CN114544932A - 一种基于人工核酶的食品中污染物多色荧光分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于人工核酶的食品中污染物多色荧光分析方法，属于分子生物学检测领域。本发明以金纳米颗粒为载体，合成AuNPs‑DNA‑抗体检测探针，抗体用于捕获目标物，引物DNA用于放大信号。在最佳条件下，本发明的方法实现了CAP、17β‑E2和AFM1的同时检测，检测范围分别为0.333ng/mL‑3.333μg/mL、3.333ng/mL‑3.333μg/mL、3.333fg/mL‑3.333ng/mL，定量限分别为0.333ng/mL、3.333ng/mL、3.333fg/mL。本发明检测准确度、灵敏度和稳定性较高，相比现有技术，本发明建立的方法在检测过程中，无需添加额外的核酸外切酶，降低反应成本。

Description

一种基于人工核酶的食品中污染物多色荧光分析方法
技术领域
本发明涉及一种基于人工核酶的食品中污染物多色荧光分析方法，属于分子生物学检测领域。
背景技术
近年来随着人们生活质量与观念水平的提高，牛奶已经逐渐成为家庭中的必需品，牛奶营养丰富，但有资料显示现代牛奶中抗生素、雌激素、微生物毒素含量增加，长时间摄入可能危害着人类健康尤其是对青少年生长发育和生殖系统有不利影响。因此，监测食品中污染物的含量对于确保食品安全至关重要。迄今为止，已经开发了多种分析检测方法用于联合检测食品中的污染物，包括仪器分析法和酶联免疫法(ELISA)。然而，这些方法可能预处理步骤繁琐、交叉反应较强等缺点。因此，有必要开发一种简单高效的多色荧光检测方法。
AuNPs-DNA-抗体是一种将纳米材料和免疫分析方法相结合的检测探针，其中抗体用于免疫竞争靶标，trigger DNA用于扩增信号。目前，该探针已被广泛应用到生物传感器领域。此外，很多基于DNAzyme的等温扩增技术也是近年来研究的热点。DNAzyme是一类具有催化功能的DNA分子。同蛋白质和RNA催化酶一样，DNAzyme能够催化多种类型的生化反应，并在不对称催化、生物传感器、DNA纳米技术以及临床诊断方面得到了广泛的应用。综上，结合AuNPs-DNA-抗体特异性检测探针与DNAzyme介导的核酸扩增(DANA)，根据检测探针设计的不同荧光素信号，实现食品中不同痕量污染物的高灵敏度检测分析。
发明内容
[技术问题]
解决荧光免疫法同时检测多种污染物的问题，提供一种多色荧光高灵敏检测的便捷方法。
[技术方案]
本发明的第一个目的是提供一种同时检测多种污染物的方法，所述方法的具体步骤为：
(1)合成检测探针：在AuNPs表面修饰氯霉素(CAP)、雌二醇激素(17β-E2)或黄曲霉毒素M1(AFM1)的引物DNA和相应的特异性抗体，分别得到针对CAP、17β-E2、AFM1的三种检测探针；
(2)将CAP、17β-E2、AFM1相应抗原进行混合并添加至黑色聚苯乙烯微孔板，BSA封闭；
(3)将步骤(1)制备的CAP、17β-E2、AFM1的检测探针分别稀释后与待测样品混合后加入至步骤(2)中的黑色聚苯乙烯微孔板，孵育并清洗黑色聚苯乙烯微孔板；
(4)将针对CAP、17β-E2、AFM1的信号DNA和Mg2+分别加入至步骤(3)中的黑色聚苯乙烯微孔板，孵育并检测荧光强度信号。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中合成检测探针的方法为：取一定量的AuNPs，加入CAP、17β-E2或AFM1单克隆抗体，室温孵育，形成三种AuNPs-抗体分散液；巯基修饰的CAP、17β-E2或AFM1的引物DNA经TCEP活化后分别加入对应AuNPs-抗体分散液，混匀并冷冻，溶解后加入PEG20000和PBS，获得AuNP-DNA-抗体分散液；加入BSA进行孵育，离心取上清获得检测探针。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中合成检测探针的方法为：
a)取3mL含有13nm AuNPs的分散液，调节pH至8.5-9，等分至3个离心管中，分别加入18μg CAP、17β-E2或AFM1单克隆抗体，室温孵育1h，形成三种含AuNPs-抗体的分散液；
b)巯基修饰的CAP的引物DNA、17β-E2的引物DNA和AFM1的引物DNA经TCEP活化后(摩尔比1：100)分别加入对应AuNPs-抗体分散液，置于-20℃冷冻30min，溶解后加入30％PEG20000、0.1M PBS，持续混匀5min后，4℃条件下盐老化2h，形成含有AuNPs-DNA-抗体的分散液；
