CN113341147A - 玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素a的双重荧光免疫检测体系的构建与应用 - Google Patents

玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素a的双重荧光免疫检测体系的构建与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测体系的构建与应用。本发明通过碳二亚胺法将绿色量子点与抗ZEN单克隆抗体偶联、橙红色量子点与抗OTA单克隆抗体结合，制备出两种免疫荧光探针；通过碳二亚胺法合成的玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN‑OVA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA‑OVA同时包被在具有高结合力的黑色微量滴定板单个孔中，建立同时定量检测两种真菌毒素的多重荧光免疫分析体系。本发明方法操作简便、高效、灵敏且检测成本低，应用于检测玉米等谷物样品中的ZEN和OTA的毒素残留具有较好的准确性。

Description

玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测体系的构 建与应用
技术领域
本发明涉及有害物质检测技术领域，具体涉及一种玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测体系的构建与应用。
背景技术
真菌毒素是一大类由丝状真菌产生的具有毒性的次生真菌代谢产物。当摄入超过一定浓度的真菌毒素时，会引起一种称为真菌毒素中毒的毒性反应，具有致畸性、致癌性和致突变性。
玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一种由镰刀菌属禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生的次生代谢产物，严重污染玉米、小麦、高粱等重要农作物。ZEN具有高雌激素作用，有较强生殖毒性和致畸作用，在人体和动物体生殖发育、细胞增殖和器官功能等方面有极大的危害。
赭曲霉毒素（Ochratoxin, OT）主要是由曲霉属和青霉属产生的有毒次生代谢产物，OTA 是赭曲霉毒素中毒性最强、分布最广、对农产品污染最严重的霉菌毒素。OTA 广泛存在于农产品中，还可以污染各种商品（如葡萄酒，面包和肉制品），OTA可以在死亡的宿主真菌内存活，并在人体内有长达35天的半衰期；赭曲霉毒素可以损坏肝脏和肾脏，具有免疫毒性、神经毒性和遗传毒性。
真菌毒素污染饲料和食品后，不仅使农业经济受到严重影响，且还会带来严重食品安全问题，威胁到人类健康。因此，开发高灵敏度、高通量、选择性的新方法，特别是同时识别多种真菌毒素仍然是必要的。传统的检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、液相质谱联用法(LC-MS)、以及亲和探针毛细管电泳法等。但存在以下缺点：所需的仪器设备昂贵、前处理复杂，操作繁琐，检测成本高，灵敏度低，检测时间较长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于荧光免疫分析的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重检测方法与应用，以解决现有的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A检测方法所需仪器设备昂贵、前处理复杂，操作繁琐，检测成本高，灵敏度低，检测时间较长的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
构建一种玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测体系，包括如下步骤：
（1）免疫原的合成
分别采用肟化法和碳二亚胺法合成免疫原玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN- BSA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA-BSA作为免疫原；
（2）单克隆抗体的制备
