CN114540515B - 一种基于rpa的光电化学传感器的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种基于RPA的光电化学传感器的制备方法及其应用，基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术，构建了一种超灵敏检测大肠杆菌O157：H7的光电化学传感器。该光电化学传感器的制备方法为先通过简单的水热法合成小尺寸、低禁带宽度、高近红外PEC活性的半导体材料Bi2S3，将氨基功能化的Bi2S3与羧基功能化的大肠杆菌O157：H7反向引物偶联，作为光电信号物，正向引物固定在电极表面，大肠杆菌O157：H7的DNA作为目标检测物，执行RPA等温扩增反应，从而构建一个信号放大型光电化学传感器检测大肠杆菌O157：H7。该方法具有操作简单快速、灵敏度高、检出限低、稳定性好的特点。

Description

一种基于RPA的光电化学传感器的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于食源性致病菌检测领域，具体涉及一种基于重组酶聚合酶扩增(RPA)的光电化学传感器的制备方法及其应用。
背景技术
食源性疾病已成为食品安全的头号问题。据世界卫生组织估计，全世界每年约发生6亿例食源性疾病，其中婴幼儿作为易感群体，有2.2亿儿童发生感染性腹泻，9.6万死亡病例。食源性致病菌作为引发食源性疾病的重要因素，受到了广泛的关注。然而，在食品的生产加工过程中，任何环节都有可能引入致病菌，从而导致大规模的传染病的爆发，对人们身体健康造成极大的危害。常见七种致病菌被认为是造成食品污染的主要食源性致病菌，而这其中肠出血性大肠埃希氏菌(O157:H7)作为典型的食源性致病菌，能引发胃肠道疾病，甚至引发严重的局部化脓感染。因此，对食品中致病菌的快速灵敏检测，为食品安全保驾护航十分有必要。截至目前，食源性致病菌的检测方法有很多，如传统检测法(显微镜检查、培养和血清学检查)、免疫学检测法(如酶联免疫吸附试验)和分子生物学检测法(如聚合酶链式反应)等，虽然能实现致病菌检出的目的，但在灵敏度和检测效率方面仍存在一些不足，因而阻碍其在食品检测中的应用。除以上的检测方法外，利用生物传感器构建的检测方法被广泛关注，该方法采用小型分析设备，以目标物与生物识别原件发生特定的生物化学反应为基础，将产生的化学信号通过转化为光、电等信号，最后在识别原件中被输出，从而实现对目标物的快速检测。生物传感器的构建结合了生物、化学等学科优势，以达到对目标物的直接检测。在生物传感器的研究领域，采用光电化学方法构建的生物传感器成为新的研究的热点。光电化学(PEC)是在光化学和电化学的基础上发展起来，是研究光与电极或界面材料之间的关系以及伴随的光能与电能之间转化的新型交叉学科。PEC具有输入(光)信号和输出(电)信号互相分离，互不干扰的特性，而生物传感器具有的高特异性的优点，将两者优势的结合，构建了光电化学生物传感器。该传感器背景信号低、灵敏度高，可实现对大肠杆菌O157：H7或其他食源性致病菌的快速、灵敏性检测。
近年来，随着分子生物技术的快速发展，基于核酸的诊断方法被广泛应用于致病菌的检测。聚合酶链式反应(PCR)是一种常见的核酸检测方法，对所有生物样本检测具有普适性，通过PCR方法对特定DNA进行扩增以达到检测目的。然而，PCR扩增过程中，扩增循环步骤需要变温条件，不仅对检测的环境体系要求高，对设备和人员也提出了更高的要求，其检测方法具有局限性，难以应用于便携式检测装置的开发。与PCR相比，等温扩增具有快速、高效、特异性强和无特殊设备要求等特点，对构建便携式装置具有重要意义。在多种等温扩增的方法中，重组酶聚合酶扩增(RPA)技术，因其扩增速率高，对实验条件要求低，特异性好，成本低，被认为是一种能媲美PCR的等温扩增方式。RPA依赖于三种酶，重组酶，单链结合蛋白(single strand binding protein,SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶在室温下也具有活性(最佳反应温度在37℃左右)，因此适用于现场检测。结合RPA方法构建便携式生物化学传感器具有里程碑式的价值。