c)加入10％BSA，室温孵育40min，13000rpm离心15min，最终合成的探针分散于200μL 0.01M PBS中(含1％PEG20000和1％BSA，pH＝7.4)，4℃避光保存，一周内使用完。
在本发明的一种实施方式中，CAP的引物DNA的序列为：5’-HS-(T)28TCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGCGT-3’。
在本发明的一种实施方式中，17β-E2的引物DNA的序列为：5’-HS-(T)28GATTGTCTCCGAGCCGGTCGAAATGAAGCTA-3’。
在本发明的一种实施方式中，AFM1的引物DNA的序列为：5’-HS-(T)28GCTACTCTCCGAGCCGGTCGAAATTAGAACG-3’。
在本发明的一种实施方式中，CAP的信号DNA的序列为：5’-FAM-ACGCACTAT/rA/GGAAGAGAT-BHQ1-3’。
在本发明的一种实施方式中，17β-E2的信号DNA的序列为：5’-Cy3-TAGCTTCAT/rA/GGACAATCA-BHQ2-3’。
在本发明的一种实施方式中，AFM1的信号DNA的序列为：5’-Texas red-CGTTCTAAT/rA/GGAGTAGCC-BHQ2-3’。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，将CAP、17β-E2、AFM1相应抗原进行混合并添加至黑色聚苯乙烯微孔板，35～38℃下孵育1.5～2.5h，加入220μL 2％BSA在35～38℃下封闭0.5～1.5h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，CAP、17β-E2、AFM1相应抗原的添加浓度为0.6～1.5μg/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，CAP、17β-E2、AFM1的检测探针的稀释倍数为1/80-1/60。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，孵育的条件为在35～38℃下孵育0.5～1.5h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，CAP、17β-E2、AFM1的信号DNA的添加浓度为0.01～0.1μg/mL，Mg2+的浓度为5～15mM。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，孵育的条件为在35～38℃下孵育0.5～1.5h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，分别于489/521nm、532/568nm和592/622nm处检测荧光强度信号。
本发明还提供一种多色荧光检测试剂盒，试剂盒包括针对氯霉素、雌二醇激素和黄曲霉毒素M1的检测探针、包被有氯霉素、雌二醇激素和黄曲霉毒素M1包被抗原的黑色聚苯乙烯微孔板、BSA、氯霉素标准品、雌二醇激素标准品、黄曲霉毒素M1标准品、信号DNA和Mg2+。
在本发明的一种实施方式中，所述检测探针的制备方法为：取一定量的AuNPs，加入CAP、17β-E2或AFM1单克隆抗体，室温孵育，形成三种AuNPs-抗体分散液；巯基修饰的CAP、17β-E2或AFM1的引物DNA经TCEP活化后分别加入对应AuNPs-抗体分散液，混匀并冷冻，溶解后加入PEG20000和PBS，获得AuNP-DNA-抗体分散液；加入BSA进行孵育，离心取上清获得检测探针。
在本发明的一种实施方式中，所述检测探针的制备方法为：
a)取3mL含有13nm AuNPs的分散液，调节pH至8.5-9，等分至3个离心管中，分别加入18μg CAP、17β-E2或AFM1单克隆抗体，室温孵育1h，形成三种含AuNPs-抗体的分散液；
b)巯基修饰的CAP的引物DNA、17β-E2的引物DNA和AFM1的引物DNA经TCEP活化后(摩尔比1：100)分别加入对应AuNPs-抗体分散液，置于-20℃冷冻30min，溶解后加入30％PEG20000、0.1M PBS，持续混匀5min后，4℃条件下盐老化2h，形成含有AuNPs-DNA-抗体的分散液；
