CN107290532A - 高粱花叶病毒间接elisa检测方法及其试剂盒与应用 - Google Patents

高粱花叶病毒间接elisa检测方法及其试剂盒与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甘蔗中的高粱花叶病毒间接ELISA检测试剂盒，主要包括特异性识别高粱花叶病毒的兔抗多克隆抗体和辣根过氧化酶标记的羊抗兔lgG标准液。其中，多克隆抗体以甘蔗高粱花叶病毒的P3蛋白N端保守区多肽为抗原制备。据此，发明人还建立了相应的间接ELISA检测方法，并将之用于甘蔗中的高粱花叶病毒检测。与现有技术相比，本发明具有灵敏度高、特异性强、成本低、高通量、检测快速的优点，既适用于田间对少量样品的快速检测，也适用于实验室内的大量样品的高通量快速检测。

Description

高粱花叶病毒间接ELISA检测方法及其试剂盒与应用
技术领域
本发明属于高粱花叶病毒检测领域，尤其涉及一种高粱花叶病毒间接ELISA检测方法及其试剂盒与应用。
背景技术
甘蔗是世界上最重要的糖料作物，也是最具潜力的可再生能源作物。甘蔗生长过程中会受到病毒的危害，且经过长期无性繁殖，多种病毒会积累在不同甘蔗品种及种质材料中，导致其种性退化，产量和品质下降，给甘蔗产业带来严重损失。
甘蔗花叶病是甘蔗主要病害之一，其主要病原是马铃薯Y病毒属甘蔗花叶病毒亚组的甘蔗高粱花叶病毒(SrMV)，该病毒可经蚜虫叮咬和机械损伤进行近距离传播，其自然寄主为禾本科的高粱和甘蔗等。甘蔗主要通过种茎进行无性繁殖，会造成该病毒的积累和远距离传播。被感染植株的叶面会出现黄绿相间不规则的嵌纹、条斑或斑驳，叶色褪绿等症状，病状在幼嫩叶片的基部较明显，影响光合作用的效率，会造成甘蔗产量和含糖量下降。因此，建立一种操作简单、特异灵敏、成本低廉的SrMV高效检测方法，对田间病毒调查，防止该病毒传播，以及建立无毒甘蔗种苗体系等具有重要意义。
目前检测病毒常用的方法可分为分子检测技术和血清学检测技术两类。分子检测技术是一种基于核酸水平的检测，具有准确高效、灵敏快速的特点，但操作比较复杂，成本很高。常见的SrMV检测方法为PCR检测技术，首先需要对甘蔗提取总RNA，反转录为cDNA，再进行PCR扩增，最后进行电泳分析，甚至还要进行基因组序列测定。PCR技术操作过程繁琐、耗时长，并且该技术完全依赖于PCR仪器和商业化的试剂，所以实验成本较高，不利于田间病毒病的大规模检测。此外，PCR技术假阳性较高，整个过程需要专业人员操作，难以普及推广。
酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种免疫学检测方法，具有灵敏度高、操作方便且经济实用的特点，其极大地克服了RT-PCR存在的缺点，不需要提取核酸，也不容易交叉污染，适合于田间或出入境口岸大规模样品检测，因而越来越受到人们的青睐和重视。目前ELISA技术在甘蔗病毒检测方面还不成熟，还难以应用于田间病害调查以及健康甘蔗种苗选育。目前，国内还没有商业化检测甘蔗病毒的ELISA试剂盒，这既是一研究热点，也是一研发目标，其技术的关键在于制备高质量的检测抗体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强、成本低、高通量、检测快速的高粱花叶病毒间接ELISA检测方法及其试剂盒与应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：高粱花叶病毒间接ELISA检测试剂盒，主要包括特异性识别高粱花叶病毒的兔抗多克隆抗体和辣根过氧化酶标记的羊抗兔lgG标准液。
多克隆抗体以甘蔗高粱花叶病毒的P3蛋白N端保守区多肽为抗原制备。
制备按以下操作进行：从NCBI网站获得SrMV的P3基因序列，预测P3蛋白的氨基酸序列，选取N端暴露于天然蛋白外表的多肽为抗原，合成该多肽，将此多肽与弗氏佐剂混合免疫兔子，采集兔子血液，经亲和层析纯化获得多克隆抗体。
多肽具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。
高粱花叶病毒间接ELISA检测方法，以兔抗的甘蔗高粱花叶病毒P3蛋白N端保守区制备的多克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗兔lgG标准液作为二抗对甘蔗中的高粱花叶病毒进行ELISA检测。