发明内容
本申请的目的在于提供一种基于RPA的光电化学传感器的制备方法及其应用，以解决现有核酸检测方法在光电化学传感器的构建中应用较少，致病菌检测的灵敏度较低，难以应用于现场及时、快速检测的问题。
本发明提出了一种基于RPA的光电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1：将氨基功能化Bi2S3(NH2-Bi2S3)溶于无酶水，得到悬浮液A；将羧基功能化大肠杆菌O157：H7反向引物(COOH-AR)溶于磷酸盐缓冲溶液，得到溶液B；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于磷酸盐缓冲溶液中，得到溶液C；
步骤S2：将悬浮液A、溶液B和溶液C混合反应得到悬浮液D；
步骤S3：悬浮液D用磷酸盐缓冲液洗涤离心后去除未连接引物，然后分散于含牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲溶液中，得到目标产物Bi2S3-AR；
步骤S4：在纸基丝网印刷电极(SPPE)表面生长金纳米粒子(AuNPs)，得到目标工作电极AuNPs/SPPE；
步骤S5：将巯基功能化大肠杆菌O157：H7正向引物(SH-AF)溶于磷酸盐缓冲溶液，得到溶液E，将溶液E滴在所述工作电极AuNPs/SPPE表面进行孵育，孵育结束后，用巯基乙醇(MCH)溶液冲洗，得到目标产物AF/AuNPs/SPPE；
步骤S6：用细菌DNA提取试剂盒对大肠杆菌O157：H7的基因组DNA(gDNA)进行提取，得到大肠杆菌O157：H7 gDNA，产物作为模板参与后续RPA扩增；
步骤S7：将Bi2S3-AR、大肠杆菌O157：H7 gDNA、无核酸酶水、Rehy-dration Buffer和大肠杆菌O157：H7溶液正向引物(AF)加入冻干粉试剂管内混合均匀得到混合溶液，将混合溶液转移至AF/AuNPs/SPPE表面，然后滴入醋酸镁溶液，反复抽吸开启不对称RPA反应，反应结束后，用巯基乙醇(MCH)溶液冲洗，得到目标产物Bi2S3-DNA-AuNPs/SPPE。
在一个优选的实施例中，磷酸盐缓冲溶液的物质的量浓度为10mmol/L，pH值为7.4。
在一个优选的实施例中，步骤S2中的悬浮液A、溶液B和溶液C混合后，在恒温培养摇床中的反应温度为25℃、反应转速为120rpm以及反应时间为2h。
在一个优选的实施例中，步骤S5中的巯基功能化大肠杆菌O157：H7正向引物(SH-AF)溶于磷酸盐缓冲溶液的物质的量浓度为2μmol/L。
在一个优选的实施例中，步骤S5中的溶液E滴在工作电极AuNPs/SPPE表面在4℃下孵育16h。
在一个优选的实施例中，步骤S7中的大肠杆菌O157：H7溶液正向引物(AF)的物质的量浓度为10fmol/L～100pmol/L。
在一个优选的实施例中，步骤S7中的所述Bi2S3-AR添加量为4μL。
本发明还提供了一种光电化学传感器在检测大肠杆菌O157：H7上的应用，具体为，以Bi2S3-DNA-AuNPs/SPPE为工作电极，SPPE上印刷的Ag/AgCl墨水为参比电极，SPPE上印刷的碳墨水为对电极，将三电极进行组装，使所述三电极在同一纵向空间内，构建成一个微型电解池，在所述Bi2S3-DNA-AuNPs/SPPE上滴加不同pH值的磷酸盐缓冲溶液作为微型电解液；激发光源由980nm激发器提供，偏置电压设为0.2V，利用计时电流法进行测定，获得光电流信号；测定所制备的工作电极SH-AF/AuNPs/SPPE的光电流，然后依次测定扩增不同gDNA稀释浓度的大肠杆菌O157：H7后的Bi2S3-DNA-AuNPs/SPPE的光电流。
在一个优选的实施例中，电解液的pH值为4～9，所述电解液的物质的量浓度为0.05mol/L，所述大肠杆菌O157：H7gDNA的浓度为100～1012copies/mL。
