液对应的荧光光谱，并记录每份加入不同浓度SrMV-CP的高粱标准溶液对应的荧光强度，以不含高粱花叶病毒的标准溶液对应的荧光强度与任一份其它浓度的高粱花叶病毒标准溶液对应的荧光强度的比值为纵坐标，每份高粱花叶病毒标准溶液的浓度做为横坐标，绘制标准曲线并计算方程。
作为优选的，在上述基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法中，步骤二为：以10 μL的CdTe QDs-SrMV Ab和C QDs-SrMV CP免疫复合物溶液中加入不同浓度的纯化SrMV外壳蛋白溶液，以PBS缓冲液控制溶液总体积为100 μL，通过酶标仪监测不同浓度的纯化SrMV外壳蛋白加入后传感器的荧光强度变化，绘制荧光强度变化值与病毒浓度的线性曲线求得线性方程为y=9912.1x-3657.4，其相关系数R2=0.9903。
作为优选的，在上述基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法中，步骤二中所述加入不同体积SrMV-CP（浓度为0.18 ug/mL）标准溶液分别为：5 uL、7 uL、9uL、11 uL、13 uL。
作为优选的，在上述基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法中，高粱花叶病毒标准溶液的配制方法具体为：首先将携带SrMV-CP蛋白表达载体的大肠杆菌进行培养及诱导表达。然后对诱导培养6 h的携带SrMV-CP蛋白表达载体的大肠杆菌进行裂解后，收集沉淀，用PBS溶液溶解后加入镍柱对其中的SrMV-CP蛋白进行纯化。利用 PBS 溶液溶解的不同浓度梯度的咪唑（80 mM 咪唑； 160 mM 咪唑； 200 mM 咪唑； 220 mM 咪唑；240 mM 咪唑； 260 mM 咪唑； 280 mM 咪唑）洗脱蛋白，经BCA方法对蛋白进行定量检测，最终选择利用 PBS 溶液溶解的240 mM咪唑配制高粱花叶病毒标准溶液。
作为优选的，在上述基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法中，采用DD水溶解碲化镉量子点，为了用CdTe QDs标记SrMV Ab，将一定量的碲化镉量子点溶液、 SrMV Ab 和 EDC（1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐）混合，用 PBS 缓冲溶液将溶液稀释至100 mL。将混合溶液在室温下搅拌2 h，实现碲化镉量子点与高粱花叶病毒联接，然后将溶液避光保存在 4 ℃冰箱内备用。
作为优选的，在上述基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法中，采用DD水溶解碳量子点，为了用C QDs标记SrMV CP，将含有 EDC（6.4 mg·mL-1）和 NHS（4.5mg·mL-1）的新鲜制备的溶液加入到新鲜制备的 C QDs 中，并把混合溶液放置于 37 ℃的深水浴中温浴。然后，将 SrMV CP逐滴添加至溶液中，并添加 Tris 缓冲液（6mg·mL-1，pH=7.2）终止反应。为了分离量子点标记的抗原，将混合物以 12,000 rpm 离心 5 分钟并将上层相用 500 mL Tris 缓冲液稀释，并在 4 ℃下储存直至使用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明结合生物与化学的检测方法，利用量子点结合抗原抗体来检测高粱花叶病毒，从构建体系上来说，构建原理更加简单，操作更简洁，具有较高的特异性，价格低廉，操作简单，检测时间短，更适合于大规模甄选样品，具有更好的应用前景。
2.本发明可延伸为试剂盒检测法，试纸性检测法，应用范围广且方便。
3.随着高粱花叶病毒浓度的增加，荧光强度增加，高粱花叶病毒浓度和相对荧光强度呈现良好的线性关系。
4.本发明检测灵敏度高，检测迅速，广泛适用于幼苗筛选和样品甄选。
附图说明
图1为高粱花叶病毒的检测原理。其中：SrMV-CP浓度为0.18ug/mL。
图2为高粱花叶病毒的标准曲线。
具体实施方式
通过以下具体事例对本发明做进一步描述，本发明包含但并不仅仅局限于以下应用：