c)加入10％BSA，室温孵育40min，13000rpm离心15min，最终合成的探针分散于200μL 0.01M PBS中(含1％PEG20000和1％BSA，pH＝7.4)，4℃避光保存，一周内使用完。
在本发明的一种实施方式中，CAP的引物DNA的序列为：5’-HS-(T)28TCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGCGT-3’。
在本发明的一种实施方式中，17β-E2的引物DNA的序列为：5’-HS-(T)28GATTGTCTCCGAGCCGGTCGAAATGAAGCTA-3’。
在本发明的一种实施方式中，AFM1的引物DNA的序列为：5’-HS-(T)28GCTACTCTCCGAGCCGGTCGAAATTAGAACG-3’。
在本发明的一种实施方式中，CAP的信号DNA的序列为：5’-FAM-ACGCACTAT/rA/GGAAGAGAT-BHQ1-3’。
在本发明的一种实施方式中，17β-E2的信号DNA的序列为：5’-Cy3-TAGCTTCAT/rA/GGACAATCA-BHQ2-3’。
在本发明的一种实施方式中，AFM1的信号DNA的序列为：5’-Texas red-CGTTCTAAT/rA/GGAGTAGCC-BHQ2-3’。
有益效果：
1、本发明以金纳米颗粒为载体，合成AuNPs-DNA-抗体检测探针，抗体用于捕获目标物，引物DNA用于放大信号。在黑色96微孔板经抗原包板、封闭、洗涤后，加入AuNPs-DNA-抗体检测探针，包被抗原与待测样品竞争结合探针上的抗体；洗去多余探针及与目标物结合的探针，加入信号DNA及Mg2+，与检测探针上的引物DNA完成信号放大步骤。
2、本发明建立用于CAP/17β-E2/AFM1同步定量检测的DNAzyme辅助信号放大的荧光免疫分析方法，在最佳条件下，该方法实现了CAP、17β-E2和AFM1的同时检测，检测范围分别为0.333ng/mL-3.333μg/mL、3.333ng/mL-3.333μg/mL、3.333fg/mL-3.333ng/mL，定量限分别为0.333ng/mL、3.333ng/mL、3.333fg/mL。
3、与抗生素(KANA和SM)、两种激素(E1和E3)和两种毒素(OTA和ZEN)交叉反应率低，对氯霉素、17β-E2和AFM1具有高选择性。本发明检测准确度、灵敏度和稳定性较高，相比现有技术，本发明建立的方法在检测过程中，无需添加额外的核酸外切酶，降低反应成本。
附图说明
图1本发明原理示意图。
图2为不同荧光素对实验结果的影响图；a)分别以6-FAM、Cy3、Texas red为探针荧光信号的检测效果图；b)分别以6-FAM、TAMRA、Cy5为探针荧光信号的检测效果图；c)在6-FAM、Cy3、Texas red荧光探针扩增下的检测效果图；d)在6-FAM、TAMRA、Cy5荧光探针扩增下的检测效果图。
图3为方案可行性验证；a)检测CAP；b)检测E2；c)检测AFM1；d)不用CAP浓度下的荧光强度变化；e)不同E2浓度下的荧光强度变化；f不同AFM1浓度下的荧光强度变化)。
图4为包被抗原浓度和检测探针的浓度优化图；a)CAP包被抗原浓度和检测探针的浓度优化；b)17β-E2包被抗原浓度和检测探针的浓度优化；c)AFM1包被抗原浓度和检测探针的浓度优化。
图5为信号DNA和Mg2+的浓度优化图a)CAP信号DNA和Mg2+的浓度优化；b)17β-E2信号DNA和Mg2+的浓度优化；c)AFM1信号DNA和Mg2+的浓度优化。
图6为检测线性关系标准曲线图；a)CAP标准曲线图；b)17β-E2标准曲线图；c)AFM1标准曲线图。
图7为特异性和稳定性研究图；a)方法对不同抗生素、激素及毒素的检测效果图b)不同时间下检测方法的效果图。
具体实施方式
试剂和材料：CAP的标准品购自振翔科技有限公司(中国北京)。柠檬酸三钠，吐温20，牛白蛋白(BSA)、MgCl2和聚乙二醇20000(PEG 20000)购自国药集团化学试剂有限公司(中国上海)。TCEP购自碧云天有限公司(中国上海)。单克隆抗体购自Gene Tex(美国)。CAP-BSA购自奥斯特科技有限责任公司(中国南宁)。
包被缓冲液(0.06M CBS，pH 9.6)和5×反应缓冲液(0.1M Tris-HCl,0.75M NaCl,pH 8.3)。0.1M PBS(1.35M NaCl,0.047M KCl,0.1M Na2HPO4,0.02M NaH2PO4)。所有寡核苷酸均由生工(中国上海)合成，修饰和纯化。
