CN110243907B - 一种检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器、制备方法及其应用 - Google Patents

一种检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析化学及兽药残留分析技术领域，尤其涉及一种检测β‑内酰胺类抗生素的电化学受体传感器、制备方法及其应用。该电化学受体传感器包括电化学探针、信号探针、新型复合纳米材料，所述的电化学探针为硫堇，所述的信号探针为HRP标记氨苄青霉素(HRP‑AMP)，所述的复合纳米材料为石墨烯/硫堇/玻碳电极(GO/TH/GCE)。本发明所公开的方法可用于检测头孢氨苄、头孢喹肟、头孢噻呋、青霉素G、氨苄西林，从而为食品中该类物质的检测提供一个快速且灵敏的方法。本发明所建立的检测方法准确度高，灵敏度好，与现有的方法相比，可以节省大量的时间和成本，具有更好的市场应用价值。

Description

一种检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器、制备方法 及其应用
技术领域
本发明属于分析化学及兽药残留分析技术领域，尤其涉及一种检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器、制备方法及其应用。
背景技术
β-内酰胺类抗生素，由于其药效高、价格低廉、使用方便，已成为临床上治疗细菌感染最常用的抗生素，在畜牧兽医水产养殖领域也得到了广泛的应用。目前主要用于治疗奶牛乳腺炎、鱼、虾细菌感染和海参的疾病。然而，用药不规范对渔业生产和生态环境都有严重的潜在危害，也会导致药物在奶和动物、水产品组织中的残留，使人体产生耐药性导致免疫力降低从而危害人体健康。对动物源性食品中此类抗生素残留的有效监测已经成为保障食品安全的一个重要环节。
β-内酰胺类抗生素药物残留的检测方法一直以来都是研究人员关注的热点，目前已报道的方法主要有微生物法、免疫分析法、拉曼光谱法、高效液相色谱-紫外法、液相色谱-质谱法、电化学生物传感器法等。微生物法操作快速简便、价格便宜但专属性不足，容易产生假阳性；光谱法在定量方面存在缺陷；液相色谱-质谱法可避免生物法在准确性方面的欠缺，灵敏度高、选择性强，但由于仪器价格昂贵，不能满足绝大多数实验室的需求。
近年来，随着β-内酰胺类抗生素药物在食品中残留问题的严重化，电化学生物传感器法对其的检测也在不断地优化。电化学生物传感器中的生物识别物质包括有抗原抗体、酶、微生物、细胞以及核酸等，其中，以受体蛋白为识别元件的电化学受体传感器对β-内酰胺类抗生素的检测相对于其他几种方法有明显的优势。
与其他检测方法相比，电化学受体传感器具有以下优势：一是受体—配体的特异性作用使得受体传感器具有高灵敏度，即特异性高；二是基于修饰电极的纳米质优良的电化学特征使检出限明显降低；三是检测过程耗时短，历时以分钟计；四是受体传感器造价较低、易于推广使用、轻巧便于携带，操作程序简易而不需专业培训。电化学受体传感器的灵敏度主要取决于生物分子与电极之间电子的直接迁徙速率，许多研究是通过在电极表面引入电子传递介质亚甲基蓝、二茂铁衍生物、离子液体和纳米材料等来提高生物传感器的电子直接迁徙速率。
纳米功能材料是电化学受体传感器的核心。它在纳米材料的作用下，可提高传感器的灵敏度和抗干扰性，从而简化并加速信号的传递。纳米材料作为放大因子可以从五种不同的途径中实现电化学传感器中的信号放大，作为电极材料构筑平台提供了大的比表面积和多个结合位点；作为催化剂有良好的电催化性能；且促进了电子的转移，具有良好的导电性；作为信号因子的载体，具有增强负载信号的功能；且在一定程度上与其他放大技术结合，实现多重的信号放大。
综上所述，对于食品中残留的β-内酰胺类抗生素药物，传统的检测方法在不同程度上存在操作复杂，耗时长，会出现假阳性结果等问题。电化学受体传感器是检测上述药物较为先进和合适的方法。因此，建立一种检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器及其制备方法和应用是很有意义的。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器、制备方法及其应用，用于头孢氨苄、头孢喹肟、头孢噻呋、青霉素G、氨苄西林的检测。
