CN113355388A - 一种基于核酸外切酶ⅲ辅助信号放大的免疫吸附检测氯霉素的方法 - Google Patents
一种基于核酸外切酶ⅲ辅助信号放大的免疫吸附检测氯霉素的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大的免疫吸附检测氯霉素的方法,属于分子生物学检测技术领域。本发明以纳米金为载体,合成DNA‑抗体检测探针,抗体用于捕获目标物,DNA用于放大信号;黑色96微孔板经抗原包板、封闭、洗涤后,加入检测探针,包被抗原与标准品竞争结合检测探针上的抗体;洗去多余探针及与目标物结合的探针,加入信号DNA及ExoⅢ,与检测探针上的Trigger DNA完成信号放大步骤。本方法对氯霉素的检测限为0.001ng/L,线性范围为0.01‑5ng/L,与链霉素、庆大霉素、卡那霉素等无交叉反应。本发明灵敏度高,可操作性强,能够很好的应用在抗生素检测领域。
Description
技术领域
本发明公开了一种基于核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大的免疫吸附检测氯霉素的方法,属于分子生物学检测技术领域。
背景技术
在传统的免疫测定中,由于标记物产生的可检测信号低,限制了免疫法的检测灵敏度。另外,标记物与抗体的结合率低也导致了较低的灵敏度,不能满足低浓度靶标的检测。尽管仪器分析方法(例如色谱法和质谱法)可以提高检测灵敏度,但它们不像免疫测定法那样方便和简单。因此,在免疫分析的基础上应用新技术提高检测灵敏度是值得研究的方向。
采用核酸信号放大技术的分子测定是最灵敏的检测方法之一。免疫分析和核酸信号放大相结合可以达到协同作用,不仅可以保留免疫分析法的简便性,而且可以通过DNA扩增技术提高方法的灵敏度。免疫-PCR是最早的免疫-核酸策略(I-NAA)。由于PCR需要可变的温度过程和较高的专业要求,限制了其在生物活性物质的检测的应用。等温核酸信号放大技术由于条件温和,扩增效率高,已逐渐用于免疫测定中。由于环介导的等温扩增(LAMP)和滚环扩增(RCA)的反应体系复杂,而且无酶等温信号放大方法,例如杂交链反应(HCR)的效率有待提高。因此,有必要将更简单,更有效的等温核酸信号放大方法应用于免疫测定。
氯霉素(CAP)作为一种低成本且具有出色抗菌性能的广谱抗生素,已被广泛用于治疗奶牛的乳腺炎。但是,CAP对造血系统有严重的不良反应,可通过抑制骨髓的造血功能而导致再生障碍性贫血。许多国家标准规定,不得在动物性食品中检测到CAP。因此,高灵敏检测CAP对防止食品中残留过量具有重要意义。
发明内容
[技术问题]
解决传统免疫法的低灵敏度问题,提供一种氯霉素高灵敏检测的便捷方法。
[技术方案]
一种制备用于检测氯霉素的探针的方法,所述方法包括如下过程:
(1)合成纳米金颗粒AuNP:将HAuCl4分散在水中配制成溶液,加热至沸腾,然后加入柠檬酸三钠,混匀反应,反应结束后,得到有橘红色溶液体系,即为纳米金颗粒分散液;
(2)调节纳米金颗粒分散液的pH至8.5-9.0,加入氯霉素单克隆抗体进行孵育,孵育结束后,获得含有抗体修饰的纳米金颗粒的分散液;记作AuNP-抗体分散液;
(3)将活化后的巯基修饰的Trigger DNA、PEG20000、PBS加入到所得AuNP-抗体分散液中,混匀反应,获得AuNP-抗体-DNA分散液;
(4)在所得AuNP-抗体-DNA分散液中加入BSA进行孵育,孵育结束后,固液分离,得到探针。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(1)中,HAuCl4分散在水中配制成0.01V%HAuCl4溶液。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(1)中,柠檬酸三钠配制成1wt%的水溶液进行添加。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(1)中,1wt%的柠檬酸三钠溶液与0.01V%HAuCl4溶液的体积比为2.5mL:100mL。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(1)中,混匀反应的时间为15-20min。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(1)中,所得纳米金颗粒的粒径为15nm,置于4℃避光保存。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(2)中,pH具体可调至8.5。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(2)中,每1mL纳米金颗粒分散液中加入18μg氯霉素单克隆抗体。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(2)中,孵育的时间为1h。