分别以所述ZEN-BSA和OTA-BSA作为免疫原，采取皮下多点注射的方式免疫6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，免疫剂量为30μg/只；免疫间隔14天，四免后剪尾采血，间接ELISA测定免疫小鼠血清效价，竞争ELISA测定免疫鼠多抗血清的敏感性；选取敏感性最好的免疫小鼠脾脏进行细胞融合，3～5轮亚克隆制备阳性杂交瘤细胞株，体内诱生腹水制备抗ZEN 单克隆抗体和抗OTA单克隆抗体；
（3）免疫荧光探针的合成
以EDC 法分别合成以绿色ZnCdSe/ZnS量子点标记的抗ZEN单克隆抗体以及以橙红色ZnCdSe/ZnS量子点标记的抗OTA单克隆抗体；
（4）完全抗原的合成
通过碳二亚胺法合成的玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN-OVA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA-OVA作为包被原；
（5）将玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN-OVA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA-OVA同时包被在具有高结合力的黑色微量滴定板单个孔中，建立同时定量检测两种真菌毒素的多重荧光免疫分析体系。
在所述步骤（2）中，筛选制得抗ZEN 单克隆抗体mAb A1和抗OTA单克隆抗体mAbA2。
在所述步骤（3）中，以绿色量子点与mAb A1偶联制备出anti-ZEN-mAb-QDs，以橙红色量子点与mAb A2结合制备出anti-OTA-mAb-QDs。
在所述步骤（2）中，首免时免疫原与弗氏完全佐剂混合乳化；加强免疫与弗氏不完全佐剂混合乳化。
可同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测试剂盒，含有
包被微量滴定板：以所述玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN-OVA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA-OVA作为包被原包被的黑色96 孔酶标反应板；
免疫荧光探针：以绿色量子点标记的所述抗ZEN 单克隆抗体，和以橙红色量子点标记的权利要求1所述抗OTA单克隆抗体。
所述ZEN-OVA、OTA-OVA 的最佳包被浓度为2μg/mL。
同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的方法，包括如下步骤：
（1）标准液配置
取ZEN标准母液依次稀释为10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625ng/mL、0.3125 ng/mL、0.15625 ng/mL；取OTA 标准母液依次稀释为50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.125 ng/mL、1.5625 ng/mL、0.78125 ng/mL；
（2）样品预处理
待检样品粉碎后，加提取缓冲液振荡浸提，离心分离后取上清液，以PBS 缓冲液稀释后调节pH 值至7.0，为待测液；
（3）检测
向所述包被微量滴定板的各微孔内同时加入对应稀释倍比的ZEN标准溶液和OTA标准溶液，并加入所述免疫荧光探针，经孵育并清洗后测定各孔的荧光强度值，计算F/F0，拟合或绘制ZEN和OTA标准曲线；
按同样的步骤测定所述待测液的荧光强度值，根据所述ZEN和OTA标准曲线查找或计算待测液中ZEN和OTA的含量。
在所述步骤（2）中，先将待检样品粉碎，过2 mm 筛网，称取5.0g粉碎样品，向其加入25 ml 提取缓冲液，室温下振荡45 分钟；以4000 r/min 的速度室温下离心15 min，取上清液用中速定性滤纸过滤3 次后再以PBS 缓冲液稀释；所述提取缓冲液由甲醇：水按40:60的体积比混合成。
在所述步骤（3）中，在加入50μL的 ZEN标准溶液和OTA 标准溶液或待测液后，同时每孔加入50μL anti-ZEN-mAb-QDs（1:50 稀释）和50 μL anti-OTA-mAb-QDs（1:100 稀释），于37℃孵育1 h；孵育结束后PBST 清洗3 次甩干，每孔加入100 μL 1×PBS 缓冲液，并设置PBS 空白对照；用荧光分光光度计扫描反应后的溶液分别在520nm和610nm激发波长下的荧光发射光谱，测定荧光强度。