本发明是这样实现的，一种检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备石墨烯硫堇复合物；
S2：获得受体蛋白BlaR-CTD；
S3：构建受体传感器；
S4：制备信号探针。
进一步，步骤S3中构建受体传感器的具体步骤为将步骤S1中得到的石墨烯硫堇复合物涂至电极表面；之后将步骤S2中得到的受体蛋白BlaR-CTD滴加至修饰了石墨烯硫堇复合物的电极表面，孵育；PBS溶液冲洗干净后置于BSA溶液中孵育；再次用PBS缓冲液将电极冲洗干净即可。
进一步，步骤S3中所述孵育温度均为37℃。
进一步，步骤S3滴加受体蛋白BlaR-CTD至电极表面后，孵育时间为1.5h。
进一步，步骤S3电极在BSA溶液中孵育时间为30min。
进一步，步骤S4中所述信号探针为酶标记物HRP-AMP。
一种利用上述的制备方法制备的检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器。
如上述的检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器在检测β-内酰胺类抗生素中的应用。
进一步，所述β-内酰胺类抗生素为头孢氨苄、头孢喹肟、头孢噻呋、青霉素G、氨苄西林中任一种。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明的传感器包括电化学探针、信号探针、新型复合纳米材料，所述的电化学探针为无标记的硫堇，所述的信号探针为HRP-AMP，所述的复合纳米材料为GO/TH/GCE，即石墨烯/硫堇/玻碳电极。以石墨烯/硫堇/玻碳电极(GO/TH/GCE)为电极基质，采用了辣根过氧化物酶(HRP)进行催化氧化过氧化氢(H2O2)放大响应信号，通过循环伏安法测定可得到电流氧化还原响应值，可用于食品中β-内酰胺类抗生素头孢氨苄、头孢喹肟、头孢噻呋、青霉素G、氨苄西林的残留检测，为食品中的青霉素类药物残留检测提供了一个快速灵敏的方法。
本发明所建立的电化学受体传感器灵敏度高，精密度高，检测范围宽且稳定性好。其在0.1-8μg/L浓度范围内，线性方程为I(μA)＝-66.745×lg(Ccefquinome)(μg/L)+117.06，相关系数为0.9946，灵敏度为0.16μg/L。牛奶样品中头孢氨苄、头孢喹肟、头孢噻呋、青霉素G、氨苄西林的LOD分别为14.88μg/L、2.46μg/L、17.16μg/L、0.06μg/L、0.21μg/L，LOQ依次为36.09μg/L、5.4μg/L、41.45μg/L、0.13μg/L、0.42μg/L，按1×LOQ、2×LOQ、4×LOQ向牛奶中添加头孢氨苄、头孢喹肟、头孢噻呋、青霉素G、氨苄西林，添加回收率为92.94％-108.83％，批间和批内变异系数均小于13％，预期该方法在食品中β-内酰胺抗生素的检测领域可能有很大的潜在应用价值。
附图说明
图1是石墨烯硫堇复合物紫外可见光分光光度计表征图；
图2是BlaR-CTD蛋白的诱导表达结果；
图3是BlaR-CTD蛋白纯化结果；
图4是蛋白纯化结果；
图5是电化学受体传感器的制备工艺示意图；
图6是HRP-AMP的紫外光谱；
图7是电极自组装过程的电化学阻抗图；
图8是电极自组装过程的循环伏安图；
图9是受体传感器检测不同浓度0.1、0.5、1、2、4、8μg/L头孢喹肟的标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器、制备方法及其应用，具体如下各实施例所示。
实施例1检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器的制备
S1：制备石墨烯硫堇复合物。
将2mg石墨烯超声悬浮于1mL PBS溶液中，加入2mL 5mg/mL硫堇溶液室温搅拌24h；4000r/min离心5min，用超纯水洗涤3遍，将1mg石墨烯硫堇复合物重悬于1mL PBS缓冲液。
用紫外可见分光光度计表征上述制备的石墨烯硫堇复合物，如图1所示可见修饰成功，4℃保存备用。
