CN111912976A - 一种电化学阻抗生物传感器及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种电化学阻抗生物传感器，其包括表面结合CD44蛋白适配体的金电极，可以用于表达CD44肿瘤细胞的快速检测。本发明提供的传感器通过将特异性识别目标蛋白CD44的适配体固定在金电极上，表达CD44靶细胞与适配体的特异性结合引起了金电极表面阻抗值的变化，结合电化学阻抗谱来测定表达CD44肿瘤细胞的密度。本发明提供的电化学阻抗生物传感器制备方法简单，使用方法简单，响应时间快，具有良好的特异性和灵敏度，为CD44蛋白表达的检测提供了一种简便、快捷的方法。
Description
技术领域
本发明属于电化学传感器领域，具体涉及一种检测表达CD44肿瘤细胞的电化学阻抗生物传感器及其制备方法。
背景技术
CD44蛋白是一种单基因编码的跨膜糖蛋白，属于细胞黏附分子家族，近年来大量研究证明其可作为肿瘤干细胞的表面标志物，调节肿瘤干细胞的干性，与肿瘤生长、侵袭、转移和耐药相关，有研究证明CD44水平可作为肿瘤的诊断以及预后因子。因此，如何灵敏特异地检测肿瘤细胞中CD44表达具有重要的临床意义。
目前，特异性识别检测CD44蛋白的方法主要是通过基于抗原抗体识别的酶联免疫吸附法、免疫组化等方法进行检测，而抗体具有筛选制备过程繁琐，耗费昂贵和保存条件苛刻的缺点。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷，基于适配体开发了一种检测高表达CD44的电化学阻抗生物传感器。该生物传感器可以根据结合表达CD44的细胞前后阻抗值的变化进行定量分析，具有良好的选择性和灵敏度。
本发明的第一目的在于提供一种电化学阻抗生物传感器，其包括金电极；所述金电极表面结合CD44蛋白适配体。
作为本发明的优选方案，所述CD44蛋白适配体具有如SEQ1所示的核苷酸序列，具体为：
5’-GAGATTCATCACGCGCATAGTCCCAAGGCCTGCAAGGGAACCAAGGACACAGCGACTATGCGATGATGTCTTC-3’
作为本发明的优选方案，所述适配体的5’末端用巯基修饰，所述金电极表面通过金巯键共价与所述适配体结合。本发明对所述适配体的5’端进行巯基化修饰，使其可通过金巯键结合到金电极表面，捕获高表达CD44肿瘤细胞。
本发明的第二目的在于提供所述电化学阻抗生物传感器的制备方法。所述方法包括如下步骤：将所述适配体在85～95℃退火5～10min，缓慢冷却后，滴加在金电极表面，孵育。
作为本发明的优选方案，在滴加所述适配体前，金电极经过包括如下步骤的预处理：将金电极进行抛光、冲洗、干燥，然后置于H2SO4溶液中采用循环伏安法进行处理。其中，所述抛光优选采用适当直径的Al2O3粉末在麂皮上抛光打磨。所述冲洗优选先采用超纯水冲洗干净，再分别用乙醇、超纯水超声清洗。所述干燥优选采用氮气干燥。
作为本发明的优选方案，所述循环伏安法的扫描范围为-0.2V～1.6V，扫描圈数为30～60圈，扫数为0.05～0.15V/s，扫描至得到稳定的金电极的还原峰。所述H2SO4的浓度优选为0.5～1mol/L。
作为本发明的优选方案，退火时，所述适配体溶解于含有0.5～2mM DTT、浓度为10～100mM、pH值为7.4～8.0的Tris-HCl缓冲液中。将巯基化的适配体溶解于上述优选的缓冲液，尤其是特定浓度的DTT中，可以使得适配体的二硫键打开并进行活化，以便于更好地固定到金电极表面。
作为本发明的优选方案，所述适配体在所述Tris-HCl缓冲液中的浓度为0.5～10μM。
作为本发明的优选方案，所述孵育具体为：在30～45℃孵育1.5～5h，优选孵育2～3h。
本发明采用的CD44适配体是接近70个碱基的核苷酸序列，由于其空间位阻效应的影响，采用常规方法难以固定到金电极表面。本发明通过对制备过程中影响CD44适配体固定的条件和参数进行优化，具体对溶解CD44适配体的缓冲液、CD44适配体的浓度、CD44适配体固定温度以及固定时间进行全面优化，得到最优条件，获得修饰效果最佳的传感器。