本发明的一种基于RPA的光电化学传感器的制备方法及其应用，通过简单的水热法合成小尺寸、低禁带宽度、高近红外PEC活性的半导体材料Bi2S3，基于Bi2S3较好的光电响应信号，结合重组酶聚合酶扩增(RPA)技术，构建了一种核酸信号放大的光电化学传感器，实现了对大肠杆菌O157:H7的高灵敏性检测。相比于其他分析技术，本发明制备的光电化学传感器的灵敏性更高，特异性更好。本方法首次将RPA扩增应用到光电化学传感器中，基于光电化学输入信号与输出信号分离的优点实现高灵敏性检测，结合重组酶聚合酶扩增(RPA)技术实现信号放大，成功应用于致病菌大肠杆菌O157:H7的检测。本发明拓展光电化学传感器的构建思路，在食源性致病菌检测方面提高新方法，对食品安全检测提供更广阔的应用前景。
附图说明
包括附图以提供对实施例的进一步理解并且附图被并入本说明书中并且构成本说明书的一部分。附图图示了实施例并且与描述一起用于解释本发明的原理。将容易认识到其它实施例和实施例的很多预期优点，因为通过引用以下详细描述，它们变得被更好地理解。附图的元件不一定是相互按照比例的。同样的附图标记指代对应的类似部件。
图1是本发明的实施例的AuNPs/SPPE的扫描电子显微镜图(SEM),右上角插图为部分区域放大图；
图2是本发明的实施例的Bi2S3的扫描电子显微镜图(SEM)，右上角插图为Bi2S3的高分辨透射电子显微镜图(HRTEM)；
图3是本发明的实施例的添加不同浓gDNA稀释度的大肠杆菌O157：H7模板在扩增20分钟和扩增30分钟下的光电信号值的变化的示意图；
图4是本发明的实施例的不同的大肠杆菌O157：H7正向引物(SH-AF)紫外-可见吸收光谱图；
图5是本发明的实施例的在重组酶聚合酶扩增(RPA)光电化学传感器制备过程中不同正向引物(AF)浓度对PEC信号响应的影响的示意图；
图6是本发明的实施例的在重组酶聚合酶扩增(RPA)光电化学传感器制备过程中不同Bi2S3-AR添加量的琼脂糖凝胶电泳图；
图7是本发明的实施例的在重组酶聚合酶扩增(RPA)光电化学传感器制备过程中电解液的不同pH值对PEC信号响应的影响的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
下面对本发明的具体实施例做说明：
实施例1：
步骤S1：称取5mg的将氨基功能化Bi2S3(NH2-Bi2S3)溶于1mL无酶水，得到悬浮液A。将羧基功能化大肠杆菌O157：H7反向引物(COOH-AR)溶于磷酸盐缓冲溶液得到溶液B，溶解比例为2.5nmol：500μL。将30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和20mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于500μL磷酸盐缓冲溶液中，得到溶液C。其中磷酸盐缓冲溶液的物质的量浓度为10mmol/L，pH值为7.4。
步骤S2：将步骤S1中悬浮液A、溶液B和溶液C混合后，在恒温培养摇床中的反应温度为25℃、120rpm的转速振荡反应2h，得到悬浮液D。
步骤S3：将悬浮液D用磷酸盐缓冲液洗涤3～5次，在10000rpm转速下离心10min去除未连接引物，然后分散于250μL含有质量分数为1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液中，得到目标产物Bi2S3-AR。其中磷酸盐缓冲溶液的物质的量浓度为10mmol/L，pH值为7.4。
步骤S4：通过种子生长法，在纸基丝网印刷电极(SPPE)表面生长金纳米粒子(AuNPs)，通过冲洗干燥，得到目标工作电极AuNPs/SPPE，制备AuNPs/SPPE的方法如下：
首先，在243mL的去离子水中加入3mL的质量分数为1％的四水合氯金酸，煮沸15分钟，然后加入8.5mL物质的量为38.8mmol/L的柠檬酸，750rpm的转速下搅拌10分钟，得到混合溶液。然后，将SPPE放置烧杯内，移取36mL混合溶液和135mL去离子水加入烧杯内，在750rpm的转速下搅拌，5分钟后，快速注入1.25mL物质的量为0.2mol/L的盐酸羟胺和1.5mL质量分数为1％的四水合氯金酸，在转速为750rpm下搅拌30分钟。将AuNPs生长在SPPE表面后，用去离子水冲洗表面多余的溶液，最后置于60℃下干燥1小时，得到目标电极AuNPs/SPPE。