仪器：Tecnai G220透射电子显微镜(TEM)(美国)；H1M1酶联免疫分析仪(广州达瑞生物技术有限公司)；T9-UV-vis分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。震荡孵育机(美国，赛默飞)。
实施例1合成检测探针
(1)AuNP的制备：
通过柠檬酸盐还原法制备AuNP。在磁力搅拌器上将100mL的0.01％HAuCl4加热至沸腾。随后在剧烈搅拌下将2.5mL新鲜制备的1％柠檬酸三钠加入沸腾溶液中。将混合物连续煮沸约15分钟，直到颜色变成橘红色。然后在缓慢搅拌下将溶液冷却至环境温度，补充至100mL分散液后，在4℃下保存。
(2)合成AuNPs-DNA-抗体检测探针：
1)取1mL AuNPs分散液(pH 8.5-9.0)分别与18μg CAP/17β-E2/AFM1单克隆抗体在室温下温和搅拌并孵育1h，获得混合液AuNPs-CAP、AuNPs-17β-E2和AuNPs-AFM1。
2)利用TCEP分别活化巯基修饰的针对CAP、17β-E2、AFM1的引物DNA。
3)将步骤2)中活化的针对CAP、17β-E2、AFM1的引物DNA加入至步骤1)中对应的混合液中，引物DNA的添加量为1OD，-20℃静置0.5h。待溶解后，再向混合液中加入30％PEG20000(终浓度为1％)和0.1M PBS(终浓度为0.01M)混合5分钟，并在4℃下进行盐老化2h。最后，加入10％BSA，室温孵育40min，13000rpm离心15min，最终合成的探针分散于200μL0.01M PBS中(含1％PEG20000和1％BSA，pH＝7.4)。
CAP的引物DNA1为：5’-HS-(T)28TCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGCGT-3’。
17β-E2的引物DNA2为：5’-HS-(T)28GATTGTCTCCGAGCCGGTCGAAATGAAGCTA-3’。
AFM1的引物DNA3为：5’-HS-(T)28GCTACTCTCCGAGCCGGTCGAAATTAGAACG-3’。
实施例2信号DNA的标记荧光素的选择
(1)荧光信号检测
将1.5μg/mL浓度的CAP、E2、AFM1标准液按照1:1:1的体积比混合制备混合样品溶液，将实施例1中制备的0.3μM浓度的CAP、17β-E2、AFM1的AuNPs-DNA-抗体也按照1:1:1的体积比混合制备AuNPs-抗体-DNA探针混合溶液。
将60μL浓度为0.9μg/mL的包被抗原CAP-BSA、E2-BSA和AFM1-BSA混合在一起，包被在黑色微孔板中，37℃孵育2h。用0.05％PBST洗涤3次后，加入250μL 2％BSA在37℃下封闭1h。然后加入90μL混合样品溶液和90μL AuNPs-抗体-DNA探针混合溶液在37℃下孵育1h进行免疫竞争反应。洗涤后，加入36μL Tris-HCl、18μL信号DNA和36μL MgCl2，用水补足反应体系至180μL，并于37℃孵育1h。用荧光分光光度计测量荧光光谱曲线，同时用多功能酶标仪测量489/521nm、532/568nm和592/622nm处的荧光信号(图1)。
(2)荧光标记素的选择
为了更好的区分CAP、17β-E2、AFM1三种目标污染物的检测信号，在针对CAP、17β-E2、AFM1的信号DNA的3’端连接不同的荧光素，并进一步检测不同的荧光素对于检测灵敏度的影响，因此选用6-FAM(1)、Cy3(2)、Texas red(3)和6-FAM(4)、TAMRA(5)、Cy5(6)两种组合测试荧光素对实验结果的影响。如图2a-b所示，字母S代表信号DNA，I代表引物DNA，数字代表信号DNA上连接的荧光素序号(表1)，荧光仪测试结果显示无论使用何种荧光素，实施例1后的检测信号均比原始荧光信号即仅存在信号DNA时的信号放大了许多，且出峰位置清晰，相互之间无干扰。
利用酶标仪比较实际的扩增效果，如图2c-d，group1代表信号DNA1和引物DNA1以6-FAM(1)为荧光素的组合，group2以此类推(表1)，由图中可以看到，以6-FAM(4)、TAMRA(5)、Cy5(6)的扩增效果不如分别以6-FAM(1)、Cy3(2)、Texas red(3)为荧光素的检测探针。以TAMRA(5)为荧光素的检测探针信号只扩增了14倍((FS+I)/FS)，以Cy5(6)为荧光素的检测探针信号只扩增了20倍，明显不如以Cy3(38倍)或Texas red(37倍)为荧光信号的检测探针。因此选择6-FAM(1)、Cy3(2)、Texas red(3)作为三种标记荧光素。