在本发明的一种实施方式中,所述有巯基修饰的Trigger DNA的序列为:5’-GTTTTTAGGGATGTTACGTACGACTTATTTTTTTTTTTT-SH-3’。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(3)中,活化是指利用TCEP活化有巯基修饰的DNA。其中,TCEP与巯基修饰的DNA的摩尔比为100:1。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(3)中,活化后,再经Zeba脱盐柱脱盐。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(3)中,PEG20000制成30%的水溶液进行添加;添加至使溶液中PEG20000的终浓度为1%。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(3)中,加入0.1M的PBS;添加至使溶液中的PBS浓度为0.01M。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(3)中,混匀反应包括:先混匀反应5min然后4℃盐老化2h。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(4)中,BSA的浓度为10wt%;添加至使溶液中BSA的终浓度为1%。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(4)中,孵育的温度为室温,时间为40min。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(4)中,固液分离是通过在13000rpm离心10-20min。
在本发明的一种实施方式中,将步骤(4)所得的探针分散于200μL 0.01M PBS中(含1%PEG20000和1%BSA,pH=7.4),4℃避光保存,一周内使用完。
在本发明的一种实施方式中,所述制备方法具体包括如下步骤:
(1)首先合成15nm的纳米金颗粒(AuNP):取100mL 0.01%HAuCl4加入250mL烧杯中,加热至沸腾;搅拌下快速加入2.5mL 1%的柠檬酸三钠;继续搅拌15-20min,直至颜色变为橘红色;温度调0,转速调低,冷却后,获得含有AuNP的分散液,4℃避光保存。
(2)取1mL含有15nm AuNP的分散液,用K2CO3调节pH至8.5,加入18μg氯霉素单克隆抗体,室温孵育1h,形成含AuNP-抗体的分散液。
(3)巯基修饰的DNA经TCEP活化后(摩尔比1:100),Zeba脱盐柱脱盐,与30%PEG20000、0.1M PBS一同加入含AuNP-抗体的分散液中,持续混匀5min后,4℃盐老化2h,形成含有抗体-DNA的分散液。
(4)加入10%BSA,室温孵育40min,13000rpm离心15min,最终合成的探针分散于200μL 0.01M PBS中(含1%PEG20000和1%BSA,pH=7.4),4℃避光保存,一周内使用完。
本发明基于上述方法制备得到了一种检测氯霉素的探针。
本发明还提供了一种检测氯霉素含量的方法,所述方法包括如下过程:
96孔黑色微孔板经氯霉素包被抗原(CAP-BSA)包板,BSA封闭后,获得氯霉素包被抗原(CAP-BSA)包板的96孔黑色微孔板;将所得探针利用缓冲液进行稀释,配制成探针分散液;然后将一系列已知浓度的CAP样品和上述探针分散液混合加入到CAP-BSA包板的96孔中,孵育进行竞争反应(此时CAP样品与包被抗原竞争与探针结合),结束后,清洗96孔黑色微孔板,洗去未结合的探针以及与样品结合的探针后,剩余酶标板上的与包被抗原结合的探针;然后加入信号DNA和ExoⅢ,混匀反应,形成检测样液;将检测获得检测样液于489/517nm处的荧光强度信号,利用浓度与相应的荧光强度构建线性关系,即得检测模型。
在本发明的一种实施方式中,所述信号DNA的序列为:5’-BHQ-GGGATGTCGTACGTAACATCCC/i6FAMdT/AAAAAC-3’。
在本发明的一种实施方式中,所述探针分散液是指将利用每1mL上述AuNP的分散液制得的探针重悬于200μL缓冲液中。
本发明的一种实施方式中,所述稀释时利用80倍的缓冲液进行稀释,然后用于检测。
在本发明的一种实施方式中,缓冲液为0.01M PBS,1%PEG 20000、1%BSA。
在本发明的一种实施方式中,信号DNA在检测样液的浓度为0.3μM。
在本发明的一种实施方式中,ExoⅢ是相对信号DNA和Trigger DNA的杂交体进行添加,在检测样液中的浓度为0.3U/μL。
在本发明的一种实施方式中,氯霉素包被抗原是相对探针上的抗体进行添加,在检测样液的浓度为0.6μg/mL。
在本发明的一种实施方式中,所述检测方法具体包括如下过程:
在96黑色微孔板中加入100μL 0.6μg/mL的氯霉素包被抗原(CAP-BSA),37℃孵育2h,PBST洗涤三次;加入2%BSA,37℃封闭1h,PBST洗涤3次;加入50μL CAP标准品和DNA-抗体探针,37℃竞争1h,PBST洗涤3次;加入0.3μM信号DNA,30U ExoⅢ,37℃反应3h,于489/517nm检测荧光强度信号。