与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：
1. 本发明所设计、构建的检测ZEN和OTA抗原的荧光探针实现了ZEN和OTA的定量、灵敏检测，具有较宽的检测范围和较低的检测限，并具有良好的重现性和稳定性。
2. 本发明的生物传感器可同时检测ZEN和OTA，克服了单一检测方法的方案繁琐，操作步骤复杂，检测成本高、花费的时间长等问题；且两种真菌毒素同时检测互不干扰，准确性高。
3. 本发明操作步骤简单明了，成本低，特异性好，灵敏度高，应用于检测玉米等谷物样品中的玉米赤霉烯酮（ZEN）和赭曲霉毒素A（OTA）的毒素残留具有较好的准确性。
附图说明
图1为本发明实施例中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A包被原ZEN-OVA 和OTA-OVA的紫外扫描光谱鉴定；其中，A图Line M为标准分子量Marker；Line 1为OVA（卵清蛋白）；Line2为ZEN-OVA；B图Line M为标准分子量Marker；Line 1为OVA（卵清蛋白）；Line2为OTA-OVA。
图2为本发明实施例中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A包被原ZEN-OVA 和OTA-OVA的SDS-PAGE鉴定；其中，A图为ZEN偶联后的鉴定结果；Line M为标准分子量Marker；Line1为OVA；Line2为偶联后ZEN-OVA或OTA。B图为OTA偶联后的鉴定结果；Line M为标准分子量Marker；Line1为OVA；Line2为偶联后OTA-OVA。
图3为本发明实施例中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的单克隆抗体的SDS-PAGE鉴定；其中，Line M为标准分子量Marker；Line1为纯化前腹水；Line2为纯化后IgG；A图为抗ZEN 单抗；B图为抗OTA 单抗。
图4为本发明实施例中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的单克隆抗体的效价及敏感性的测定；其中A图和B图为抗ZEN 单抗；C图和D图为抗OTA 单抗。
图5为本发明实施例中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的单克隆抗体的亲和力的测定；其中，A图和B图为抗ZEN 单抗；C图和D图为抗OTA 单抗。
图6为本发明实施例中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A免疫荧光探针mAb-QDs 的鉴定；其中，图A和图B为荧光光谱鉴定；图C为SDS_PAGE鉴定；图D为琼脂糖凝胶电泳鉴定；图E为免疫层析鉴定；其中Line 1为orange-red QDs；Line2为anti-OTA-mAb-QDs；Line3为green QDs；Line4为anti-ZEN-mAb-QDs。
图7为本发明实施例中荧光免疫分析方法测定ZEN 和OTA 标准曲线，其中，A为间接ELISA 方法绘制标准曲线ZEN的标准曲线；B为间接ELISA 方法绘制标准曲线OTA的标准曲线；C为M-FLISA 方法绘制标准曲线ZEN的标准曲线；D为M-FLISA 方法绘制标准曲线OTA的标准曲线。
图8为本发明实施例中样品基质消除曲线，其中，A为直接竞争荧光标记免疫吸附试验检测ZEN在玉米样品基质消除曲线；B为直接竞争荧光标记免疫吸附试验检测OTA在玉米样品基质消除曲线。
图9为本发明实施例中双重荧光免疫分析方法的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂、原料如无特别说明，均为市售常规产品；所涉及的检测、测试及制备方法，如无特别说明，均为常规方法。
完全抗原指同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原物质，即能刺激机体的免疫系统产生抗体和/或致敏淋巴细胞的性能，也能与相应的免疫应答产物发生特异性结合的物质；如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素、动物血清等，既能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与其在体内、体外发生特异性结合反应。