CAP的信号DNA1为：5’-荧光素-ACGCACTAT/rA/GGAAGAGAT-BHQ1-3’。
17β-E2的信号DNA2为：5’-荧光素-TAGCTTCAT/rA/GGACAATCA-BHQ2-3’。
AFM1的信号DNA3为：5’-荧光素-CGTTCTAAT/rA/GGAGTAGCC-BHQ2-3’。
表1
组别 代表序列
S1 信号DNA1-6-FAM(1)
S2 信号DNA2-Cy3(2)
S3 信号DNA3-Texas red(3)
S4 信号DNA1-6-FAM(4)
S5 信号DNA2-TAMRA(5)
S6 信号DNA3-Cy5(6)
Group1 信号DNA1-6-FAM(1)+引物DNA1+Mg<sup>2+</sup>
Group2 信号DNA2-Cy3(2)+引物DNA2+Mg<sup>2+</sup>
Group3 信号DNA3-Texas red(3)+引物DNA3+Mg<sup>2+</sup>
Group4 信号DNA1-6-FAM(4)+引物DNA1+Mg<sup>2+</sup>
Group5 信号DNA2-TAMRA(5)+引物DNA2+Mg<sup>2+</sup>
Group6 信号DNA3-Texas red(3)+引物DNA3+Mg<sup>2+</sup>
实施例3荧光检测可行性分析
为验证三组序列的扩增效果，将10μL实施例1中的针对CAP、17β-E2或AFM1的引物DNA(0.3μM)、10μL针对CAP、17β-E2或AFM1的信号DNA(0.6μM)和20μL MgCl2(50mM)在0.1MTris-HCl(含0.75M NaCl，pH 8.3)中于37℃孵育1h，于489/521nm、532/568nm和592/622nm处分别测定荧光。
结果如图3所示，在引物DNA、信号DNA和Mg2+的同时存在的情况下，分别在489/521nm、532/568nm和592/622nm处获得了增强荧光，表明扩增反应仅在这种情况下可以进行。当缺少引物DNA或者辅助因子时，扩增反应不会发生，荧光信号较弱。另外，由图3a-c可知，引物DNA无法作用于错配的信号DNA，荧光信号无法获得。在其中一种引物DNA与所有信号DNA的反应中，荧光信号几乎不会受到干扰。
进一步的，利用实施例1中的针对CAP、17β-E2或AFM1的AuNPs-抗体-DNA验证了方案的可行性。
将1.5μg/mL浓度的CAP、E2、AFM1标准液按照1:1:1的体积比混合制备混合样品溶液，将实施例1中制备的0.3μM浓度的CAP、17β-E2、AFM1的AuNPs-DNA-抗体也按照1:1:1的体积比混合制备AuNPs-抗体-DNA探针混合溶液。
将60μL浓度为0.9μg/mL的包被抗原CAP-BSA、E2-BSA和AFM1-BSA混合在一起，包被在黑色微孔板中，37℃孵育2h。用0.05％PBST洗涤3次后，加入250μL 2％BSA在37℃下封闭1h。然后分别加入90μL浓度为0μg/mL、0.005μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、5μg/mL的混合样品溶液和90μL AuNPs-抗体-DNA探针混合溶液在37℃下孵育1h进行免疫竞争反应。洗涤后，加入36μL Tris-HCl、18μL信号DNA和36μL MgCl2，用水补足反应体系至180μL，并于37℃孵育1h。用荧光分光光度计测量荧光光谱曲线，同时用多功能酶标仪测量489/521nm、532/568nm和592/622nm处的荧光信号。
如图3d-f分别表示该方法对CAP、E2和AFM1的检测效果，随着三个靶标浓度的增加，荧光强度逐渐降低，表明该方案可行。
实施例4条件优化
(1)探究包被抗原浓度和检测探针的浓度：
参照实施例2(1)同时检测CAP、17β-E2和AFM1三种目标污染物含量的方法，用棋盘法优化对不同的抗原包被浓度(0.6、0.9、1.2、1.5μg/mL)和AuNPs-抗体-DNA的浓度(1/80、1/60)进行优化，并以抑制率作为评价指标。如图4所示，当探针稀释度为1/60、1/60、1/60，抗原包被浓度为0.9、0.9和1.5μg/mL时，抑制率(1-F1/F0,1-F1/F0,1-F0.05/F0)达到最高，分别为82.439％、62.052％和68.222％。