步骤S5：将巯基功能化大肠杆菌O157：H7正向引物(SH-AF)溶于磷酸盐缓冲溶液，配置成浓度为2μmol/L的溶液E。将30μL溶液E滴在AuNPs/SPPE表面于4℃下孵育16h，之后浸入巯基乙醇(MCH)溶液中20分钟，最后用磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗，得到目标产物AF/AuNPs/SPPE。其中MCH溶液的物质的量浓度为1mmol/L，磷酸盐缓冲溶液的物质的量浓度为10mmol/L，pH值为7.4。
步骤S6：用商品化的细菌提取DNA试剂盒对大肠杆菌O157：H7基因组(gDNA)进行提取，得到大肠杆菌O157：H7 gDNA。并且通过紫外分光光度法测定提取所得大肠杆菌O157：H7DNA的浓度，通过基因组gDNA浓度公式计算得到的大肠杆菌O157：H7基因组gDNA浓度为3.2×107copies/μL。该提取物作为模板参与后续RPA扩增。
步骤S7：参与RPA扩增的两种引物(正向引物和反向引物)是根据编码大肠杆菌O157：H7的紧密黏附素蛋白的基因eae A设计的，由这两种引物扩增出的产物大小为350bp。RPA的扩增方法如下：
首先，在空的100μL灭酶试管中分别加入29.5μL Rehy-dration Buffer、1μL的不同gDNA稀释浓度的大肠杆菌O157：H7、4μL的Bi2S3-AR和12.2μL无核酸酶水，为了得到最优溶液正向引物(AF)的添加浓度以激活RPA反应，分别将0.5μL物质的量为10fmol/L、100fmol/L、1pmol/L、10pmol/L和100pmol/L的溶液正向引物(AF)加入其中。将管内溶液在震荡1分钟混合均匀，得到溶液A。其中Rehy-dration Buffer是RPA试剂盒中自带的，不同gDNA的大肠杆菌O157：H7的稀释液为磷酸盐缓冲溶液；
其次，将溶液A全部移取至PRA冻干粉管内，反复抽吸5～10次混合均匀，得到混合溶液B。其中冻干粉管是RPA试剂盒中自带的；
然后，将混合溶液B移取至AF/AuNPs/SPPE工作面上，加入2.5μL物质的量为280mmol/L的醋酸镁溶液，反复抽吸10～15次，开启不对称RPA反应。其中醋酸镁溶液是试剂盒中自带的；
最后，将上述处理的AF/AuNPs/SPPE在37℃下反应20分钟。反应结束后的电极用巯基乙醇(MCH)溶液冲洗3次，室温下放置10分钟干燥电极表面，获得目标产物Bi2S3-DNA-AuNPs/SPPE。其中巯基乙醇(MCH)溶液的浓度为1mmol/L。
步骤S8：利用计时电流法，用光电化学系统测试Bi2S3-DNA-AuNPs/SPPE的光电行为，步骤如下：
首先，以Bi2S3-DNA-AuNPs/SPPE为工作电极，SPPE上印刷的Ag/AgCl墨水为参比电极，SPPE上印刷的碳墨水为对电极，将工作电极、参比电极和对电极进行组装，使三电极在同一纵向空间内，构建成一个微型电解池，在工作电极面滴加50μL的0.05mol/L，pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液作为微型电解液；
其次，激发光源由980nm激发器提供，偏置电压设为0.2V，利用计时电流法进行测定，获得光电流信号；
最后，测定所制备的工作电极SH-AF/AuNPs/SPPE的光电流，作为初始值。然后依次测定扩增不同gDNA稀释浓度的大肠杆菌O157：H7后的工作电极Bi2S3-DNA-AuNPs/SPPE的光电流。
实施案例2
步骤S1：如实施例1
步骤S2：如实施例1
步骤S3：如实施例1
步骤S4：如实施例1
步骤S5：如实施例1
步骤S6：如实施例1
步骤S7：如实施例1
步骤S8：利用计时电流法，用光电化学系统测试Bi2S3-DNA-AuNPs/SPPE的光电行为，步骤如下：