上述高粱花叶病毒间接ELISA检测方法，按以下步骤进行操作：
A.样品处理：称取待检甘蔗样品，将其制成匀浆，离心或静置沉淀，取上清液用包被缓冲液稀释2-8倍备用；
B.样品包被：取100μL经适当稀释的检测样品液加入96孔酶标板中，以SrMV抗原标准液为阳性对照，以健康甘蔗样品液为阴性对照，在37℃条件下包被1-2h；
C.洗涤：去除酶标板中的包被液，每孔加入100μL PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
D.封闭：去除酶标板中的PBST缓冲液，每孔加入100μL封闭液，37℃孵育1h，去除封闭液后用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
E.抗体孵育：每孔加入100μL1∶1000稀释的兔抗SrMV P3N蛋白抗血清标准液，37℃孵育1h，漂洗3次；再每孔加入100μL 1∶8000稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG标准液，37℃孵育1h，去除二抗，用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
F.底物显色及终止反应：每孔加入100μL可溶性型TMB底物显色液，37℃避光显色10min，溶液显蓝色，每孔加入50μL 2M的H2SO4终止反应，溶液变为黄色；
G.结果判定：用酶标仪测定OD450，计算P/N值(P为待测样品的OD450；N为阴性对照的OD450)；如果P/N＞2.1则待测样为阳性；反之则为阴性。
高粱花叶病毒间接ELISA检测试剂盒用于甘蔗中高粱花叶病毒的ELISA检测。
高粱花叶病毒间接ELISA检测方法用于甘蔗中高粱花叶病毒的ELISA检测。
针对现有甘蔗中高粱花叶病毒检测缺乏有效检测措施的问题，发明人设计并制备了甘蔗中高粱花叶病毒间接ELISA检测试剂盒，主要包括特异性识别高粱花叶病毒的兔抗多克隆抗体和辣根过氧化酶标记的羊抗兔lgG标准液。其中，多克隆抗体以甘蔗高粱花叶病毒的P3蛋白N端保守区多肽为抗原制备。据此，发明人还建立了相应的间接ELISA检测方法，并将之用于甘蔗中高粱花叶病毒检测。与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
(1)本发明既适用于田间对少量样品的快速检测，若与样品处理系统连用可实现该病毒的快速、高通量检测，因此也适用于实验室内的大量样品的高通量快速检测。将其用于田间甘蔗发病率调查，与PCR检测结果比较验证该方法的检测重复性和准确率表明，本发明与PCR检测结果的符合率为87％以上，适用于病毒调查和健康种苗筛选等。
(2)本发明所用抗体特异性好，能特异性的识别高粱花叶病毒，对甘蔗花叶病毒、甘蔗黄叶病毒和甘蔗杆状病毒等其他病毒均不能识别，实验条件优化中以病毒积累量低的嫩叶作为实验材料，从而提高了该试剂盒的灵敏度。
(3)本发明提供的各种试剂的浓度和参数配比均是经上百次实验精细调试优化所得。各项指标的综合运用实现了样品需要量少、检测灵敏度高，特异性强、成本低、适合大批量样品检测的特点，并且具有操作简单，实用性强等优势。一个人只需要8-10小时就能完成几百份甘蔗样品的检测，并且样品越多优越性越明显，利于田间和甘蔗种公司的大规模推广应用，可对田间甘蔗高粱花叶病毒携带情况进行调查研究，也可对甘蔗种苗带毒情况进行统计分析，解决了大量样品检测耗时耗力，成本高昂的缺点。
附图说明
图1是验证本发明中一抗特异性的Western blotting图，图中：M是蛋白Marker，1是带高粱花叶病毒的甘蔗的总蛋白，2是健康甘蔗的总蛋白。
图2是本发明实施例中所述的样品处理系统图。
图3是本发明实施例中SrMV的ELISA检测结果图。
具体实施方式
实施例一 高粱花叶病毒ELISA检测方法在田间检测中的运用
A.样品处理：取约0.5g待测甘蔗样品放入研钵中，加入适量的石英砂，再加入1-5ml PBS缓冲液；研磨至样品呈匀浆状，静置沉淀15min，取上清液用包被缓冲液稀释2-8倍备用。
B.样品包被：取100μL经适当稀释的检测样品液加入96孔酶标板中，以SrMV抗原标准液为阳性对照，以健康甘蔗样品液为阴性对照，在37℃条件下包被1-2h；
C.洗涤：去除酶标板中的包被液，每孔加入100μL PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
