CN109342526A - 一种电化学适体传感器检测黄曲霉毒素b1的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于β‑环糊精主客体作用的电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1(AFB1)的方法，包括以下步骤：1)黄曲霉毒素B1特异性响应的双链DNA(Fc‑dsDNA)的制备；2)AFB1与Fc‑dsDNA之间的特异性反应；3)将上述Fc‑dsDNA与AFB1的反应液滴加在BSA/pβ‑CD/AuNPs/GC电极上，并利用示差脉冲(DPV)和交流阻抗(AC impedance)对反应体系进行检测；4)利用扫描电子显微镜对不同的电极修饰面进行表征。本发明先通过AFB1与适体之间的特异性识别使Fc‑cDNA从Fc‑dsDNA中脱离，然后利用β‑环糊精的主客体相互作用和尺寸效应对释放的单链DNA(Fc‑ssDNA)进行包覆形成络合物修饰在电极表面，从而引起玻碳电极表面电化学信号的变化。本发明具有运行成本低、检测快速、简便、敏感高、选择性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于β-环糊精主客体作用的电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1的技术,属于生物传感技术领域。
背景技术
传统的AFB1检测的主要方法有酶联免疫吸附法、荧光、化学发光、HPLC–MS/MS等。色谱法具备良好的灵敏度和准确性，但是需要昂贵的仪器和专业的操作人员，在大量实际样品检测方面存在较多限制条件，而且该方法不适合高通量样品分析和现场检测。这些方法严重限制了它们的实际应用。电化学法不仅价格便宜，不需要复杂的仪器设备，而且测量简便、快速，在相同条件下可以检测出更低含量的待测物，因而得到了较快的发展。
发明内容
技术问题：本发明的目的是提供一种基于β-环糊精主客体作用的电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法。本发明不需要借助昂贵精密仪器检测，简化了检测方法，极大地降低了AFB1检测成本，具有运行成本低、检测快速、简便、敏感高、选择性好等优点。
技术方案：本发明先通过AFB1与适体之间的特异性识别使Fc-cDNA从Fc-dsDNA中脱离，然后利用β-环糊精的主客体相互作用和尺寸效应对释放的单链DNA(Fc-ssDNA)进行包覆形成络合物修饰在电极表面，从而引起玻碳电极表面电化学信号的变化。AFB1的加入量越多，释放的Fc-cDNA越多，电极上吸附的电信号分子Fc-ssDNA越多，电化学信号越强，以此实现AFB1的定量检测。
本发明电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法包括以下步骤：
1)制备黄曲霉毒素B1特异性响应的双链DNA即Fc-dsDNA；
2)AFB1与Fc-dsDNA之间的特异性反应；
3)将上述Fc-dsDNA与AFB1的反应液滴加在BSA/pβ-CD/AuNPs/GC电极上，并利用示差脉冲DPV和交流阻抗AC impedance对反应体系进行检测；
4)利用扫描电子显微镜对不同的电极修饰面进行表征。
其中，
所述步骤1)黄曲霉毒素B1特异性响应的双链DNA选取两条特定序列的单链DNA即Fc-ssDNA和Fc-cDNA，在DNA杂交缓冲溶液中95-100℃水浴后冷却至室温，形成杂交的Fc-dsDNA，随后加入的AFB1夺取双链上的Fc-cDNA，释放Fc-ssDNA。
所述DNA杂交缓冲溶液为:10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 7.2～7.4。
所述步骤2)AFB1与Fc-dsDNA之间特异性反应的具体步骤如下：取一小离心管，先用反应缓冲溶液将AFB1配置成不同浓度，然后与等量的Fc-dsDNA溶液在35～40℃水浴中反应1-1.5小时。
所述形成杂交的Fc-dsDNA，浓度为3～6μM。
所述反应缓冲溶液为：0.1M PB，0.1M KCl，pH 7.2～7.4。
步骤3)Fc-dsDNA与AFB1的反应液滴加在BSA/pβ-CD/AuNPs/GCE上的具体步骤如下：
取最终反应液即是Fc-dsDNA与AFB1反应之后得到的溶液10μL小心滴加在BSA/pβ-CD/AuNPs/GC电极表面，室温下反应60-120分钟。
步骤4)扫描电子显微镜对玻碳电极不同修饰层的表征的具体步骤如下：取三个玻碳块，在其表面进行逐一的修饰GCE，AuNPs/GC，pβ-CD/AuNPs/GCE，室温下放置，过夜自然晾干，进行扫描电子显微镜检测。