首先，以Bi2S3-DNA-AuNPs/SPPE为工作电极，SPPE上印刷的Ag/AgCl墨水为参比电极，SPPE上印刷的碳墨水为对电极，将工作电极、参比电极和对电极进行组装，使三电极在同一纵向空间内，在工作电极面滴加50μL的0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液作为微型电解液。为了得到最优电解液pH值，配置pH分别为4、5.8、7、7.4、8.2、9的电解液；
其次，激发光源由980nm激发器提供，偏置电压设为0.2V，利用计时电流法进行测定，获得光电流信号；
最后，测定所制备的工作电极SH-AF/AuNPs/SPPE的光电流，作为初始值。然后依次测定扩增不同gDNA稀释浓度的大肠杆菌O157：H7后的工作电极Bi2S3-DNA-AuNPs/SPPE的光电流。
实施例3氨基功能化Bi2S3(NH2-Bi2S3)的制备
将1.46g五水合硝酸铋加入50mL去离子水中超声溶解，得到溶液A；对合成的硫化铋的近红外光电响应，将0.9g硫代乙酰胺置于20mL水中搅拌至充分溶解，得到溶液B；将溶液A加入溶液B中，搅拌均匀，得到溶液C；将溶液C转移至30mL反应釜中，于120℃下水热反应24h；反应结束并冷却至室温后，将反应釜内衬底部的黑色产物离心并用去离子水和乙醇反复洗涤3～5次，最后在60℃下干燥，即可得到目标产物NH2-Bi2S3。
图1是本发明的AuNPs/SPPE的扫描电子显微镜图(SEM),右上角插图为部分区域放大图，如图1所示，通过种子生长法，金纳米粒子(AuNPs)成功在纸基丝网印刷电极(SPPE)表面生长，AuNPs分散均匀，尺寸均一，直径约为400nm。
图2是本发明的Bi2S3的扫描电子显微镜图(SEM)，右上角插图为Bi2S3的高分辨透射电子显微镜图(HRTEM)，如图2所示，制备的氨基功能化Bi2S3的外观呈短棒状结构，氨基功能化Bi2S3的边缘圆滑无明显棱角，棒状结构长约50nm,宽度约为20nm。短而小的棒状结构有利于光电材料与反向引物的连接。
图3是本发明的添加不同DNA浓度的大肠杆菌O157：H7模板在扩增20分钟和扩增30分钟下的光电信号值的变化的示意图，如图3所示，SH-AF/AuNPs/SPPE测出光电流值，作为初始值，不同gDNA浓度(1012-100)的大肠杆菌O157：H7的光电值分别测出来，减去初始值，得到图3。随着大肠杆菌O157：H7的DNA浓度增加，光电流值不断增强。这是由于随着扩增反应的进行，目标产物(目的条带)被固定在AuNPs/SPPE表面，随之光电信标物Bi2S3迁移至电极表面富集，从而导致光电流增强。扩增时间为30分钟下的光电值增强效果要比20分钟更明显，是因为反应体系内正向、反向引物都是过量的，而随着反应时间延长，RPA扩增反应进行得更久，因此在电极表面富集的光电信标物Bi2S3更多，从而光电流值增强得越明显。通过光电流值的变化可以反应初始大肠杆菌O157：H7的DNA浓度。
图4是本发明的不同的大肠杆菌O157：H7正向引物(SH-AF)紫外-可见吸收光谱图，如图4所示，优化大肠杆菌O157：H7正向引物(SH-AF)的最优浓度，SH-AF通过Au-S键的作用被固定到AuNPs/SPPE表面。优化结果显示，当SH-AF的浓度为2μM时，所测得的260nm处的紫外吸收值最强，且继续增加SH-AF的浓度，吸光度值变化不明显，因此选择2μM作为最优浓度。
图5是本发明的在重组酶聚合酶扩增(RPA)光电化学传感器制备过程中不同正向引物(AF)浓度对PEC信号响应的影响的示意图，如图5所示，将大肠杆菌O157：H7正向引物(SH-AF)固定在AuNPs/SPPE表面，与溶液中的其他试剂共同进行固相RPA扩增，会导致反应灵敏度较低，为提高扩增灵敏度，在反应体系内再加入一种溶液正向引物，少量合成目标产物后，进行固相化RPA扩增，可有效增大反应灵敏度。优化溶液正向引物浓度，结果显示，在正向引物添加量为1pM时，获得最强光电流值。