有益效果:
本发明建立用于氯霉素定量检测的核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大的免疫吸附分析方法,对氯霉素的检测限为0.001ng/L,线性范围为0.01-5ng/L,对氯霉素具有高选择性。
附图说明
图1本发明原理示意图。
图2(a)合成的15nm AuNP的TEM图;(b)AuNP和DNA-抗体紫外图。
图3实施例4中Trigger DNA的序列筛选结果比对图。
图4为EAIA效果图,在溶液中验证信号放大效果。
图5为核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大的免疫吸附分析效果验证图,比较0、5、50ng/LCAP的检测信号,验证方案可行性
图6为实施例4中信号DNA浓度优化比对图;设置0.1、0.3、0.5μM三种浓度,CAP浓度为0、5ng/L,通过抑制率比较效果。
图7为ExoⅢ浓度优化比对图;设置30U、40U、50U三种浓度,CAP浓度为0、5ng/L,通过抑制率比较效果。
图8为检测的标准曲线图,浓度设置为0,0.01,0.05,0.1,0.5,1,5ng/L。
图9为方案选择性验证,以链霉素、庆大霉素、卡那霉素和甲砜霉素为参照对象。
具体实施方式
试剂和材料:CAP的标准品购自振翔科技有限公司(中国北京)。柠檬酸三钠,吐温20,牛白蛋白(BSA)和聚乙二醇20000(PEG 20000)购自国药集团化学试剂有限公司(中国上海)。TCEP购自伊诺凯科技有限公司(中国北京)。ZebaTM脱盐旋转柱和ExoⅢ购自赛默飞(美国)。单克隆抗体购自Gene Tex(美国)。CAP-BSA购自奥斯特科技有限责任公司(中国南宁)。
包被缓冲液(0.05M CBS,pH 9.6)和10×反应缓冲液(6.6mM MgCl2,660mM TrisHCl)。所有寡核苷酸均由生工(中国上海)合成,修饰和纯化。
仪器:Tecnai G2 20透射电子显微镜(TEM)(美国);H1M1酶联免疫分析仪(广州达瑞生物技术有限公司);T9-UV-vis分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。震荡孵育机(美国,赛默飞)。
实施例1
通过柠檬酸盐还原法制备AuNP。在磁力搅拌器上将100mL的0.01%HAuCl4加热至沸腾。随后在剧烈搅拌下将2.5mL新鲜制备的1%柠檬酸三钠加入沸腾溶液中。将混合物连续煮沸约15分钟,直到颜色变成橘红色。然后在缓慢搅拌下将溶液冷却至环境温度,补充至100mL分散液后,在4℃下保存。将1mL AuNPs分散液(pH 8.5-9.0)与18μg单克隆抗体在室温下温和搅拌下孵育1h。利用10mM TCEP活化巯基修饰的Trigger DNA(序列为:5’-GTTTTTAGGGATGTTACGTACGACTTATTTTTTTTTTTT-SH-3’),然后使用ZebaTM脱盐柱去除过量的TCEP。然后将活化后的巯基修饰的Trigger DNA,30%PEG 20000(终浓度为1%)和0.1M PBS(终浓度为0.01M)与AuNP-抗体混合5分钟,并在4℃下进行盐老化2h。最后,添加10%BSA以封闭AuNP表面上剩余的活性位点。为了去除多余的寡核苷酸,将溶液在13000rpm和4℃下离心15分钟,得到探针。然后将探针重悬于200μL储存缓冲液(0.01M PBS,1%PEG 20000、1%BSA)中,并保存在4℃下。
通过TEM和UV-可见光谱表征,如图2a所示,合成的AuNP粒径约为15nm,分散良好,且无聚集,紫外峰出现在519nm处,连接上DNA和抗体后,519nm处的紫外峰红移至526nm处,且在260nm出现DNA的峰,表明检测探针的成功合成。
实施例2
将100μL一定浓度的CAP-BSA加至96孔板中,并在37℃下孵育2h。用0.05%PBST洗涤3次后,加入250μL 2%BSA在37℃下封闭1h。然后,加入50μL CAP标准液和一定稀释倍数的实施例1所得的DNA-抗体探针,并在37℃下孵育1h以进行竞争反应。洗涤后,加入0.3μMHP,30U ExoIII和反应缓冲液进行反应。在489nm和517nm处获得荧光。
实施例3
抗原浓度为0.6μg/mL,探针稀释倍数为80倍,信号DNA的浓度为0.3μM,ExoⅢ的浓度为0.3U/μL。在此条件下,检测一系列稀释的CAP标准样品浓度(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5ng/L)。在489nm和517nm处获得荧光(FAM/BHQ1)。
如图6所示,获得线性范围为0.01至5ng/L的标准曲线,线性方程为y=-2867.81x+5277.76(R2=0.95),检出限(LOD)为0.001ng/L。
实施例4探究优化
一、探究优化Trigger DNA的选择:
参照实施例1,改变Trigger DNA的序列为如表1中1、2组所示的序列,其他不变,制得相应的探针。