有益效果：本发明原理简单、实验周期短、所用原料成本较低，无需任何大型仪器，在相同条件下可以检测出更低含量的待测物。主要利用AFB1与适体之间的特异性识别以及β-环糊精的主客体相互作用和尺寸效应对释放的单链DNA(Fc-ssDNA)进行包覆形成络合物修饰在电极表面，从而引起玻碳电极表面电化学信号的变化。AFB1的加入量越多，释放的Fc-cDNA越多，电极上吸附的电信号分子Fc-ssDNA越多，电化学信号越强。本发明不需要借助昂贵精密仪器检测，简化了检测方法，极大地降低了AFB1检测成本，本发明具有运行成本低、检测快速、简便、敏感高、选择性好等优点。
附图说明
图1显示了BSA/pβ-CD/AuNPs/GC电极的制备过程；
图2显示了基于β-环糊精主客体作用的电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1(AFB1)的流程图；
图3A显示了二茂铁的分子结构模型图；图3B显示了β-环糊精的分子结构模型图；图3C显示了有无AFB1存在下电化学信号的变化；
图4显示了玻碳电极上不同层次修饰面的扫描电子显微镜(SEM)图像。图4A是GC电极表面的SEM图片；图4B是AuNPs/GC电极表面的SEM图片；图4C是pβ-CD/AuNPs/GC电极表面的SEM图片；
图5显示了示差脉冲法定量检测AFB1的电化学变化图。A：在不同量的AFB1作用下，得到的DPV谱图；B：峰电流值与AFB1浓度值对数的拟合曲线；
图6显示了交流阻抗法定量检测AFB1的电化学变化图。A：在不同量的AFB1作用下，得到的AC impedance谱图；B：峰电流值与阻抗图半圆直径的拟合曲线；
具体实施方式
根据权利要求所包含的内容举例说明
实施例1：
基于β-环糊精主客体作用的电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1(AFB1)的分析方法，检测步骤是：
黄曲霉毒素B1特异性响应的双链DNA(Fc-dsDNA)的制备：选取两条浓度均为25μM的特定序列的单链DNA(Fc-ssDNA，Fc-cDNA)各5μL，95℃与20μL杂交缓冲溶液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 7.4)水浴5分钟后冷却至室温，随后加入的AFB1夺取双链上的Fc-cDNA，释放出Fc-ssDNA。
β-环糊精修饰的玻碳电极(BSA/pβ-CD/AuNPs/GCE)的制备：首先对玻碳电极进行预先处理，然后浸泡在2％的HAuCl4溶液中，在-0.2V的恒电位下进行60秒的金纳米粒子的电化学沉积，得到的电极用超纯水清洗并自然干燥，得到AuNPs/GC电极；接着继续将电极浸泡在0.04Mβ-CD/1M HClO4溶液中，并在氮气氛围下扫循环伏安进行电化学聚合β-环糊精，参数设置为0-1.3V，扫描速度为100mV/s，扫描圈数为30圈，得到pβ-CD/AuNPs/GC电极。为了避免非特异性吸附，最后将电极浸泡在1％的BSA溶液中60分钟(37℃),得到最终的BSA/pβ-CD/AuNPs/GC电极。
BSA/pβ-CD/AuNPs/GCE和Fc-cDNA作用的具体步骤：取一小离心管，先用反应缓冲溶液(0.1M PB，0.1M KCl，pH 7.4)将AFB1配置成浓度为10pg/mL、体积为60μL的溶液，然后与上述制得的30μL的Fc-dsDNA溶液在37℃水浴中反应1小时。
AFB1活性检测：将上述反应制备得到的溶液取10μL滴加在BSA/pβ-CD/AuNPs/GC电极表面，室温反应90分钟，随后浸泡在0.1M PB，0.1M KCl，pH 7.4的电解液中进行DPV测量(脉冲设置为0.05V)，实验结果如图5显示，AFB1在1pg/mL-10ng/mL呈现良好的线性范围，检测限是0.511pg/mL；另外该反应后的电极浸泡在5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]，0.1M KCl的溶液中进行交流阻抗测定，阻抗测定参数设置为0.1Hz～100kHz，振幅为5mV。实验结果如图6显示，AFB1在0.1pg/mL-10ng/mL呈现良好的线性范围，检测限是0.0491pg/mL。
实施例2：
基于β-环糊精主客体作用的电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1(AFB1)的分析方法，检测步骤是：