图6是本发明的在重组酶聚合酶扩增(RPA)光电化学传感器制备过程中不同Bi2S3-AR添加量的琼脂糖凝胶电泳图，如图6所示，为验证Bi2S3-AR能否成功参与RPA反应扩增出目的条带，同时优化Bi2S3-AR的添加量。在试管内尝试RPA扩增(AF/AuNPs/SPPE未参与)，按照试剂盒的说明，固定试管内正向引物的添加量为2.4μL，浓度为10mM。泳道1、2和3分别表示加入2μL Bi2S3-AR、4μL Bi2S3-AR和8μL Bi2S3-AR。泳道7表示添加2.4μL，浓度为10mM的AR进行扩增，Bi2S3-AR未添加，其他条件不变，产物作为标准条带。泳道4、5和6分别表示在合成Bi2S3-AR的过程中，用第一次(泳道4)、第二次(泳道5)和第三次(泳道6)的洗出液参与RPA扩增，添加量均为10μL，与此同时，Bi2S3-AR未添加，其他条件不变。结果显示，Bi2S3-AR添加量为4μL时，明显观察到目标条带产生，扩增产物的亮度与标准条带亮度相同，目标产物大小在300bp与400bp之间，因此选择4μL Bi2S3-AR为最优添加量。泳道4和5中能出现目的条带，而泳道6中相对应的位置处无条带。说明通过三次清洗，多余的AR已被洗净。通过凝胶电泳图可证明出，Bi2S3与AR连接成功且Bi2S3-AR成功参与RPA扩增。
图7是本发明的在重组酶聚合酶扩增(RPA)光电化学传感器制备过程中电解液的不同pH值对PEC信号响应的影响的示意图，如图7所示，优化光电化学检测过程中，电极表面滴加的电解液最优pH值。结果显示，固定大肠杆菌O157：H7的DNA浓度，当电解液pH值为7.4时，光电信号最强。因此电解液的pH值选择7.4。
在重组酶聚合酶扩增(RPA)光电化学传感器制备过程中，当检测的目标物大肠杆菌O157：H7gDNA的浓度为103copies/mL时，通过上述方案对制备的几个关键因素：巯基功能化大肠杆菌O157：H7正向引物(SH-AF)的浓度、正向引物(AF)的添加浓度、Bi2S3-AR添加量和电解液pH值进行优化，在最优条件下对传感器性能检测结果如下：
条件优化结果显示当体系中巯基功能化大肠杆菌O157：H7正向引物(SH-AF)的浓度为2μmol/L、正向引物(AF)的添加量为100pmol/L、Bi2S3-AR添加量为2μL和电解液pH值为7.4时，所得重组酶聚合酶扩增(RPA)光电化学传感器对大肠杆菌O157：H7检测性能最佳。
虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于RPA的光电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1：将氨基功能化Bi2S3(NH2-Bi2S3)溶于无酶水，得到悬浮液A；将羧基功能化大肠杆菌O157：H7反向引物溶于磷酸盐缓冲溶液，得到溶液B；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于磷酸盐缓冲溶液中，得到溶液C；
步骤S2：将所述悬浮液A、所述溶液B和所述溶液C混合反应得到悬浮液D；
步骤S3：所述悬浮液D用所述磷酸盐缓冲液洗涤离心后去除未连接引物，然后分散于含牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲溶液中，得到目标产物Bi2S3-AR；
步骤S4：在纸基丝网印刷电极(SPPE)表面生长金纳米粒子(AuNPs)，得到目标工作电极AuNPs/SPPE；
步骤S5：将巯基功能化大肠杆菌O157：H7正向引物溶于磷酸盐缓冲溶液，得到溶液E，将所述溶液E滴在所述工作电极AuNPs/SPPE表面进行孵育，孵育结束后，用巯基乙醇(MCH)溶液冲洗，得到目标产物AF/AuNPs/SPPE；
步骤S6：用细菌DNA提取试剂盒对大肠杆菌O157：H7的基因组DNA(gDNA)进行提取，得到大肠杆菌O157：H7gDNA，产物作为模板参与后续RPA扩增；