实施例1：基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法：
A：制备碲化镉量子点和碳量子点固体：1.碲化镉量子点的制备：在N2氛围下，将0.1 g Te粉及0.3 g NaBH4加入7 mL蒸馏水中并与于室温下搅拌至出现白色沉淀，利用NaBH4还原Te粉制备NaHTe。将新鲜制备的NaHTe溶液、0.358 g CdCl2•2.5 H2O、0.2 mL巯基乙酸加入到200 mL氮气饱和双蒸馏水中，调整pH值至10.0。将混合物在回流系统中以92 ℃加热1h获得QD粗溶液。将粗溶液用乙醇洗涤3次，并以4000×g离心15 min。将所得沉淀物重新溶解于250 mL蒸馏水中，并避光保存在4 ℃冰箱中。2.碳量子点的制备：将0.28 mmol柠檬酸钠、1.26 mmol尿素、0.42 mmol硫脲溶于30 mL超纯水中，将混合溶液转移到体积为50mL内衬为聚四氟乙烯的反应釜中，于烘箱中以185 ℃反应6 h。待反应结束冷却至室温，收集黄棕色的碳量子点溶液。
B：样品处理：取1.0 g感染高粱花叶病毒的甘蔗叶片，加入适量二氧化硅，5 mLPBS缓冲液，于研钵中充分研磨，取上清液稀释备用。
C：提取高粱花叶病毒蛋白：首先将携带SrMV-CP蛋白表达载体的大肠杆菌进行培养及诱导表达。然后对诱导培养6 h的携带SrMV-CP蛋白表达载体的大肠杆菌进行裂解后，收集沉淀，经尿素溶解后加入镍柱对其中的SrMV-CP蛋白进行纯化。利用 PBS 溶液溶解的240 mM咪唑洗脱蛋白配制成高粱花叶病毒标准溶液。
D：用CdTe QDs标记SrMV Ab，具体步骤为：采用DD水溶解碲化镉量子点，为了用CdTe QDs标记SrMV Ab，将一定量的碲化镉量子点溶液、 SrMV Ab 和 EDC（1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐）混合，用 PBS 缓冲溶液将溶液稀释至100 mL。将混合溶液在室温下搅拌2 h，实现碲化镉量子点与高粱花叶病毒联接。
E：用C QDs标记SrMV CP，具体步骤为：采用DD水溶解碳量子点，为了用C QDs标记SrMV CP，将含有 EDC（6.4 mg·mL-1）和 NHS（4.5 mg·mL-1）的新鲜制备的溶液加入到新鲜制备的 C QDs 中，并把混合溶液放置于 37 ℃的深水浴中温浴。然后，将 SrMV CP逐滴添加至溶液中，并添加 Tris 缓冲液（6mg·mL-1，pH=7.2）终止反应。为了分离量子点标记的抗原，将混合物以 12,000 rpm 离心 5 分钟并将上层相用 500 mL Tris 缓冲液稀释。
F：将混合均匀C QDs-SrMV CP加入到Tris缓冲液（6 mg·mL-1，pH=7.2）中。然后将CdTe QDs-SrMV Ab加入溶液中并温浴3 min以确保形成C QDs-SrMV CP和CdTe QDs-SrMVAb的免疫复合物。然后在360 nm激发该溶液并记录发射光谱（400-700 nm）。
G：根据样品荧光强度带入荧光强度变化值与病毒浓度的线性曲线中得出高粱花叶病毒浓度。
实施例2：基于stern-volmer原理检测高粱花叶病毒的生物传感器在甘蔗育苗筛选过程中的应用
A：制备碲化镉量子点和碳量子点固体：1.碲化镉量子点的制备：在N2氛围下，将0.1 g Te粉及0.3 g NaBH4加入7 mL蒸馏水中并与于室温下搅拌至出现白色沉淀，利用NaBH4还原Te粉制备NaHTe。将新鲜制备的NaHTe溶液、0.358 g CdCl2•2.5 H2O、0.2 mL巯基乙酸加入到200 mL氮气饱和双蒸馏水中，调整pH值至10.0。将混合物在回流系统中以92 ℃加热1h获得QD粗溶液。将粗溶液用乙醇洗涤3次，并以4000×g离心15 min。将所得沉淀物重新溶解于250 mL蒸馏水中，并避光保存在4°C冰箱中。2.碳量子点的制备：将0.28 mmol柠檬酸钠、1.26 mmol尿素、0.42 mmol硫脲溶于30 mL超纯水中，将混合溶液转移到体积为50 mL内衬为聚四氟乙烯的反应釜中，于烘箱中以185 ℃反应6 h。待反应结束冷却至室温，收集黄棕色的碳量子点溶液。
