CN112813199B - 一种检测肠道病毒cvb3的方法 - Google Patents

一种检测肠道病毒cvb3的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于电化学和分析化学领域，本发明的目的在于提供一种基于原位重组酶聚合酶扩增光致电化学生物传感器检测CVB3的方法。利用重组酶聚合酶扩增，将扩增产物原位连接到电极上，扩增产物上的生物素与溶液中的链霉亲和素标记的碱性磷酸酯酶作用，碱性磷酸酯酶再催化溶液中的底物对氨基苯基磷酸单钠水解生成游离的电子供体对氨基苯酚，对氨基苯酚增强修饰电极的光致电化学反应从而产生增强的光电信号，实现对CVB3的检测，该方法具有高的灵敏度，方法简单。

Description

一种检测肠道病毒CVB3的方法
技术领域
本发明属于分析化学与光致电化学传感器领域，具体为一种基于原位重组酶聚合酶扩增光致电化学生物传感器检测CVB3的方法。
背景技术
柯萨奇B3病毒(Coxsackievirus B3，CVB3)是肠道病毒属的一种，具有较高的发病率和死亡率。这种小型的单链RNA病毒会引起多种症状。比如：常见于五岁以下的儿童的手足口病，重度急性弛缓性麻痹，脑膜炎以及新生儿器官衰竭。但是发展快速、灵敏的CVB3分子诊断技术具有挑战性。本发明的目的在于提供一种基于原位重组酶聚合酶扩增光致电化学生物传感器检测CVB3的方法。利用重组酶聚合酶扩增(RPA)，将扩增产物原位连接到电极上，扩增产物上的生物素与溶液中的链霉亲和素标记的碱性磷酸酯酶作用，碱性磷酸酯酶再催化溶液中的底物对氨基苯基磷酸酯水解生成游离的电子供体对氨基苯酚，对氨基苯酚增强修饰电极的光致电化学反应从而产生增强的光电信号。在最佳条件下，光致电化学信号与CVB3的浓度在0.1fM～100fM范围内呈现出良好的线性关系，LOD为30aM。此外，该方法具有良好的稳定性、重现性和选择性，为CVB3检测提供了一种新的思路，为进一步研究便携式临床样品处理和分析装置奠定了基础。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于原位重组酶聚合酶扩增光致电化学生物传感器检测CVB3的方法。
本发明的目的是这样实现的：用ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs修饰碳糊电极，构建光致电化学传感器以实现对CVB3的测定；一种基于原位重组酶聚合酶扩增光致电化学生物传感器检测CVB3的方法。首先，利用光电活性物质修饰电极，然后在电极上固定正向引物，当有目标物存在时，扩增得到含生物素的产物，将链霉亲和素标记的碱性磷酸酯酶识别并捕获在电极上，再水解溶液中的底物对氨基苯基磷酸酯，生成电子供体对氨基苯酚，对氨基苯酚增强光电活性物质ZnSeNSs/AuNPs/BNNS的光电信号，根据光电信号的强弱实现对CVB3的测定，具体包括如下步骤：
复合材料ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs的制备
称取20mg的氮化硼粉末加入到盛有50.0mL的乙二醇溶液的烧杯中，超声剥离2h后使氮化硼均匀的分散在溶液中，制得氮化硼纳米片。之后将该烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，同时用制备的5mM的氢氧化钠溶液滴定，直至溶液pH达到10.0。随后，将烧杯转移到恒温水浴加热搅拌器上，并向烧杯中加入2.0ml 0.0240mol/L氯金酸，在100℃恒温水浴中加热4h，加热完成后，将烧杯中的溶液分装到离心管中并分别离心三次(12000r/min，10min)。离心后，收集沉淀物在80℃下干燥2h。获得了AuNPs/BNNSs材料。称取0.0150gAuNPs/BNNSs，分散于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将分散液置于4℃冰箱中使用。称取0.0150g块状硒化锌分散于DMF中，超声剥离8h后得到ZnSeNSs。最后，吸取2mL AuNPs/BNNSs和2mL ZnSeNSs分散液转移到同一离心管中，超声波振动使溶液均匀混合，制得ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs复合材料。
CVB3含量的测定