S2：受体突变蛋白的诱导表达、纯化。
诱导表达：
1.将大肠杆菌pET-28a(+)-BlaR-CTD(公知公用)单菌落接种于LB/Kan肉汤中培养12h；
2.取10mL菌液加入到1L的LB肉汤和500μL卡那霉素中，置于37℃摇床中培养3h至菌液的OD600值在0.6左右，转速设置为220r/min；
3.向其中加入终浓度为1.0mM的IPTG，设置转速为220r/min，诱导时间和温度设置为18℃12h；
4.将菌液在4℃下10000r/min离心10min，收集菌体沉淀；
5.向离心管中加入预冷的PBS缓冲液重悬沉淀，4℃下10000r/min离心10min，重复3次，然后加入结合缓冲液重悬菌体，超声破碎后进行蛋白电泳检测，结果如图2所示，超声破碎后蛋白几乎完全表达于上清中，说明该条件可用于后续蛋白的诱导表达。
蛋白样品制备：将诱导蛋白表达后的菌液收集于100mL离心管中，4℃下12000r/min离心10min，收集菌液。使用预冷到4℃的PBS缓冲液重悬菌体，12000r/min离心10min，去除上清液。重复该步骤3次。然后加入结合缓冲液重悬菌体100mL，混匀。用超声破碎仪超声处理，将离心管平稳置于冰水混合物中，固定紧后，将探头深入到液面下离底部约2cm处，进行超声处理；超声5s，暂停5s，放大45％，工作时间30min。整个过程必须于低温下进行，以防止超声过程产生的热量使蛋白变性。4℃下10000r/min离心40min，收集上清。
BlaR-CTD蛋白纯化时收集不同浓度的咪唑的洗脱液，并进行SDS-PAGE电泳，图3为SDS-PAGE图，其中：泳道1-3是浓度为35mM咪唑洗脱时收集的液体，泳道4-6是浓度为60mM咪唑洗脱时收集的液体，泳道7-9是浓度为100mM咪唑洗脱时收集的液体，泳道10-12是浓度为200mM咪唑洗脱时收集的液体，泳道13-14分别是浓度为300mM、400mM咪唑洗脱时收集的液体，泳道M为protein marker。结果表明在咪唑浓度为60、100、200mM时均洗脱下目的蛋白。
PBS透析：配置2％(W/V)的碳酸氢钠和1mmol·L-1的EDTA(pH 8.0)溶液，将透析袋剪成适当小段后放入其中，煮沸10min，然后放入蒸馏水中煮沸10min，冷却后，存放于4℃。使用前排出透析袋中的溶液，即可取用。将纯化后含有目的蛋白的溶液收集起来放入透析袋中，两端绑紧后放入到PBS缓冲液中，置于4℃中透析。每天更换透析液3次，透析3d，以彻底去除其中的咪唑。透析结束后向蛋白中加入终浓度为10％的甘油，混匀后分装于1.5mL的EP管中，每管500μL，置于-80℃冻存。
PBS透析后除去洗脱液中的咪唑，以免影响蛋白活性，取收集液样品进行SDS-PAGE验证，纯化后的野生型蛋白及突变蛋白结果如图4所示，其中，泳道1-11分别是BlaR-CTD、A138E、Q147K、I188K、S190Y、V197D、S19C/G24C、R50C/Q147C、S76C/L96C、S135C/S145C、E183C/I188C蛋白纯化后的结果，泳道M为protein marker。条带较为单一，表明蛋白纯化成功。
S3：受体传感器的构建。
打磨抛光好的电极滴涂石墨烯硫堇复合物定量10μL；在修饰了材料的电极表面滴加10μL BlaR-CTD蛋白稀释液，稀释液的蛋白浓度为0.8mg/mL，37℃孵育1.5h；然后用0.1MPBS溶液冲洗干净后置于1％BSA溶液中37℃孵育30min，以封闭非特异性的活性位点；封闭完成后，再次用PBS缓冲液将电极冲洗干净。至此，所需检测抗生素的电化学免疫传感器制备完成，制备原理如图5所示。
实施例2获取信号探针
酶标记物的制备
1.称取氨苄西林6.18mg，溶于1mL的PBS中，倒入含有磁性粒子的棕色瓶子中，记为A液；
2.称取碳二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,EDC)2.4mg，溶于1mL的PBS后逐滴加入到A液中，称取N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)1.80mg，溶于1mL的PBS后逐滴加入到反应液中，室温搅拌2h；