B：样品处理：取1.0 g待选育的甘蔗幼苗叶片，加入适量二氧化硅，5 mL PBS缓冲液，于研钵中充分研磨，取上清液稀释备用。
C：提取高粱花叶病毒蛋白：首先将携带SrMV-CP蛋白表达载体的大肠杆菌进行培养及诱导表达。然后对诱导培养6 h的携带SrMV-CP蛋白表达载体的大肠杆菌进行裂解后，收集沉淀，经尿素溶解后加入镍柱对其中的SrMV-CP蛋白进行纯化。利用 PBS 溶液溶解的240 mM咪唑洗脱蛋白配制成高粱花叶病毒标准溶液。
D：用CdTe QDs标记SrMV Ab，具体步骤为：采用DD水溶解碲化镉量子点，为了用CdTe QDs标记SrMV Ab，将一定量的碲化镉量子点溶液、 SrMV Ab 和 EDC（1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐）混合，用 PBS 缓冲溶液将溶液稀释至100 mL。将混合溶液在室温下搅拌2 h，实现碲化镉量子点与高粱花叶病毒联接。
E：用C QDs标记SrMV CP，具体步骤为：采用DD水溶解碳量子点，为了用C QDs标记SrMV CP，将含有 EDC（6.4 mg·mL-1）和 NHS（4.5 mg·mL-1）的新鲜制备的溶液加入到新鲜制备的 C QDs 中，并把混合溶液放置于 37 ℃的深水浴中温浴。然后，将 SrMV CP逐滴添加至溶液中，并添加 Tris 缓冲液（6 mg·mL-1，pH=7.2）终止反应。为了分离量子点标记的抗原，将混合物以 12,000 rpm 离心 5 分钟并将上层相用 500 mL Tris 缓冲液稀释。
F：将混合均匀C QDs-SrMV CP加入到Tris缓冲液（6 mg·mL-1，pH=7.2）中。然后将CdTe QDs-SrMV Ab加入溶液中并温浴3 min以确保形成C QDs-SrMV CP和CdTe QDs-SrMVAb的免疫复合物。然后在360 nm激发该溶液并记录发射光谱（400-700 nm）。
G：根据样品荧光强度带入荧光强度变化值与病毒浓度的线性曲线中得出甘蔗幼苗中高粱花叶病毒浓度。
H：根据线性曲线的出甘蔗幼苗在否携带高粱花叶病毒，选择健康的甘蔗幼苗进行移植。
Claims (9)
1.一种基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、构建生物传感器：以水相合成法分别制备碲化镉量子点和碳量子点，利用纳米材料表面上的羧基与蛋白末端氨基之间的酯化反应将碳量子点与SrMV病毒的外壳蛋白偶连制得C QDs-SrMV CP溶液；将碲化镉量子点与SrMV病毒的特异性抗体偶连制得CdTe QDs-SrMV Ab溶液，将C QDs-SrMV CP溶液及CdTe QDs-SrMV Ab溶液混合，制得生物传感器；
步骤二、绘制标准曲线：在PBS缓冲液中添加CdTe QDs-SrMV Ab，然后将C QDs-SrMV CP添加到溶液中并孵育，以确保形成CdTe QDs-SrMV Ab和C QDs-SrMV CP免疫复合物；在360nm激发溶液并记录发射光谱；最后，在反应混合物中加入不同体积的SrMV-CP，孵育5min，在360nm处激发溶液并记录基线曲线，绘制荧光强度变化值与SrMV-CP蛋白浓度的线性曲线；
步骤三：田间样品检测：向生物传感器中加入感染了SrMV病毒的田间样品，监测田间样品加入后生物传感器的荧光强度变化，根据标准曲线求算田间样品的SrMV含量。
2.如权利要求1所述的基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法，其特征在于所述碲化镉量子点的制备方法包括如下步骤：
S1、在N2氛围下，将Te粉及NaBH4加入蒸馏水中并于室温下搅拌至出现白色沉淀，利用NaBH4还原Te粉制备NaHTe；
S2、将NaHTe溶液、CdCl2•2.5 H2O和巯基乙酸加入到氮气饱和的双蒸馏水中，调整pH值至10.0；将混合物在回流系统中92 ℃加热1h获得QD粗溶液；
S3、将QD粗溶液用乙醇洗涤并离心，将所得沉淀物重新溶解于蒸馏水中，得到碲化镉量子点。