(2)探究信号DNA和Mg2+的浓度：
信号DNA和Mg2+的浓度是DNAzyme介导的等温核酸扩增的关键条件。参照实施例2(1)同时检测CAP、17β-E2和AFM1三种目标污染物含量的方法，设置信号DNA浓度(S1：0.005、0.01、0.02、0.03、0.04μM；S2：0.025、0.05、0.1、0.15、0.2μM；S3：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4μM)和Mg2+(3、5、8、10、13、15、18mM)进行分析，如图5所示。当信号DNA和Mg2+的浓度分别为0.01μM、0.025μM、0.1μM和10mM、10mM、10mM时，抑制率最高，分别为49.600％、65.419％和46.472％。最终，选择1/60稀释AuNPs-抗体-DNA、0.9μg/mL抗原、10mM Mg2+和0.01μM信号DNA用于CAP检测，1/60稀释AuNPs-antibody-DNA、0.9μg/mL抗原、10mM Mg2+和0.025μM信号DNA用于E2检测、1/60稀释AuNPs-抗体-DNA、1.5μg/mL抗原、10mM Mg2+和0.1μM信号DNA用于AFM1检测。
实施例5方法学验证
为保证该多靶标策略的实用性，对该方法的线性、检出限(LOD)进行了验证。
参照实施例1合成检测探针，将1.5μg/mL浓度的CAP、E2、AFM1标准液按照1:1:1的体积比混合制备混合样品溶液，选择1/60稀释AuNPs-抗体-DNA、0.9μg/mL CAP抗原、10mM Mg2+和0.01μM信号DNA1用于CAP检测，1/60稀释AuNPs-antibody-DNA、0.9μg/mL E2抗原、10mMMg2+和0.025μM信号DNA2用于E2检测、1/60稀释AuNPs-抗体-DNA、1.5μg/mL AFM1抗原、10mMMg2+和0.01μM信号DNA3用于AFM1检测。改变混合样品的浓度，测定至少20个空白样品，记录数值，求出平均值(x)和标准差(SD)，求出x+3SD或x-3SD将其带入曲线方程，得到检出限。
结果如图6所示，随着目标物浓度的增加，对应的荧光强度下降。这一趋势可以解释为：当靶标和检测探针同时加入孔中时，靶标和抗原将与AuNPs-抗体-DNA上的抗体竞争。随着靶分子浓度的增加，与抗原结合的探针减少，荧光强度下降。CAP、E2、AFM1的检测范围分别在0.333ng/mL-3.333μg/mL、3.333ng/mL-3.333μg/mL、3.333fg/mL-3.333ng/mL。标准曲线显示出良好的线性(CAP，y＝-436.96x+657.13，R2＝0.96；E2，y＝-33.27x+109.23，R2＝0.94；AFM1，y＝-41.57x-27.82，R2＝0.94)。定量限分别为0.333ng/mL、3.333ng/mL、3.333fg/mL。
实施例6特异性研究
分别选择两种抗生素：卡那霉素(KANA)和链霉素(SM)、两种激素：雌酮(E1)和雌三醇(E3)和两种毒素：玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)进行特异性研究，将以KANA+E1+OTA为一组、SM+E3+ZEN为一组将其各自的标准溶液配成混合样品溶液，每个样品设3个重复，应用建立的方法进行检测，对结果进行统计、分析和评价。结果如图7a所示，测得的交叉反应性较低。
实施例7稳定性研究
研究了一个月的时间内探针的稳定性。将探针置于4℃保存，分别于1、15和30天进行检测。以抑制率作为评价指标(CAP，1-F10/F0.001；E2，1-F10/F0.01；AFM1，1-F0.01/F0.00001)。如图7b所示，探针存放1个月后仍显示出良好的检测效果。
实施例8实际样品的测定
回收率测试是将三种目标物的标准溶液以不同浓度水平一式三份加标到牛奶样品中进行的(CAP为0.005和0.01μg/mL，E2为0.05和0.1μg/mL，AFM1为0.00005和0.005μg/mL)，结果如表2所示。平均回收率范围为93％至115％，RSD范围为5％至10％。结果表明，本发明提供的检测方法具有良好的准确性。
表2回收率验证结果
Figure BDA0003543046310000101