步骤S7：将所述Bi2S3-AR、所述大肠杆菌O157：H7gDNA、无核酸酶水、Rehy-drationBuffer和大肠杆菌O157：H7溶液正向引物加入到冻干粉试剂管内混合均匀得到混合溶液，将所述混合溶液转移至所述AF/AuNPs/SPPE表面，然后滴入醋酸镁溶液，反复抽吸开启不对称RPA反应，反应结束后，用所述巯基乙醇(MCH)溶液冲洗电极，得到目标产物Bi2S3-DNA-AuNPs/SPPE。
2.根据权利要求1所述的基于RPA的光电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的物质的量浓度为10mmol/L，pH值为7.4。
3.根据权利要求1所述的基于RPA的光电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的所述悬浮液A、所述溶液B和所述溶液C混合后，在恒温培养摇床中的反应温度为25℃、反应转速为120rpm以及反应时间为2h。
4.根据权利要求1所述的基于RPA的光电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中的所述巯基功能化大肠杆菌O157：H7正向引物溶于所述磷酸盐缓冲溶液的物质的量浓度为2μmol/L。
5.根据权利要求1所述的基于RPA的光电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中的所述溶液E滴在所述工作电极AuNPs/SPPE表面在4℃下孵育16h。
6.根据权利要求1所述的基于RPA的光电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中的所述大肠杆菌O157：H7溶液正向引物的物质的量浓度为10fmol/L～100pmol/L。
7.根据权利要求1所述的基于RPA的光电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中的所述Bi2S3-AR添加量为4μL。
8.一种根据权利要求1-7任一项所述的方法制备光电化学传感器。
9.根据权利要求1所述的光电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述Bi2S3-DNA-AuNPs/SPPE为工作电极，将pH值为4～9的磷酸缓冲溶液作为微型电解液滴加于所述工作电极，所述磷酸缓冲溶液的物质的量浓度为0.05mol/L，所述大肠杆菌O157：H7gDNA的浓度为100～1012copies/mL。
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US7399590B2 (en) * 2002-02-21 2008-07-15 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
US9624532B2 (en) * 2013-02-05 2017-04-18 Neil Gordon Ultra-sensitive detection of extremely low level biological analytes using electrochemical signal amplification and biosensor
CN111534595A (zh) * 2020-05-20 2020-08-14 青岛科技大学 一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤dna液体活检的方法
CN112098492B (zh) * 2020-09-11 2022-09-16 江西师范大学 一种基于生物诱导生成的溴氧化铋/硫化铋半导体异质结光电化学检测有机磷农药的方法
CN112813199B (zh) * 2021-01-14 2022-07-15 青岛科技大学 一种检测肠道病毒cvb3的方法
CN113588752B (zh) * 2021-09-01 2023-10-13 集美大学 一种电致化学发光适配体传感器的制备方法及应用

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