D.封闭：去除酶标板中的PBST缓冲液，每孔加入100μL封闭液(含有5％脱脂奶粉的PBST溶液)，37℃孵育1h，去除封闭液后用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
E.抗体孵育：每孔加入100μL1∶1000稀释的兔抗SrMV P3N蛋白抗血清标准液，37℃孵育1h，漂洗3次；再每孔加入100μL1∶8000稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG标准液，37℃孵育1h，去除二抗，用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
F.底物显色及终止反应：每孔加入100μL可溶性型TMB底物显色液，37℃避光显色10min，溶液显蓝色，每孔加入50μL 2M的H2S04终止反应，溶液变为黄色。
G.结果判定：用酶标仪测定OD450，计算P/N值(P为待测样品的OD450；N为阴性对照的OD450)；如果P/N＞2.1则待测样为阳性；反之则为阴性。
结果：在田间检测只能采用手工磨样，难以进行大批量样品检测。因未经离心处理，研磨液中色素含量较高，导致OD450值偏高，假阳性率较高。与RT-PCR检测符合率为84％，检测可信度较高，可以大批量推广使用。
实施例二 高粱花叶病毒ELISA检测方法在大量样品检测中的运用
A.样品处理：称取约0.2g待检甘蔗样品装到2mL的EP管中，加入2颗小钢珠并加入0.5-1.5mL裂解液。经样品处理系统(美国MP Biomedicals公司FastPrep-24)处理1-3min即可将样品打呈匀浆状，8000-12000r/min离心5min，取上清液用包被缓冲液稀释2-8倍备用。
B.样品包被：取100μL经适当稀释的检测样品液加入96孔酶标板中，以SrMV抗原标准液为阳性对照，以健康甘蔗样品液为阴性对照，在37℃条件下包被1-2h；
C.洗涤：去除酶标板中的包被液，每孔加入100μL PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
D.封闭：去除酶标板中的PBST缓冲液，每孔加入100μL封闭液(含有5％脱脂奶粉的PBST溶液)，37℃孵育1h，去除封闭液后用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
E.抗体孵育：每孔加入100μL1∶1000稀释的兔抗SrMV P3N蛋白抗血清标准液，37℃孵育1h，漂洗3次；再每孔加入100μL1∶8000稀释的辣根氧化物酶标记的羊抗兔IgG标准液，37℃孵育1h，去除二抗，用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
F.底物显色及终止反应：每孔加入100μL可溶性型TMB底物显色液，37℃避光显色10min，溶液显蓝色，每孔加入50μL 2M的H2SO4终止反应，溶液变为黄色。
G.结果判定：用酶标仪测定OD450，计算P/N值(P为待测样品的OD450；N为阴性对照的OD450)；如果P/N＞2.1则待测样为阳性；反之则为阴性。
结果：在实验室内可采用样品处理系统磨样，适于大批量样品检测。研磨液经离心色素含量较低，对检测结果干扰小。与RT-PCR检测符合率为87％，检测可信度很高，可以大批量推广使用。
表1实施例二检测结果与RT-PCR检测结果的符合情况
实施例三 高粱花叶病毒ELISA检测试剂盒的组装应用
为方便使用，参照前述发明内容及实施例组装检测试剂盒(100次)如下：
<1>试剂盒组分
以上试剂均-20℃保存
以上试剂均4℃保存
2ml EP管 100个
直径为0.2-0.7cm的小钢珠 50颗
以上材料均室温保存。
其中，SrMV-P3N多克隆抗体制备如下：从NCBI网站获得SrMV的P3基因序列，预测P3蛋白的氨基酸序列，选取N端暴露于天然蛋白外表的多肽为抗原，合成该多肽MFKPEGMKKIIEEEC(SEQ.ID.No.1)，将此多肽与弗氏佐剂混合免疫兔子，采集兔子血液，经亲和层析纯化获得多克隆抗体。
<2>试剂盒使用注意事项
①处理样品时样品量不宜过多，否者样品处理不充分，病毒难以释放到缓冲液中。