首先，将碳粉和石蜡按3:1的比例混合在玛瑙研钵中，研磨均匀后，放入80℃的烘箱中，恒温加热30分钟，取出后研磨10分钟，再次放入烘箱中，重复此操作三次得糊状粉末。接下来，将糊状粉末放入玻璃管中，插入铜线，在抛光纸上抛光电极，用去离子水清洗电极，得到碳糊电极CPE。再将1μL～50μL的ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs溶液滴到新制的碳糊电极表面上，并在空气中自然干燥。然后将1μL～50μL的1μM巯基化正向引物滴在电极表面，用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤三次，去除多余的未结合引物。随后，将1μL～50μL的0.1mM巯基乙胺MCH滴在ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs修饰电极表面，封闭电极表面的非特异活性位点，并用氮气吹干电极。然后在ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE上进行扩增。将2.4μL的10μM反向引物、10μL模板溶液，29.5μL缓冲液和13.2μL去离子水混合并添加到冻干酶颗粒体系中，然后再加入浓度为280mM的2.5μL醋酸镁溶液。之后，取1μL～50μL滴加到ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE上，在37℃下原位扩增30min后，电极用0.1M磷酸缓冲溶液洗涤。最后，将电极浸入2μL～60μL SA-ALP溶液中，在37℃下孵育30分钟，用0.1M磷酸缓冲溶液洗涤电极，将电极插入对氨基苯基磷酸酯的溶液中，ALP催化水解对氨基苯基磷酸酯为对氨基苯酚。在对氨基苯酚的作用下产生强的光电信号，根据PEC信号强度实现CVB3含量的测定。
发明的优点与效果
PEC生物传感器的定量分析性能：在最佳实验条件下对其进行了测试。图3描述了CVB3的浓度从0.1fM增加到100fM时，PEC响应情况。光电流与CVB3浓度的对数值之间呈良好的线性关系。线性回归方程为I＝640.60logc–203.99(R2＝0.9980)，其中I、c代表PEC响应、CVB3浓度。
PEC生物传感器的特异性：选择几种干扰物质，包括甲型流感病毒、轮状病毒、腺病毒、人双埃柯病毒、人鼻病毒和大肠杆菌，从每种病毒中提取核酸进行实验。如图4a所示，空白组试验的光电流响应与干扰物质相比没有表现出差异。以1.0fM CVB3为检测样品，观察到光电流响应显著增强。此外，含有10.0fM干扰物质和1.0fM CVB3的混合物与单独的CVB3相比，光电流响应没有明显变化。因此，实验结果表明，PEC生物传感器对CVB3的检测有很好的选择性。
附图说明
图1原位重组酶聚合酶扩增光致电化学生物传感器检测CVB3原理示意图。
图2传感器构建过程性能表征。(a)传感器在0.1mM对氨基苯基磷酸单钠溶液中的光电流响应。从左到右依次为：CPE，ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE，Primer/ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE(固定正向引物)，Amplicon/Primer/ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE(扩增)，SA-ALP/Amplicon/Primer/ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE(扩增后连接链霉亲和素标记碱性磷酸酯酶)。(b)传感器组装过程的阻抗图。从左到右依次为，CPE(◆)，ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE
Figure GDA0003690607340000021
Primer/ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE
Figure GDA0003690607340000022
Amplicon/Primer/ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE(●)，SA-ALP/Amplicon/Primer/ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE(★)。在含有0.1MKCl的5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中测试。(c)CVB3扩增凝胶电泳分析。+，含模板；-，不含模板；M，marker。
图3不同浓度的CVB3对应的PEC信号(a)。从左到右对应的CVB3浓度为0,0.1fM,0.3fM,0.5fM,1.0fM,3.0fM,5.0fM,10.0fM,30.0fM,50.0fM,70.0fM,100.0fM。检测CVB3的线性响应(b)。插图：PEC信号与CVB3浓度对数之间的线性关系。
图4PEC生物传感器的选择性(a)。从左至右：空白，CVB3，甲型流感病毒、轮状病毒、腺病毒、人双埃柯病毒、人鼻病毒、大肠杆菌，CVB3与干扰物的混合溶液。PEC生物传感器在周期性开关灯下持续5个周期的光电流响应(b)。PEC生物传感器在储存一个月中的稳定性(c)，CVB3的浓度为100.0fM。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但不构成对发明的进一步限制。
实例1：PEC分析检测方法的构建。