本发明的第三目的在于提供具有所述核苷酸序列的CD44蛋白适配体、所述电化学阻抗生物传感器或所述方法制备而成的电化学阻抗生物传感器在检测表达CD44的肿瘤细胞中的应用，优选在检测表达CD44的肿瘤细胞密度中的应用。
作为本发明的一种具体实施方式，所述表达CD44的肿瘤细胞为A549细胞。
本发明的第四目的在于提供一种检测表达CD44的肿瘤细胞密度的方法，该方法包括如下步骤：
(1)以已知表达CD44的肿瘤细胞为标准品；取细胞密度不同的多份标准品，分别滴加在所述电化学阻抗生物传感器表面，测定电化学阻抗值，孵育后，再次测定电化学阻抗值，求出孵育后电化学阻抗值相对于孵育前增加的百分比；以细胞密度以及相应的电化学阻抗值增加百分比分别为横、纵坐标，构建标准曲线；
(2)将待测样品滴加在所述电化学阻抗生物传感器表面，采用与步骤(1)相同的方法孵育测定；将待测样品的电化学阻抗值增加百分比带入所述标准曲线中，得到待测样品的细胞密度。
本发明提供的传感器直接测定传感器(金电极)和高表达CD44肿瘤细胞的结合，通过电化学阻抗谱直接进行表征，将两者的结合直接转换为可读的阻抗值的变化，测定方法操作简单方便，测定时间快。
作为本发明的优选方案，所述标准品应先收集在离心管中，用PBS重悬细胞离心收集细胞沉淀，PBS洗涤多次，最后用适量的PBS重悬细胞，进行细胞计数。
作为本发明的优选方案，所述标准品的细胞密度在10～104个/ml的范围内。所述标准品的个数优选为4～5个，或以上。
作为本发明的优选方案，在步骤(1)或步骤(2)所述孵育是指在30～45℃孵育1.5～5h，优选孵育2～3h。本发明对肿瘤细胞在电极表面孵育温度和时间进行了优选，可以控制肿瘤细胞和电极适配体在上述条件下实现最佳的结合。
作为本发明的优选方案，在步骤(1)或步骤(2)的孵育后，应用Tris-HCl溶液清洗电极，以去除未固定在电极表面的CD44，避免其对测定结果造成干扰。
本发明提供的方法是通过测定孵育前后电极的电化学阻抗谱，然后转化得到的可读电化学阻抗值。
作为本发明的优选方案，所述测定电化学阻抗谱，采用三电极系统，工作电极为金盘电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极。
作为本发明的优选方案，所述测定电化学阻抗谱，在含有KCl的铁氰化钾或亚铁氰化钾溶液中进行。优选地，所述铁氰化钾或亚铁氰化钾溶液的浓度为1.0～5.0mM，其中含有KCl的浓度为0.05～0.15M。
作为本发明的优选方案，所述测定电化学阻抗谱，采用频率范围0.1～105Hz、振幅为2～8mV的正弦电压进行。优选静止时间为1～3s。
与现有技术相比，本发明的电化学传感器是基于适配体通过金巯键结合在金电极表面构建的。本发明提供的传感器利用了电化学阻抗谱的检测，免于信标分子的修饰，构建的传感器制备、操作简便，响应时间快，具有良好的特异性和灵敏度。
附图说明
图1为实施例2所述的电化学阻抗生物传感器构建过程的循环伏安表征。
图2为实施例3所述电化学阻抗生物传感器阻抗变化随CD44浓度变化的阻抗图谱。
图3为实施例3所述电化学阻抗生物传感器检测CD44浓度的标准曲线。
图4为实施例4中密度为1000个/ml的293T细胞和A549细胞与传感器共同孵育得到的电化学阻抗图谱。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种电化学阻抗生物传感器，其包括金电极；所述金电极表面通过金巯键共价结合了具有如SEQ1所示的核苷酸序列的CD44蛋白适配体。
实施例2
本实施例提供了实施例1所述电化学阻抗生物传感器的制备方法，具体为：