②离心时速度为8000-12000r/min，时间为3-8min，最大程度的去除上清液中的色素，防止色素干扰。
③抗体在使用前15min内稀释；
④最佳反应温度为37℃；抗体需-20℃保存。
应用本例制备的病毒检测试剂盒，参照实施例二并采用相应发病症状的甘蔗样品，其检测结果与实施例二相同，且检测快速、结果可靠，表明该病毒检测试剂盒可以大批量推广使用。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西大学
<120> 高粱花叶病毒间接ELISA检测方法及其试剂盒与应用
<130> 高粱花叶病毒间接ELISA检测方法及其试剂盒与应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Phe Lys Pro Glu Gly Met Lys Lys Ile Ile Glu Glu Glu Cys
1 5 10 15

Claims (8)

1.一种高粱花叶病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于主要包括特异性识别高粱花叶病毒的兔抗多克隆抗体和辣根过氧化酶标记的羊抗兔lgG标准液。
2.根据权利要求1所述的高粱花叶病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述多克隆抗体以甘蔗高粱花叶病毒的P3蛋白N端保守区多肽为抗原制备。
3.根据权利要求1所述的高粱花叶病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述制备按以下操作进行：从NCBI网站获得SrMV的P3基因序列，预测P3蛋白的氨基酸序列，选取N端暴露于天然蛋白外表的多肽为抗原，合成该多肽，将此多肽与弗氏佐剂混合免疫兔子，采集兔子血液，经亲和层析纯化获得多克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的高粱花叶病毒间接ELISA检测方法及其试剂盒与应用，其特征在于：所述多肽具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。
5.一种高粱花叶病毒间接ELISA检测方法，其特征在于以兔抗的甘蔗高粱花叶病毒P3蛋白N端保守区制备的多克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗兔lgG标准液作为二抗对甘蔗中的高粱花叶病毒进行ELISA检测。
6.根据权利要求5所述的高粱花叶病毒间接ELISA检测方法，其特征在于按以下步骤进行操作：
A.样品处理：称取待检甘蔗样品，将其制成匀浆，离心或静置沉淀，取上清液用包被缓冲液稀释2-8倍备用；
B.样品包被：取100μL经适当稀释的检测样品液加入96孔酶标板中，以SrMV抗原标准液为阳性对照，以健康甘蔗样品液为阴性对照，在37℃条件下包被1-2h；
C.洗涤：去除酶标板中的包被液，每孔加入100μL PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
D.封闭：去除酶标板中的PBST缓冲液，每孔加入100μL封闭液，37℃孵育1h，去除封闭液后用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
E.抗体孵育：每孔加入100μL1∶1000稀释的兔抗SrMV P3N蛋白抗血清标准液，37℃孵育1h，漂洗3次；再每孔加入100μL1∶8000稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG标准液，37℃孵育1h，去除二抗，用PBST缓冲液漂洗3次，每次5min；
F.底物显色及终止反应：每孔加入100μL可溶性型TMB底物显色液，37℃避光显色10min，溶液显蓝色，每孔加入50μL 2M的H2SO4终止反应，溶液变为黄色；
G.结果判定：用酶标仪测定OD450，计算P/N值；如果P/N＞2.1则待测样为阳性；反之则为阴性。
7.权利要求1所述高粱花叶病毒间接ELISA检测试剂盒用于甘蔗中高粱花叶病毒的ELISA检测。
8.权利要求5所述高粱花叶病毒间接ELISA检测方法用于甘蔗中高粱花叶病毒的ELISA检测。
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