黄曲霉毒素B1特异性响应的双链DNA(Fc-dsDNA)的制备：选取两条浓度均为25μM的特定序列的单链DNA(Fc-ssDNA，Fc-cDNA)各5μL，95℃与20μL杂交缓冲溶液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 7.4)水浴5分钟后冷却至室温，随后加入的AFB1夺取双链上的Fc-cDNA，释放出Fc-ssDNA。
β-环糊精修饰的玻碳电极(BSA/pβ-CD/AuNPs/GCE)的制备：首先对玻碳电极进行预先处理，然后浸泡在2％的HAuCl4溶液中，在-0.2V的恒电位下进行60秒的金纳米粒子的电化学沉积，得到的电极用超纯水清洗并自然干燥，得到AuNPs/GC电极；接着继续将电极浸泡在0.04Mβ-CD/1M HClO4溶液中，并在氮气氛围下扫循环伏安进行电化学聚合β-环糊精，参数设置为0-1.3V，扫描速度为100mV/s，扫描圈数为30圈，得到pβ-CD/AuNPs/GC电极。为了避免非特异性吸附，最后将电极浸泡在1％的BSA溶液中60分钟(37℃),得到最终的BSA/pβ-CD/AuNPs/GC电极。
BSA/pβ-CD/AuNPs/GCE和Fc-cDNA作用的具体步骤：取一小离心管，先用反应缓冲溶液(0.1M PB，0.1M KCl，pH 7.4)将AFB1配置成浓度为100pg/mL、体积为60μL的溶液，然后与上述制得的30μL的Fc-dsDNA溶液在37℃水浴中反应1小时。
AFB1活性检测：将上述反应制备得到的溶液取10μL滴加在BSA/pβ-CD/AuNPs/GC电极表面，室温反应90分钟，随后浸泡在0.1M PB，0.1M KCl，pH 7.4的电解液中进行DPV测量(脉冲设置为0.05V)，实验结果如图5显示，AFB1在1pg/mL-10ng/mL呈现良好的线性范围，检测限是0.511pg/mL；另外该反应后的电极浸泡在5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]，0.1M KCl的溶液中进行交流阻抗测定，阻抗测定参数设置为0.1Hz～100kHz，振幅为5mV。实验结果如图6显示，AFB1在0.1pg/mL-10ng/mL呈现良好的线性范围，检测限是0.0491pg/mL。
实施例3：
基于β-环糊精主客体作用的电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1(AFB1)的分析方法，检测步骤是：
黄曲霉毒素B1特异性响应的双链DNA(Fc-dsDNA)的制备：选取两条浓度均为25μM的特定序列的单链DNA(Fc-ssDNA，Fc-cDNA)各5μL，95℃与20μL杂交缓冲溶液(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 7.4)水浴5分钟后冷却至室温，随后加入的AFB1夺取双链上的Fc-cDNA，释放出Fc-ssDNA。
β-环糊精修饰的玻碳电极(BSA/pβ-CD/AuNPs/GCE)的制备：首先对玻碳电极进行预先处理，然后浸泡在2％的HAuCl4溶液中，在-0.2V的恒电位下进行60秒的金纳米粒子的电化学沉积，得到的电极用超纯水清洗并自然干燥，得到AuNPs/GC电极；接着继续将电极浸泡在0.04Mβ-CD/1M HClO4溶液中，并在氮气氛围下扫循环伏安进行电化学聚合β-环糊精，参数设置为0-1.3V，扫描速度为100mV/s，扫描圈数为30圈，得到pβ-CD/AuNPs/GC电极。为了避免非特异性吸附，最后将电极浸泡在1％的BSA溶液中60分钟(37℃),得到最终的BSA/pβ-CD/AuNPs/GC电极。
BSA/pβ-CD/AuNPs/GCE和Fc-cDNA作用的具体步骤：取一小离心管，先用反应缓冲溶液(0.1M PB，0.1M KCl，pH 7.4)将AFB1配置成浓度为1ng/mL、体积为60μL的溶液，然后与上述制得的30μL的Fc-dsDNA溶液在37℃水浴中反应1小时。
AFB1活性检测：将上述反应制备得到的溶液取10μL滴加在BSA/pβ-CD/AuNPs/GC电极表面，室温反应90分钟，随后浸泡在0.1M PB，0.1M KCl，pH 7.4的电解液中进行DPV测量(脉冲设置为0.05V)，实验结果如图5显示，AFB1在1pg/mL-10ng/mL呈现良好的线性范围，检测限是0.511pg/mL；另外该反应后的电极浸泡在5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]，0.1M KCl的溶液中进行交流阻抗测定，阻抗测定参数设置为0.1Hz～100kHz，振幅为5mV。实验结果如图6显示，AFB1在0.1pg/mL-10ng/mL呈现良好的线性范围，检测限是0.0491pg/mL。