(i)取金电极，依次利用直径为3μm、0.5μm、0.05μm的Al2O3粉末在麂皮上抛光打磨，并用超纯水冲洗干净，接着分别用乙醇、超纯水超声各清洗1min，氮气干燥；然后将金电极置于0.5M的H2SO4溶液中采用循环伏安法进行处理，扫描范围为-0.2V～1.6V，扫描圈数为30圈，扫数为0.1V/s，直到得到稳定的金电极的还原峰；
(ii)将所述适配体以浓度2μM溶解在含1mM DTT、浓度为10mM、pH 7.9的Tris-HCl缓冲液中，90℃高温退火10min，慢慢冷却至室温，取10μL滴加在经步骤(1)处理后的金电极表面，37℃密闭放置3.0h，即得。
其中，步骤(1)所述循环伏安法进行处理的表征图像如图1所示。
实施例3
本实施例提供了一种利用实施例1所述电化学阻抗生物传感器检测表达CD44的肿瘤细胞密度的方法。
该方法的标准品采用如下方法获得：将A549肺癌细胞在含10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液培养，在37℃、含5％CO2的恒温培养箱中孵育，用无菌细胞刮子将A549细胞从培养瓶底刮下收集在离心管中，用PBS重悬细胞离心收集细胞沉淀，PBS洗涤3次，最后用适量的PBS重悬细胞，进行细胞计数，得到标准品。
该方法采用的电化学阻抗谱的测定是在上海辰华电化学工作站CHI660A上进行，所用为三电极系统，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为银/氯化银电极。阻抗谱测定是在含5.0mM[(FeCN)6]3-/4-的0.1M的KCL溶液中进行，频率范围0.1-10.04Hz，振幅为5.0mV的正弦电压，静止时间为2.0s。
所述检测表达CD44的肿瘤细胞密度的方法具体为：
(1)取5组适量的已知不同密度的标准品溶液，分别滴加在金电极(即电化学阻抗生物传感器)表面，检测电化学阻抗值，在37℃下孵育2.5h然后用Tris-HCl缓冲液清洗电极，再检测电化学阻抗值，求出孵育后电化学阻抗值相对于孵育前增加的百分比；以细胞密度和相应的电化学阻抗值增加百分比分别为横、纵坐标，构建标准曲线(如图3所示)；
(2)将10μL待测样品滴加在金电极(即电化学阻抗生物传感器)表面，采用与步骤(1)相同的方法孵育测定；将待测样品的电化学阻抗值增加百分比带入所述标准曲线中，得到待测样品的细胞密度。
本发明通过大量实践发现，应用本发明提供的电化学阻抗生物传感器进行电化学阻抗检测，细胞样品孵育前后电化学阻抗的变化与表达CD44的A549细胞密度成正比。图2为电化学阻抗生物传感器阻抗变化随CD44浓度变化的阻抗图谱，图3是以细胞密度和相应的电化学阻抗值增加百分比分别为横、纵坐标，构建得到的标准曲线。
实施例4
本实施例对实施例2所述电化学阻抗生物传感器检测的选择性进行考察，具体考察了对高表达CD44的A549肺癌细胞和低表达CD44的293T人肾上皮细胞的选择性。结果如图4所示，与对照组相比，A549细胞组电化学阻抗显著增大，而293T细胞组电化学阻抗无明显变化。
标准品采用如下方法获得：分别将A549肺癌细胞和293T人肾上皮细胞系在含10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液培养，在37℃、含5％CO2的恒温培养箱中孵育，用无菌细胞刮子将细胞从培养瓶底刮下收集在离心管中，用PBS重悬细胞离心收集细胞沉淀，PBS洗涤3次，最后用适量的PBS重悬细胞，进行细胞计数，得到标准品。
该方法采用的电化学阻抗谱的测定是在上海辰华电化学工作站CHI660A上进行，所用为三电极系统，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为银/氯化银电极。阻抗谱测定是在含5.0mM[(FeCN)6]3-/4-的0.1M的KCL溶液中进行，频率范围0.1-10.04Hz，振幅为5.0mV的正弦电压，静止时间为2.0s。