3.称取HRP 4.3mg，溶于2mL的PBS中，室温搅拌至溶解，记为B液；
4.将A液缓慢滴加于B液中，4℃避光搅拌10h；
5.收集溶液，放入4℃PBS中透析3d，每天更换PBS 2次，透析结束后加入等量甘油冻存于-20℃；
6.分别测定AMP、HRP以及HRP-AMP放入紫外全波长图，得到各物质的最大吸收波长，鉴定是否偶联成功。
合成的酶标记药物HRP-AMP的紫外光谱图如图6所示。HRP的酶活性中心的最大吸收波长为403nm，合成后偶联物HRP-AMP的最大吸收波长与HRP保持一致，证明酶的活性没有发生变化，偶联物的紫外吸收光谱与HRP有所差异，发生一定程度的偏移，因此可以初步判断HRP与AMP偶联成功，得到信号探针。
本发明中利用HRP进行催化氧化H2O2放大响应信号的基本原理是：
H2O2+HRP(Fe3+)→化合物I+H2O (1)
化合物I+PTh(Red)→化合物II+PTH(Ox)*→HRP(Fe3+)+PTH(Ox) (2)
PTH(Ox)+2H++2e→PTh(Red) (3)
实施例3工作电极的电化学表征
为了监测电化学免疫传感器的界面属性，本研究采用电化学阻抗(EIS)和循环伏安法(CV)验证电极的逐层修饰情况，其中循环伏安法检测条件：电压-0.2-0.8V，扫描速率50mV/s；电化学阻抗谱检测条件：频率范围为10-2-105Hz，振幅为10mV。电极自组装过程的电化学阻抗图如图7所示，裸GCE电极显示出一个很小的圆弧(b散点)，当裸GCE电极上修饰了GO/TH后，圆弧半径明显减小甚至成一条直线(a散点)，这样的结果预示着GO/TH能够促进[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-电子的转移。然而，当受体蛋白和BSA修饰到电极表面后，圆弧半径逐步的增加，电阻也相应的增大(c、d散点)，这说明该电化学免疫传感器已经成功制备。图8为CV的相应曲线，其结果与EIS的结果一致。当GO/TH被成功修饰到裸GCE电极上后，峰值电流明显增加(绿色曲线)，这是因为GO/TH具有优异的促进电子传导功能，相反的，随着受体蛋白和BSA的逐步加入，峰值电流逐步减小(紫色和红色曲线)。CV和EIS表征都有效的证明了电极修饰成功。
实施例4牛奶样品中空白及加标头孢氨苄的测定
步骤1，取20份空白牛奶样品，准确称取全脂牛奶样品10mL置于50mL的离心管中，加入PBS稀释10倍后用于电化学受体分析检测，传感器用PBS缓冲溶液冲洗后，滴加10μL包含10μg/mL的HRP-AMP和不同浓度的抗生素标准品的反应液中37℃孵育45min，再用PBS洗涤液冲洗干净后，将电极浸入含H2O2的磷酸缓冲溶液中检测电化学CV信号。检测后得到CV电流值，将其代入回归方程，以药物浓度的对数值为横坐标，电流的响应值为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数。根据回归方程计算出空白样品的检测值，及20份空白样品的平均检测值和标准差，根据公式Z＝C+3×SD计算Z值(其中C代表平均检测值和SD代表标准差，Z表示检测限、定量限)，此即为组织方法的检测限(LOD)，根据公式Z＝C+10×SD计算Z值，则得到检测样品的定量限(LOQ)。本实施例中最终得到空白牛奶样品中头孢氨苄的LOD为14.88μg/L，LOQ为36.09μg/L，其标准差为3.03。
步骤2，取上述空白样品，按照药物在测得的空白组织样品中的1倍LOQ、2倍LOQ和4倍LOQ值进行添加试验，每个样品浓度设置5个平行样。对样品进行处理后采用电化学方法测定药物浓度，检测方法为取10mL全脂牛奶样品10mL置于50mL的离心管中，然后向其中加入硫酸铵1.718g，摇匀充分沉淀，4℃、8000r/min离心10min。过滤除去沉淀物，取上清液，再对上清液进行过滤，进一步去除杂质和悬浮物，并将pH值调为6处理后，采用电化学免疫法进行样品检测。传感器用PBS缓冲溶液冲洗后，滴加10μL包含10μg/mL的HRP-AMP和不同浓度的抗生素标准品的反应液中37℃孵育45min，再用PBS洗涤液冲洗干净后，将电极浸入含H2O2的磷酸缓冲溶液中检测电化学CV信号。重复3批，计算回收率，并计算组内和组间变异系数(CV＝SD/MN)，结果如下表所示。