图3A显示了二茂铁的分子结构模型图和具体尺寸：图3B显示了β-环糊精的分子结构模型图和具体尺寸；图3C显示了a线：没有AFB1存在下电化学信号的大小，可以看出几乎没有Fc-ssDNA进入电极表面；b线：100nMAFB1存在下，DPV图中的电流值明显变大，表明AFB1与Fc-cDNA发生特异性集合，使得释放的Fc-ssDNA进入β-环糊精腔内，引起电流信号的升高。说明可以通过该电化学适体传感器检测AFB1。
图4显示了玻碳电极上不同层次修饰面的扫描电子显微镜图像，标尺分别为2微米，10微米，10微米；图4A是未修饰的裸玻碳电极，可以看出电极上没有修饰物；图4B是电沉积金纳米粒子后的电极表面扫描电镜图片：从图中可以看出在玻碳电极表面确实修饰了一层均匀的金纳米粒子；图4C进一步在电极表面修饰了β-环糊精：从图中可以看出金纳米粒子层被β-环糊精几乎掩盖。说明玻碳电极上成功修饰了金纳米粒子和β-环糊精。
图5显示了定量检测AFB1的DPV变化图。A：在不同量的AFB1作用下，得到的DPV谱图；B：电流信号响应值与AFB1浓度对数值的拟合曲线；从图中可以看出AFB1在1pg/mL-10ng/mL呈良好的线性关系。
图6显示了定量检测AFB1的AC impedance变化图。A：在不同量的AFB1作用下，得到的AC impedance谱图；B：半圆的直径与AFB1浓度对数值的拟合曲线；从图中可以看出AFB1在0.1pg/mL-10ng/mL呈良好的线性关系。
Claims (8)
1.一种电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)制备黄曲霉毒素B1特异性响应的双链DNA即Fc-dsDNA；
2)AFB1与Fc-dsDNA之间的特异性反应；
3)将上述Fc-dsDNA与AFB1的反应液滴加在BSA/pβ-CD/AuNPs/GC电极上，并利用示差脉冲DPV和交流阻抗AC impedance对反应体系进行检测；
4)利用扫描电子显微镜对不同的电极修饰面进行表征。
2.根据权利要求1所述的电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述步骤1)黄曲霉毒素B1特异性响应的双链DNA选取两条特定序列的单链DNA即Fc-ssDNA和Fc-cDNA，在DNA杂交缓冲溶液中95-100℃水浴后冷却至室温，形成杂交的Fc-dsDNA，随后加入的AFB1夺取双链上的Fc-cDNA，释放Fc-ssDNA。
3.根据权利要求2所述的电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述DNA杂交缓冲溶液为:10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 7.2～7.4。
4.根据权利要求1所述的电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述步骤2)AFB1与Fc-dsDNA之间特异性反应的具体步骤如下：取一小离心管，先用反应缓冲溶液将AFB1配置成不同浓度，然后与等量的Fc-dsDNA溶液在35～40℃水浴中反应1-1.5小时。
5.根据权利要求2所述的电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述形成杂交的Fc-dsDNA，浓度为3～6μM。
6.根据权利要求4所述的电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述反应缓冲溶液为：0.1M PB，0.1M KCl，pH 7.2～7.4。
7.根据权利要求1所述的电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，步骤3)Fc-dsDNA与AFB1的反应液滴加在BSA/pβ-CD/AuNPs/GCE上的具体步骤如下：
取最终反应液即是Fc-dsDNA与AFB1反应之后得到的溶液10μL小心滴加在BSA/pβ-CD/AuNPs/GC电极表面，室温下反应60-120分钟。
8.根据权利要求1所述的电化学适体传感器检测黄曲霉毒素B1的方法，步骤4)扫描电子显微镜对玻碳电极不同修饰层的表征的具体步骤如下：取三个玻碳块，在其表面进行逐一的修饰GCE，AuNPs/GC，pβ-CD/AuNPs/GCE，室温下放置，过夜自然晾干，进行扫描电子显微镜检测。
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