所述电化学阻抗生物传感器检测选择性考察具体为：分别取密度为1000个/ml的A549肺癌细胞和293T人肾上皮细胞系溶液，分别滴加在金电极(即电化学阻抗生物传感器)表面，在37℃下孵育2.5h然后用Tris-HCl缓冲液清洗电极，检测电化学阻抗谱。
本发明通过实验发现，应用本发明提供的电化学阻抗生物传感器进行电化学阻抗谱检测，高表达CD44的A549细胞样品孵育后电化学阻抗远大于低表达CD44的293T细胞，证明了传感器良好的选择性，结果如图4所示。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种电化学阻抗生物传感器，其特征在于，包括金电极；所述金电极表面结合CD44蛋白适配体；
优选地，所述金电极表面通过金巯键共价结合所述适配体。
2.根据权利要求1所述的电化学阻抗生物传感器，其特征在于，所述CD44蛋白适配体具有如SEQ1所示的核苷酸序列；优选地，所述适配体的5’末端用巯基修饰。
3.权利要求1或2所述电化学阻抗生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述适配体在85～95℃退火5～10min，缓慢冷却后，滴加在金电极表面，孵育。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在滴加所述适配体前，金电极经过包括如下步骤的预处理：将金电极进行抛光、冲洗、干燥，然后置于H2SO4溶液中采用循环伏安法进行处理；
优选的，所述循环伏安法的扫描范围为-0.2V～1.6V，扫描圈数为30～60圈，扫数为0.05～0.15V/s，扫描至得到稳定的金电极的还原峰。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，退火时，所述适配体溶解于含有0.5～2mM DTT、浓度为10～100mM、pH值为7.4～8.0的Tris-HCl缓冲液中；
优选的，所述适配体在所述Tris-HCl缓冲液中的浓度为0.5～10μM。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述孵育具体为：在30～45℃孵育1.5～5h，优选孵育2～3h。
7.具有如SEQ1所示核苷酸序列的CD44蛋白适配体、权利要求1或2所述电化学阻抗生物传感器、权利要求3～6任意一项所述方法制备而成的电化学阻抗生物传感器在检测表达CD44的肿瘤细胞中的应用，优选在检测表达CD44的肿瘤细胞密度中的应用。
8.一种检测表达CD44的肿瘤细胞密度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以已知表达CD44的肿瘤细胞为标准品；取细胞密度不同的多份标准品，分别滴加在所述电化学阻抗生物传感器表面，测定电化学阻抗值，孵育后，再次测定电化学阻抗值，求出孵育后电化学阻抗值相对于孵育前增加的百分比；以细胞密度以及相应的电化学阻抗增加百分比分别为横、纵坐标，构建标准曲线；
(2)将待测样品滴加在所述电化学阻抗生物传感器表面，采用与步骤(1)相同的方法孵育测定；将待测样品的电化学阻抗值增加百分比带入所述标准曲线中，得到待测样品的细胞密度；
所述电化学阻抗值是通过测定电化学阻抗谱后转化得到。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述标准品的细胞密度在10～104个/ml的范围内。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述测定电化学阻抗谱，采用三电极系统，工作电极为金盘电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极；
优选地，所述测定电化学阻抗谱，在含有KCl的铁氰化钾或亚铁氰化钾溶液中，采用频率范围0.1～105Hz、振幅为2～8mV的正弦电压进行。
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