表1 Trigger DNA筛选结果
将所得探针分别按照实施例3的过程用于检测,结果如图3所示。选用第3组序列的Trigger DNA和HP的杂交体在ExoⅢ切割作用下,获得非常显著的强荧光信号,能够实现更加灵敏的检测。
二、探究优化信号DNA的浓度条件:
参照实施例3,改变信号DNA的浓度,分别为0.1μM、0.5μM,其他不变,进行检测。
结果如图6所示。信号DNA的浓度为0.3μM时具有较高的抑制率,检测更加灵敏。
其中,抑制率计算公式:(目标物0ng/L时的荧光信号-目标物5ng/L时的荧光信号)/目标物0ng/L时的荧光信号。
三、探究ExoⅢ的浓度条件:
参照实施例3,改变信号ExoⅢ的浓度,分别为0.4U/μL、0.5U/μL,其他不变,进行检测。
结果如图7所示。ExoⅢ的浓度为0.3U/μL时时具有较高的抑制率,检测更加灵敏。
实施例5
选取牛奶中可能出现的抗生素包括链霉素,卡那霉素,庆大霉素,甲砜霉素,评估方法的特异性。
如图7所示,链霉素,卡那霉素,庆大霉素显示较低的交叉反应性(5%,11%,16%),而甲砜霉素的交叉反应率较高,因其结构与CAP相似。
实施例6
选取市面上常见的50%、100%脱脂牛奶为实际样品,并稀释一倍用作比较,添加不同浓度的CAP标准品(0.05、0.5、5ng/L)。
如表2所示,得到的回收率的范围为81%至113%,RSD的范围为2%至10%。结果表明,该新方法具有良好的准确性。
表2回收率验证结果
Claims (10)
1.一种制备用于检测氯霉素的探针的方法,其特征在于,所述方法包括如下过程:
(1)合成纳米金颗粒AuNP:将HAuCl4分散在水中配制成溶液,加热至沸腾,然后加入柠檬酸三钠,混匀反应,反应结束后,得到有橘红色溶液体系,即为纳米金颗粒分散液;
(2)调节纳米金颗粒分散液的pH至8.5-9.0,加入氯霉素单克隆抗体进行孵育,孵育结束后,获得含有抗体修饰的纳米金颗粒的分散液;记作AuNP-抗体分散液;
(3)将活化后的巯基修饰的Trigger DNA、PEG20000、PBS加入到所得AuNP-抗体分散液中,混匀反应,获得AuNP-抗体-DNA分散液;
(4)在所得AuNP-抗体-DNA分散液中加入BSA进行孵育,孵育结束后,固液分离,得到探针。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,每1mL纳米金颗粒分散液中加入18μg氯霉素单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述有巯基修饰的Trigger DNA的序列为:5’-GTTTTTAGGGATGTTACGTACGACTTATTTTTTTTTTTT-SH-3’。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,活化是指利用TCEP活化有巯基修饰的DNA;其中,TCEP与巯基修饰的DNA的摩尔比为100:1。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,PEG20000制成30%的溶液进行添加;添加至使溶液中PEG20000的终浓度为1%。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,加入0.1M的PBS;添加至使溶液中的PBS浓度为0.01M。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)中,BSA的浓度为10wt%;添加至使溶液中BSA的终浓度为1%。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法,其特征在于,制备得到的一种检测氯霉素的探针。
9.一种检测氯霉素含量的方法,其特征在于,所述方法包括如下过程:
96孔黑色微孔板经氯霉素包被抗原CAP-BSA包板,BSA封闭后,获得氯霉素包被抗原(CAP-BSA)包板的96孔黑色微孔板;将权利要求8所述的探针利用缓冲液进行稀释,配制成探针分散液;然后将一系列已知浓度的CAP样品和探针分散液加入到CAP-BSA包板的96孔中,孵育进行竞争反应,结束后,清洗96孔黑色微孔板,洗去未结合的探针以及与样品结合的探针后,剩余酶标板上的与包被抗原结合的探针;
然后加入信号DNA和ExoⅢ,混匀反应,形成检测样液;将检测获得检测样液于489/517nm处的荧光强度信号,利用浓度与相应的荧光强度构建线性关系,即得检测模型。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,信号DNA在检测样液的浓度为0.3μM;ExoⅢ在检测样液中的浓度为0.3U/μL;氯霉素包被抗原在检测样液中的浓度为0.6μg/mL。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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