表1为受体传感器检测加标牛奶中的头孢氨苄浓度的回收率
Figure BDA0002112094500000071
实施例4牛奶样品中空白及加标头孢喹肟的测定
为了获得β-内酰胺抗生素受体传感器的最佳分析性能，对实验的几个关键实验条件进行了优化。首先是蛋白最佳包被浓度的确定，突变蛋白用PBS缓冲液按照1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200稀释为4μg/L、2μg/L、1μg/L、0.5μg/L、0.25μg/L，将修饰好的工作电极滴涂稀释好的不同浓度包被原10μL，4℃过夜包被，然后用PBS清洗干净后滴加2％BSA 10μL，4℃封闭12h进行CV扫描，记录浓度与电流响应值的变化情况。然后以响应值最好时蛋白最佳包被浓度修饰电极，封闭反应后，按照1：150、1:300、1:600、1:1200、1:2400的比例进行HRP-AMP溶液的稀释，37℃孵育45min，进行间接竞争免疫反应并用电化学工作站检测信号响应值的变化情况，记录峰电流值。以峰电流响应值最高时对应的酶标药浓度作为最佳抗体稀释度。
为了得到较优分析性能的电化学传感器，对一些实验条件如反应温度、孵育时间、检测溶液pH值也进行考查。选定25℃、30℃、37℃、40℃为反应温度测定该条件下的电流响应值，反应时间分别为15、30、45、60min并测定电流值，按照已经优化的反应条件，将反应体系中PBS的pH分别调至5.0、6.0、7.0、7.4、8.0，测定电流响应值值，考察pH是否对蛋白活性有影响。
步骤1，受体传感器在的优化的条件下采用循环伏安法(CV)检测不同浓度的头孢喹肟，用PBS将其稀释为0.1、0.5、1、2、4、8μg/L等5个浓度，以药物浓度的对数为横坐标，电流的响应值为纵坐标，建立标准曲线，结果可见当药物浓度在0.1-8μg/L范围时，如图9峰电流响应值与药物浓度的对数呈良好的线性关系，线性方程为I(μA)＝-66.745×lg(Ccefquinome)(μg/L)+117.06，相关系数为0.9946，灵敏度为0.16μg/L。LOD＝3×Sa/b，Sa是标准曲线截距a的标准差，b是标准曲线的斜率。
步骤2，取20份空白牛奶样品，准确称取全脂牛奶样品10mL置于50mL的离心管中，加入PBS稀释10倍后用于电化学受体分析检测，检测后得到CV电流值，将其代入回归方程，计算出空白样品的检测值，及20份空白样品的平均检测值和标准差，根据公式Z＝C+3×SD计算Z值，此即为组织方法的检测限(LOD)，根据公式Z＝C+10×SD计算Z值，则得到检测样品的定量限(LOQ)，得到空白牛奶样品中头孢喹肟的LOD为2.46μg/L，LOQ为5.4μg/L，其标准差为0.42。
步骤3，取上述空白样品，按照药物在测得的空白组织样品中的1倍LOQ、2倍LOQ和4倍LOQ值进行添加试验，每个样品浓度设置5个平行样。对样品进行处理后采用电化学受体方法测定药物浓度，重复3批，计算回收率，并计算组内和组间变异系数(CV＝SD/MN)。
表2为受体传感器检测加标牛奶中的头孢喹肟浓度的回收率
Figure BDA0002112094500000081
Figure BDA0002112094500000091
实施例5牛奶样品中空白及加标头孢噻呋的测定
步骤1，取20份空白牛奶样品，准确称取全脂牛奶样品10mL置于50mL的离心管中，加入PBS稀释10倍后用于电化学受体分析检测，检测后得到CV电流值，将其代入回归方程，计算出空白样品的检测值，及20份空白样品的平均检测值和标准差，根据公式Z＝C+3×SD计算Z值，此即为组织方法的检测限(LOD)，根据公式Z＝C+10×SD计算Z值，则得到检测样品的定量限(LOQ)，得到空白牛奶样品中头孢噻呋的LOD为17.16μg/L，LOQ为41.45μg/L，其标准差为3.47。
步骤2，取上述空白样品，按照药物在测得的空白组织样品中的1倍LOQ、2倍LOQ和4倍LOQ值进行添加试验，每个样品浓度设置5个平行样。对样品进行处理后采用电化学方法测定药物浓度，重复3批，计算回收率，并计算组内和组间变异系数(CV＝SD/MN)。