在PEC传感器分析测定CVB3中，RPA用于扩增靶标。在0.1mM对氨基苯基磷酸单钠溶液中考察了传感器构建过程PEC性能。CPE的PEC信号分别为35.3nA；ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE的PEC信号为835.0nA；Primer/ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE(固定正向引物)的PEC信号分别为713.1nA；Amplicon/Primer/ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE(扩增)的PEC信号为682.0nA；SA-ALP/Amplicon/Primer/ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE(扩增后连接链霉亲和素标记碱性磷酸酯酶)的PEC信号为3622.0nA。在含有0.1M KCl的5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中测试传感器组装过程的阻抗。CPE显示较小的Ret值。当ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs修饰到CPE上时，与裸CPE相比，Ret值有所增加。将Primer修饰到ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE上后，Ret值增加。电极与MCH作用后，Ret值进一步增加。最后，在Primer/ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE上进行重组酶聚合酶扩增后，Ret显著增加。EIS结果表明，分析方法的构建是成功的。CVB3扩增凝胶电泳显示：含模板时扩增得到对应产物；不含模板时扩增不得到对应产物(图2)。
实例2：样品检测
对氨基苯基磷酸单钠(4-APP)购于上海惠诚生物有限公司(中国，上海)。对氨基苯酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、巯基乙胺(MCH)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(SA-ALP)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)由Sangon Biotech Co.，Ltd.(中国，上海)提供。TwistAmp Basic RT-RPA试剂盒(Twist-DX)、重组酶聚合酶缓冲溶液从Babraham(UK)购买的。生物素标记的反向引物RP、巯基化正向引物FP由Sangon Biotech Co.，Ltd.(中国，上海)合成。氮化硼粉末购自于南京先锋纳米有限公司；硒化锌购自于麦克林生化有限公司。
正向引物和反向引物的序列如下：
正向引物FP：5'-SH-AGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC-3'
反向引物RP：5'-Biotin-GGATGGCCAATCCAATAGCTATATGGTAACAA-3'
模板：5'-AGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTA ACTGC GGAGC AGATAT CCA C A CACCAGTGGACAGTCTGTCGTAATGGGC AACTC TGCA GCGG AACCGA CTAC TTT GG G TGTCCGTGTTTCCTTTTATCTTTTATTGGCTGCTT ATGGT GAC AA TTGA GAGA TT GT TACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCC-3'
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析是使用ADYCP-31E电泳仪(WoDeLife SciencesInstrument Co.，Ltd.，中国)进行的。所有光致电化学(PEC)测量均在CHI660E电化学工作站上进行(中国，上海辰华仪器有限公司)。
取人血清，采用标准加入法检测健康人血清样品中的CVB3，并将本法测定CVB3浓度与qRT-PCR测定的浓度进行比较。当0.3fM、5.0fM、10.0fM浓度的CVB3添加在血清样品中时，其回收率为98.8％～102.4％，相对标准偏差(RSD)在2.3％～3.6％之间(表1)。与标准方法qRT-PCR(Control method)相比，PEC的测定结果与qRT-PCR结果一致。说明了该方法在实际样品分析中的可行性和准确性。
表1健康人血清中CVB3的测定(n＝11)
Figure GDA0003690607340000031
afM
序列表
<110> 青岛科技大学
<120> 一种检测肠道病毒CVB3的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Forward primer
<400> 1
agtcctccgg cccctgaatg cggctaatcc 30