3.如权利要求1所述的基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法，其特征在于所述碳量子点的制备方法包括如下步骤：
S1、将柠檬酸钠、尿素和硫脲溶于超纯水中，将混合溶液转移到内衬为聚四氟乙烯的反应釜中，于烘箱中以185 ℃反应6 h；待反应结束冷却至室温，得到黄棕色的碳量子点溶液。
4.如权利要求1所述的基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法，其特征在于步骤二所述绘制荧光强度变化值与SrMV蛋白浓度的线性曲线为：检测每份加入不同体积SrMV-CP的高粱标准溶液对应的荧光光谱，将不同体积SrMV-CP的高粱标准溶液换算成相应浓度，并记录每份加入不同浓度SrMV-CP的高粱标准溶液对应的荧光强度。以不含高粱花叶病毒的标准溶液对应的荧光强度与任一份其它浓度的高粱花叶病毒标准溶液对应的荧光强度的比值为纵坐标，对应高粱花叶病毒标准溶液的浓度做为横坐标，绘制标准曲线并计算方程。
5.如权利要求1所述的基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法，其特征在于步骤二为：以10 μL的CdTe QDs-SrMV Ab和C QDs-SrMV CP免疫复合物中加入不同浓度的纯化SrMV外壳蛋白溶液，以PBS缓冲液控制溶液总体积为100 μL，通过监测不同浓度的纯化SrMV外壳蛋白加入后的传感器的荧光强度变化，绘制荧光强度变化值与病毒浓度的线性曲线求得线性方程为y=9912.1x-3657.4，其相关系数R2=0.9903。
6.如权利要求1所述的基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法，其特征在于，步骤二中所述加入不同体积SrMV-CP（浓度为0.18 ug/mL）标准溶液分别为：5 uL、7uL、9 uL、11 uL、13 uL。
7.如权利要求4所述基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法，其特征在于，高粱花叶病毒标准溶液的配制方法具体为：首先将携带SrMV-CP蛋白表达载体的大肠杆菌进行培养及诱导表达。然后对诱导培养6 h的携带SrMV-CP蛋白表达载体的大肠杆菌进行裂解后，收集沉淀，经尿素溶解后加入镍柱对其中的SrMV-CP蛋白进行纯化。利用 PBS 溶液溶解的不同浓度梯度的咪唑（80 mM 咪唑； 160 mM 咪唑； 200 mM 咪唑； 220 mM 咪唑；240 mM 咪唑； 260 mM 咪唑； 280 mM 咪唑）洗脱蛋白，经BCA方法对蛋白进行定量检测，最终选择利用 PBS 溶液溶解的240 mM咪唑配制高粱花叶病毒标准溶液。
8.如权利要求1所述基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法，其特征在于，为了用CdTe QDs标记SrMV Ab，采用DD水溶解碲化镉量子点，将一定量的碲化镉量子点溶液、 SrMV Ab 和 EDC（1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐）混合，用 PBS缓冲溶液将溶液稀释至100 mL。将混合溶液在室温下搅拌2 h，实现碲化镉量子点与高粱花叶病毒联接，然后将溶液避光保存在 4 ℃ 冰箱内备用。
9.如权利要求1所述基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法，其特征在于，为了用C QDs标记SrMV CP，采用DD水溶解碳量子点，将含有 EDC（6.4 mg·mL-1）和NHS（4.5 mg·mL-1）的新鲜制备的溶液加入到新鲜制备的 C QDs 中，并把混合溶液放置于37 ℃ 的深水浴中温浴。然后，将 SrMV CP逐滴添加至溶液中，并添加 Tris 缓冲液（6mg·mL-1，pH=7.2）终止反应。为了分离量子点标记的抗原，将混合物以 12,000 rpm 离心 5 分钟并将上层相用 500 mL Tris 缓冲液稀释，并在 4 ℃ 下储存直至使用。
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