表3为受体传感器检测加标牛奶中的头孢噻呋浓度的回收率
Figure BDA0002112094500000092
实施例6牛奶样品中空白及加标青霉素G的测定
步骤1，取20份空白牛奶样品，准确称取全脂牛奶样品10mL置于50mL的离心管中，加入PBS稀释10倍后用于电化学受体分析检测，检测后得到CV电流值，将其代入回归方程，计算出空白样品的检测值，及20份空白样品的平均检测值和标准差，根据公式Z＝C+3×SD计算Z值，此即为组织方法的检测限(LOD)，根据公式Z＝C+10×SD计算Z值，则得到检测样品的定量限(LOQ)，得到空白牛奶样品中青霉素G的LOD为0.06μg/L，LOQ为0.13μg/L，其标准差为0.01。
步骤2，取上述空白样品，按照药物在测得的空白组织样品中的1倍LOQ、2倍LOQ和4倍LOQ值进行添加试验，每个样品浓度设置5个平行样。对样品进行处理后采用电化学方法测定药物浓度，重复3批，计算回收率，并计算组内和组间变异系数(CV＝SD/MN)。
表4为受体传感器检测加标牛奶中的青霉素G浓度的回收率
Figure BDA0002112094500000101
实施例7牛奶样品中空白及加标氨苄西林的测定
步骤1，取20份空白牛奶样品，准确称取全脂牛奶样品10mL置于50mL的离心管中，加入PBS稀释10倍后用于电化学受体分析检测，检测后得到CV电流值，将其代入回归方程，计算出空白样品的检测值，及20份空白样品的平均检测值和标准差，根据公式Z＝C+3×SD计算Z值，此即为组织方法的检测限(LOD)，根据公式Z＝C+10×SD计算Z值，则得到检测样品的定量限(LOQ)，得到空白牛奶样品中氨苄西林的LOD为0.21μg/L，LOQ为0.42μg/L，其标准差为0.03。
步骤2，取上述空白样品，按照药物在测得的空白组织样品中的1倍LOQ、2倍LOQ和4倍LOQ值进行添加试验，每个样品浓度设置5个平行样。对样品进行处理后采用电化学方法测定药物浓度，重复3批，计算回收率，并计算组内和组间变异系数(CV＝SD/MN)。
表5为受体传感器检测加标牛奶中的氨苄西林浓度的回收率
Figure BDA0002112094500000111
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备石墨烯硫堇复合物；
S2：获得受体蛋白BlaR-CTD；
S3：构建受体传感器；具体步骤为将步骤S1中得到的石墨烯硫堇复合物涂至电极表面；之后将步骤S2中得到的受体蛋白BlaR-CTD滴加至修饰了石墨烯硫堇复合物的电极表面，孵育；PBS溶液冲洗干净后置于BSA溶液中孵育；再次用PBS缓冲液将电极冲洗干净即可；
S4：制备信号探针；所述信号探针为酶标记物HRP-AMP。
2.根据权利要求1所述的检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器的制备方法，其特征在于：步骤S3中所述孵育温度均为37℃。
3.根据权利要求1所述的检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器的制备方法，其特征在于：步骤S3滴加受体蛋白BlaR-CTD至电极表面后，孵育时间为1.5h。
4.根据权利要求1所述的检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器的制备方法，其特征在于：步骤S3电极在BSA溶液中孵育时间为30min。
5.一种利用权利要求1-4任一所述的制备方法制备的检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器。
6.如权利要求5所述的检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器在检测β-内酰胺类抗生素中的应用。
7.根据权利要求6所述的检测β-内酰胺类抗生素的电化学受体传感器的应用，其特征在于：所述β-内酰胺类抗生素为头孢氨苄、头孢喹肟、头孢噻呋、青霉素G、氨苄西林中任一种。
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