免疫学检测法是将抗原或抗体作为识别元件检测样品中是否存在真菌毒素以及其含量，实现对目标物的定性和定量检测，例如放射免疫法（Radioimmunoassay，RIA）、酶联免疫吸附测定法、胶体金免疫层析法（Gold-immune chromatographic assay，GICA）。
量子点又称半导体纳米粒子，是一种新型纳米材料，一般为球形或类球形，通常由Ⅱ-Ⅵ族、Ⅳ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成，量子点作为一种新型荧光染料具有量子限域效应、宽的激发波长和窄的发射波长以及良好的荧光稳定性和生物相容性等特点。量子点作为荧光探针已经在多个学科领域得到应用，荧光标记免疫分析（Fluorescence labeled immunosorbent assay，FLISA）又称荧光免疫吸附法，是将荧光检测技术与抗原抗体反应相结合的标记免疫技术。以量子点作为标记染料，通过调节量子点的粒径或改变组成材料，可获得具有不同发射波长和颜色的量子点。多色量子点可同时标记多种抗体或抗原，具有显著的多路复用能力，可用于同时检测多种真菌毒素。
实施例一：玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A完全抗原的合成与鉴定
通过碳二亚胺（EDC）法合成的玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN-OVA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA-OVA作为包被原；经紫外扫描（图1）及SDS-PAGE电泳（图2）鉴定，结果显示完全抗原ZEN-OVA和OTA-OVA偶联成功。
实施例二：抗玉米赤霉烯酮和抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备及鉴定
1. 免疫原的合成与鉴定
分别采用肟化法和碳二亚胺法合成免疫原玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN- BSA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA-BSA作为免疫原；经紫外扫描及SDS-PAGE电泳进行鉴定后使用。
2. 单克隆抗体的制备
分别选择ZEN-BSA和OTA-BSA作为免疫原，采取皮下多点注射的方式免疫6～8周龄的雌性Balb/c 小鼠，免疫剂量为30μg/只；首免时免疫原与弗氏完全佐剂混合乳化；加强免疫与弗氏不完全佐剂混合乳化；免疫间隔为14天，四免后剪尾采血，间接ELISA测定免疫小鼠血清效价，竞争ELISA测定免疫鼠多抗血清的敏感性(IC50)；选取敏感性最好的免疫小鼠脾脏进行细胞融合，3～5轮亚克隆制备阳性杂交瘤细胞株（，体内诱生腹水分别制备得到抗ZEN 单克隆抗体mAb A1（4D7）和抗OTA单克隆抗体mAb A2（2G3）。
3. 单抗浓度及纯度的鉴定
用NaroDrop 2000c 分光光度计测得抗ZEN 单抗的浓度为4.12mg/mL，抗OTA 单抗的浓度为1.28 mg/mL。纯化效果如图3所示，一条为重链带约为50 kDa，另一条为轻链带约为25 kDa。
4. 单抗效价及敏感性的测定
抗ZEN 单抗的效价为1：5.12×105（图4A），根据抑制曲线，计算其IC50为0.158 ng/mL（图4B）；抗OTA 单抗的效价为1：2.56×105（图4C），根据抑制曲线，计算其IC50 为7.178ng/mL（图4D）；结果证明所获得的单抗灵敏度高、特异性强。
5. 单抗亲和力的测定
通过间接ELISA 方法得到亲和常数回归曲线，如图5A所示，单抗4D7 的亲和常数为2.2×109 L/mol；如图5B所示，单抗2G3 的亲和常数为1.7×109 L/mol。
实施例三：玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A抗原的免疫探针的制备
1. 免疫荧光探针的合成
选用EDC 法分别合成以绿色ZnCdSe/ZnS（核/壳）量子点标记的抗ZEN单克隆抗体（anti-ZEN-mAb-QDs）以及以橙红色ZnCdSe/ZnS（核/壳）量子点标记的抗OTA单克隆抗体（anti-OTA-mAb-QDs）。