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> Reverse primer
<400> 2
ggatggccaa tccaatagct atatggtaac aa 32
<210> 3
<211> 195
<212> DNA
<213> Template
<400> 3
agtcctccgg cccctgaatg cggctaatcc taactgcgga gcagatatcc acacaccagt 60
ggacagtctg tcgtaatggg caactctgca gcggaaccga ctactttggg tgtccgtgtt 120
tccttttatc ttttattggc tgcttatggt gacaattgag agattgttac catatagcta 180
ttggattggc catcc 195

Claims (1)

1.一种非诊断目的的检测肠道病毒CVB3的方法，包括如下步骤：
(1)复合材料ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs的制备
称取20mg的氮化硼粉末加入到盛有50.0mL的乙二醇溶液的烧杯中，超声剥离2h后使氮化硼均匀的分散在溶液中，制得BNNSs；之后将该装有BNNSs的烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，同时用制备的5mM的氢氧化钠溶液滴定，直至溶液pH达到10.0；随后，将烧杯转移到恒温水浴加热搅拌器上，并向烧杯中加入2.0ml 0.0240mol/L氯金酸，在100℃恒温水浴中加热4h，加热完成后，将烧杯中的溶液分装到离心管中并分别离心三次，条件为12000r/min，10min；离心后，收集沉淀物在80℃下干燥2h，获得了AuNPs/BNNSs材料；称取0.0150gAuNPs/BNNSs，分散于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将分散液置于4℃冰箱中待使用；称取0.0150g块状硒化锌分散于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，超声剥离8h后得到ZnSeNSs；最后，吸取2mL AuNPs/BNNSs和2mL ZnSeNSs分散液转移到同一离心管中，超声波振动使溶液均匀混合，制得ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs复合材料；
(2)CVB3含量的测定
首先，将碳粉和石蜡按3:1的比例混合在玛瑙研钵中，研磨均匀后，放入80℃的烘箱中，恒温加热30min，取出后研磨10min，再次放入烘箱中，重复此操作三次得糊状粉末；接下来，将糊状粉末放入玻璃管中，插入铜线，在抛光纸上抛光电极，用去离子水清洗电极，得到碳糊电极(CPE)；再将1μL～50μL的ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs溶液滴到新制的碳糊电极表面上，并在空气中自然干燥；然后将1μL～50μL的1μM巯基化正向引物滴在电极表面，用pH 7.0磷酸盐缓冲液洗涤三次，去除多余的未结合引物；随后，将1μL～50μL的0.1mM巯基乙胺(MCH)滴在ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs修饰电极表面，封闭电极表面的非特异活性位点，并用氮气吹干电极；然后在ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE上进行扩增；将2.4μL的10μM生物素标记的反向引物、10μL模板溶液，29.5μL缓冲液和13.2μL去离子水混合并添加到RPA冻干酶颗粒体系中，然后再加入浓度为280mM的2.5μL醋酸镁溶液；之后取1μL～50μL滴加到ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs/CPE上，在37℃下原位扩增30min后，电极用0.1M磷酸缓冲溶液洗涤；最后，将电极浸入2μL～60μL链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(SA-ALP)溶液中，在37℃下孵育30min，用0.1M磷酸缓冲溶液洗涤电极，将电极插入对氨基苯基磷酸单钠的溶液中，碱性磷酸酶(ALP)催化水解对氨基苯基磷酸单钠为对氨基苯酚；在对氨基苯酚的作用下产生强的光电信号，根据光电信号强度实现CVB3含量的测定；其所用的正向引物、反向引物序列如下：
正向引物FP：5'-SH-AGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC-3'
反向引物RP：5'-Biotin-GGATGGCCAATCCAATAGCTATATGGTAACAA-3'。
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