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种同时检测多种污染物的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：
(1)合成检测探针：在AuNPs表面修饰氯霉素、雌二醇激素或黄曲霉毒素M1的引物DNA和相应的特异性抗体，分别得到针对氯霉素、雌二醇激素、黄曲霉毒素M1的三种检测探针；
(2)将氯霉素、雌二醇激素、黄曲霉毒素M1相应抗原进行混合并添加至黑色聚苯乙烯微孔板，BSA封闭；
(3)将步骤(1)制备的氯霉素、雌二醇激素、黄曲霉毒素M1的检测探针分别稀释后与待测样品混合后加入至步骤(2)中的黑色聚苯乙烯微孔板，孵育并清洗黑色聚苯乙烯微孔板；
(4)将针对氯霉素、雌二醇激素、黄曲霉毒素M1的信号DNA和Mg2+分别加入至步骤(3)中的黑色聚苯乙烯微孔板，孵育并检测荧光强度信号。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氯霉素的引物DNA的序列为：5’-HS-(T)28TCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGCGT-3’；雌二醇激素的引物DNA的序列为：5’-HS-(T)28GATTGTCTCCGAGCCGGTCGAAATGAAGCTA-3’；黄曲霉毒素M1的引物DNA的序列为：5’-HS-(T)28GCTACTCTCCGAGCCGGTCGAAATTAGAACG-3’。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氯霉素的信号DNA的序列为：5’-FAM-ACGCACTAT/rA/GGAAGAGAT-BHQ1-3’，雌二醇激素的信号DNA的序列为：5’-Cy3-TAGCTTCAT/rA/GGACAATCA-BHQ2-3’，黄曲霉毒素M1的信号DNA的序列为：5’-Texas red-CGTTCTAAT/rA/GGAGTAGCC-BHQ2-3’。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将氯霉素、雌二醇激素、黄曲霉毒素M1相应抗原进行混合并添加至黑色聚苯乙烯微孔板，35～38℃下孵育1.5～2.5h，加入220μL 2％BSA在35～38℃下封闭0.5～1.5h。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，氯霉素、雌二醇激素、黄曲霉毒素M1相应抗原的添加浓度为0.6～1.5μg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，氯霉素、雌二醇激素、黄曲霉毒素M1的检测探针的稀释倍数为1/80-1/60。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，氯霉素、雌二醇激素、黄曲霉毒素M1的信号DNA的添加浓度为0.01～0.1μg/mL，Mg2+的浓度为5～15mM。
8.一种多色荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对氯霉素、雌二醇激素和黄曲霉毒素M1的检测探针、包被有氯霉素、雌二醇激素和黄曲霉毒素M1包被抗原的黑色聚苯乙烯微孔板、BSA、氯霉素标准品、雌二醇激素标准品、黄曲霉毒素M1标准品、信号DNA和Mg2+。
9.根据权利要求8所述的多色荧光检测试剂盒，其特征在于，所述检测探针的制备方法为：取一定量的AuNPs，加入氯霉素、雌二醇激素或黄曲霉毒素M1单克隆抗体，室温孵育，形成三种AuNPs-抗体分散液；巯基修饰的氯霉素、雌二醇激素或黄曲霉毒素M1的引物DNA经TCEP活化后分别加入对应AuNPs-抗体分散液，混匀并冷冻，溶解后加入PEG20000和PBS，获得AuNP-DNA-抗体分散液；加入BSA进行孵育，离心取上清获得检测探针。
10.根据权利要求8或9所述的多色荧光检测试剂盒，其特征在于，氯霉素的信号DNA的序列为：5’-FAM-ACGCACTAT/rA/GGAAGAGAT-BHQ1-3’，雌二醇激素的信号DNA的序列为：5’-Cy3-TAGCTTCAT/rA/GGACAATCA-BHQ2-3’，黄曲霉毒素M1的信号DNA的序列为：5’-Texasred-CGTTCTAAT/rA/GGAGTAGCC-BHQ2-3’。
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