以绿色ZnCdSe/ZnS（核/壳）量子点和抗ZEN 单克隆抗体的结合为例，具体操作如下：
（1）取5μL绿色QD（s 8μM）和15.3 μL、1 mg/mL的EDC（QDs:EDC=1:2000）混合，EDC活化量子点的羧基，置于水平摇床25℃避光反应0.5 h；
（2）加入7.32 μL 抗ZEN 单克隆抗体（QDs:mAb=1:5），用PB 缓冲液补加总体积至100 μL，继续避光反应3 h；
（3）加入10 μL、100 mg/mL 的BSA 封闭液，最后避光反应0.5 h，合成anti-ZEN-mAb-QDs 荧光探针，避光保存于4℃。
采取同样的方法合成anti-OTA-mAb-QDs，不同的是选择橙红色ZnCdSe/ZnS量子点与抗OTA 单克隆抗体结合，且结合比例QDs:mAb=1:10。
免疫荧光探针合成后分别经琼脂糖凝胶电泳、SDS-PAGE、荧光光谱及免疫层析鉴定。
2. 免疫荧光探针的鉴定
（1）荧光光谱鉴定
将QDs（绿色）、anti-ZEN-mAb-QDs、QDs（橙红色）、anti-OTA-mAb-QDs稀释为1:100，加入黑色96 孔酶标板中，通过多功能酶标仪测定溶液的荧光光谱，设定激发波长为300nm，发射波长为450 nm-700nm，波长间隔设置为5 nm，观察偶联前后的峰值是否发生变化。荧光光谱结果如图6A和6B所示，结果显示QDs（绿色）、anti-ZEN-mAb-QDs、QDs（橙红色）和anti-OTA-mAb-QDs 的荧光光谱，mAb-QDs 的特征荧光发射峰与游离量子点相比没有明显的位移。
（2）SDS-PAGE鉴定
取3 μL 样品溶液QDs（绿色）、anti-ZEN-mAb-QDs、QDs（橙红色）、anti-OTA-mAb-QDs 和7 μL 1×PBS、5μL 丙三醇完全混匀，最后120 V、30 min电泳，结束后将胶块置于透射紫外观察器扫描并拍照记录，结果如图6C所示，结果表明在相同条件下，mAb-QDs的迁移速度比游离量子点的迁移速度慢，说明偶联成功。
（3）琼脂糖凝胶电泳鉴定
将1%琼脂糖凝胶（无Gelred）加热至液体均匀透明，倒入凝胶制备槽内，向样品孔中分别加入3μL 样品溶液QDs（绿色）、anti-ZEN-mAb-QDs、QDs（橙红色）、anti-OTA-mAb-QDs，100 V、20 min 进行电泳。结束后将胶块置于透射紫外观察器扫描，观察样品电泳速度的快慢，判断是否偶联成功。结果如图6D所示，结果表明在相同条件下，mAb-QDs的迁移速度比游离量子点的迁移速度慢，说明偶联成功。
（4）免疫层析鉴定
分别取2 μL 抗原ZEN-OVA 和OTA-OVA 用移液器点到试纸条测试线（T 线）上并进行干燥处理，质控线（C 线）上涂有金黄色葡萄球菌A 蛋白（SPA），同时取游离量子点作为空白对照，与anti-ZEN-mAb-QDs、anti-OTA-mAb-QDs分别加入酶标板中（样品均为1:100 稀释）。由于毛细作用，样品溶液向前泳动与抗原结合，3～5 min 后在手提式紫外灯下观察，结果如图6E所示，anti-ZEN-mAb-QDs和anti-OTA-mAb-QDs组T 线和C 线同时出现荧光，证明偶联成功。
实施例四：基于双重荧光免疫分析构建玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A抗原检测体系
1. 最佳包被浓度和荧光探针稀释倍数的探索
探索最佳的包被浓度和mAb-QDs 的最佳稀释倍数，以玉米赤霉烯酮为例，具体操作如下：
（1）包被：用CBS 缓冲液将ZEN-OVA 分别稀释至0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL，添加到黑色96 孔酶标板中（100 μL/孔）于4℃包被过夜；
（2）弃去包被液，PBST 清洗3 次后甩干；
（3）封闭：每孔加入200μL 5%脱脂奶，于37℃封闭2 h；
（4）弃去封闭液，PBST 清洗3 次后甩干；
（5）一抗：将anti-ZEN-mAb-QDs 按照1：50、1：100、1：200 进行稀释，于37℃孵育1h，以上溶液均用经0.22 μM 滤膜过滤的1×PBS 缓冲液稀释；
（6）弃去一抗，PBST 清洗5 次后甩干；
（7）读数：每孔加入100 μL 1×PBS 缓冲液，同时用1×PBS 作为空白对照，使用多功能酶标仪测定每孔的荧光值。
（8）结果
棋盘法确定最佳的抗原包被浓度和mAb-QDs 的稀释倍数，结果如表1和2 所示，对于玉米赤霉烯酮，包被抗原的浓度为2μg/mL，anti-ZEN-mAb-QDs的最佳稀释比例为1：50；对于赭曲霉毒素A，包被抗原的浓度为2μg/mL，anti-OTA-mAb-QDs 的最佳稀释比例为1：100。
表1 棋盘法探索最佳包被浓度和anti-ZEN-mAb-QDs 的稀释倍数
Figure 887539DEST_PATH_IMAGE001
。
表2 棋盘法探索最佳包被浓度和anti-OTA-mAb-QDs 的稀释倍数
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.标准品的制备及标准曲线的绘制
稀释液的溶剂为PBS，ZEN标准溶液及其浓度为100ng/ml；OTA 标准溶液及其浓度为100ng/ml；pH值为7.0～7.4。实际检测时，每孔分别加入50μL倍比稀释的ZEN标准溶液（10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.15625 ng/mL）和50μL 倍比稀释的OTA 标准溶液（50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625，0.78125 ng/mL），同时每孔加入50μL anti-ZEN-mAb-QDs（1:50 稀释）和50μL anti-OTA-mAb-QDs（1:100 稀释），于37℃孵育1 h；孵育结束后PBST 清洗3 次甩干，每孔加入100 μL 1×PBS 缓冲液，并设置PBS 空白对照；设置激发波长450 nm和发射波长520 nm，测量每孔的荧光强度值，计算F/F0，绘制标准曲线。F=Fsample-Fblank,F0=Fcontrol-Fblank（Fsample 代表含有标准溶液孔的荧光值、Fcontrol 代表无标准溶液孔的荧光值、Fblank 代表空白对照孔的荧光值），按照间接ELISA 方法绘制标准曲线，计算检测ZEN 和OTA 的IC50 值。
结果如图7所示，测定ZEN 的IC50 为0.034ng/mL(图7A)，检出限为0.00015 ng/mL，检测范围为0.00015～48.86 ng/mL（抑制浓度为10%～80%）。检测OTA 的IC50为1.175 ng/mL（图7B），检出限为0.049 ng/mL，检测范围为0.049～84.14 ng/mL。与传统的ic-LISA 方法（表3）相比，使用相同的抗体，基于多色量子点的M-FLISA 的灵敏度提高了4～6 倍，检测限有很大程度的降低。
真菌毒素之间的非干扰检测对M-FLISA 的准确靶点分析具有重要意义。为了探索交叉反应，在黑色酶标板上包被一种抗原，同时加入两种标记抗体和一种毒素。用对应的最大发射波长对每个目标进行单独分析。检测ZEN 的IC50 为0.035 ng/mL（图7C），检测OTA 的IC50 为1.18 ng/mL（图7D）。两种IC50值几乎相同，变化可以忽略不计。另外每条校准曲线都是单独建立的，两种方法之间没有显著性差异。
表3比较ic-ELISA 和M-FLISA 的分析结果
Figure 411537DEST_PATH_IMAGE003
。
3.多重荧光免疫分析方法的评估及验证
由于两种量子点的荧光光谱略有重叠，在实际操作中可能会出现分析物间交叉反应（CR）的假结果。为了探索这一交叉反应，在黑色酶标板上仅包被一种抗原（ZEN-OVA 或OTA-OVA），同时加入两种标记抗体和一种真菌毒素溶液，用对应的最大发射波长对每种毒素进行单独分析。
（1）样品预处理的方法如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
首先将玉米样品通过高速均质机粉碎并通过2 mm 滤网过滤，称取5.0g 细磨样品加入到50 ml 离心管中；
Figure 597799DEST_PATH_IMAGE005
加入25 ml 提取缓冲液（甲醇：水，40:60 v/v），室温下溶液在水平摇床上完全振荡45 分钟；
Figure DEST_PATH_IMAGE006
样品以4000 r/min 的速度室温离心15 min，取上清液用中速定性滤纸过滤3次；
Figure DEST_PATH_IMAGE007
滤液用1×PBS 缓冲液稀释，稀释5、10、15、20 倍用于探索玉米赤霉烯酮的最佳稀释倍数，稀释3、6、9 倍用于探索赭曲霉毒素A 的最佳稀释倍数，最后将稀释的待测样品溶液用0.1 mol/L HCl 调节pH 值至7.0。
（2）样品最佳稀释倍数的确定
为了消除基质效应的影响，用直接竞争荧光标记免疫吸附试验探索了样品的最佳稀释倍数，以检测ZEN为例，将稀释过的玉米样品提取液代替PBS 缓冲液，具体操作如下：
Figure 133953DEST_PATH_IMAGE004
包被、封闭参照步骤1优化的最佳条件进行，仅包被ZEN-OVA一种抗原；
Figure 620429DEST_PATH_IMAGE005
封闭结束后再次PBST 清洗3 次后甩干，每孔加入50 μL 经玉米样品提取液倍比稀释的ZEN 标准溶液（10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625 ng/mL），同时每孔加入50 μL anti-ZEN-mAb-QDs（1:50 稀释），于37℃孵育1 h，
Figure 177313DEST_PATH_IMAGE006
孵育结束后PBST 清洗3 次甩干，每孔加入100 μL 1×PBS 缓冲液，并设置PBS 空白对照；
Figure 116450DEST_PATH_IMAGE007
设置激发波长450 nm 和发射波长520 nm，测量每孔的荧光强度值，计算F/F0，绘制标准曲线，当曲线与以PBS 作为缓冲液构建的曲线无法区分时，则该稀释倍数所产生的基质效应影响最小。以同样的方法探索赭曲霉毒素A 的最佳稀释倍数。
Figure DEST_PATH_IMAGE008
OTA方法与ZEN操作相同。
（3）加标回收实验
取处理过的最佳样品稀释液经人工同时添加ZEN 和OTA，含量设置为3 个浓度梯度，两种真菌毒素均为5、10、20 ng/mL，每次均设置6 个平行试验，检测荧光值，代入建立的工作曲线计算出回收ZEN 和OTA 的浓度并计算回收率，评价该方法的可行性。样品回收率和变异系数按以下公式计算：
样品回收率（Recovery）=（样品检测浓度/样品添加浓度）×100%
变异系数（CV）=（标准差SD/平均值Mean）×100%
（4）实验结果分析
为了消除基质效应的影响，用直接竞争荧光标记免疫吸附试验探索了样品的最佳稀释倍数。根据图8的结果，当ZEN 和OTA 的样品溶液分别稀释20倍（图8A）和9 倍（图8B）时，基质辅助标准曲线与PBS 标准曲线几乎无法区分，样品基质几乎不干扰灵敏度，说明提取方法是合理的。在加标回收实验中，空白玉米样品稀释液分别加入5、10、20 ng/mL 的ZEN和OTA，每个加标浓度设置6 个重复。测定了玉米中人工添加的ZEN 和OTA 的含量。用添加了不同浓度真菌毒素的玉米样品对建立的多重FLISA 进行了验证。表4.6 中ZEN的回收率为93.15%-101.90% ， 变异系数为2.7%-8.86% ， OTA 的回收率为95.29%-102.43%，变异系数为3.51%-6.22%。结果表明，多重荧光免疫分析具有较高的准确度和精密度。
表4 M-FLISA 检测ZEN 和OTA 在玉米中的回收率
Figure DEST_PATH_IMAGE009
。
（5）高效液相色谱验证
为了验证所建立的多重荧光免疫分析的可靠性，选择高效液相色谱（HPLC）进行验证。人工同时添加5、10、20 ng/mL 的ZEN、OTA 玉米样品用于HPLC方法检测，色谱条件如下：
①色谱柱：Syncronis C18 柱（250 mm×4.6 mm, 5μm）；
②流动相：0.5%冰乙酸：乙腈：甲醇=10：45：45（体积比）；
③柱温：35℃；
④流速：0.7 mL/min；
⑤检测波长：激发波长333 nm，发射波长470 nm；
⑥进样量：10.0 μL。
对高效液相色谱法的回收率进行了研究，结果如表5所示，玉米样品中的对ZEN 的加标回收率为87.31%～93.32%，变异系数（CV）为87.31%～93.32%，对OTA 的回收率为85.38%～96.15%，变异系数为4.05%～7.72%。两种结果之间的良好一致性表明所建立的多重荧光免疫分析与高效液相色谱一样具有可靠性。
表5 HPLC检测ZEN 和OTA 在玉米中的回收率
Figure DEST_PATH_IMAGE010
。
（6）双重荧光免疫分析方法的建立
多重荧光免疫分析的原理是基于固定化抗原与真菌毒素的标准溶液或样品稀释液竞争结合到量子点标记的抗体上，其流程如图9所示，具体操作步骤如下：
① 用CBS 缓冲液将ZEN-OVA、OTA-OVA 均稀释为2 μg/mL，同时加入到高结合容量的黑色96 孔酶标板中（100 μL/孔），于4℃包被过夜；
② 弃去包被液，PBST 清洗3 次后甩干，加入5%脱脂奶封闭液(200 μL/孔)于37℃封闭2 h；
③ 封闭结束后PBST 清洗3 次甩干，每孔分别加入50 μL 倍比稀释的ZEN标准溶液（10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.15625 ng/mL）和50μL 倍比稀释的OTA 标准溶液（50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625，0.78125 ng/mL），同时每孔加入50μL anti-ZEN-mAb-QDs（1:50 稀释）和50 μL anti-OTA-mAb-QDs（1:100 稀释），于37℃孵育1 h；
④ 孵育结束后PBST 清洗3 次甩干，每孔加入100 μL 1×PBS 缓冲液重新溶解，并设置PBS 空白对照；
⑤ 设置激发波长为450 nm，发射波长1 为520 nm，发射波长2 为610 nm，在相同的激发波长和不同的发射波长下测量每孔的荧光值，以确定分析物在每孔中的荧光强度，计算F/F0, F=Fsample-Fblank, F0=Fcontrol-Fblank（Fsample 代表含有标准溶液孔的荧光值、Fcontrol 代表无标准溶液孔的荧光值、Fblank 代表空白对照孔的荧光值），按照间接ELISA 方法绘制标准曲线，计算检测ZEN 和OTA 的IC50 值。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明构思的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，或者是对相关方法、步骤及材料进行等同替代，从而形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

Claims (9)

1.一种玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）免疫原的合成
分别采用肟化法和碳二亚胺法合成免疫原玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN- BSA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA-BSA作为免疫原；
（2）单克隆抗体的制备
分别以所述ZEN-BSA和OTA-BSA作为免疫原，采取皮下多点注射的方式免疫6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，免疫剂量为30μg/只；免疫间隔14天，四免后剪尾采血，间接ELISA测定免疫小鼠血清效价，竞争ELISA测定免疫鼠多抗血清的敏感性；从中选取敏感性最好的免疫小鼠脾脏进行细胞融合，经3～5轮亚克隆制备阳性杂交瘤细胞株，体内诱生腹水制备抗ZEN单克隆抗体和抗OTA单克隆抗体；
（3）免疫荧光探针的合成
以EDC 法分别合成以绿色ZnCdSe/ZnS量子点标记的抗ZEN单克隆抗体以及以橙红色ZnCdSe/ZnS量子点标记的抗OTA单克隆抗体；
（4）完全抗原的合成
通过碳二亚胺法合成的玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN-OVA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA-OVA作为包被原；
（5）将玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN-OVA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA-OVA同时包被在具有高结合力的黑色微量滴定板单个孔中，建立同时定量检测两种真菌毒素的多重荧光免疫分析体系。
2.根据权利要求1所述的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测体系的构建方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，筛选制得抗ZEN 单克隆抗体mAb A1和抗OTA单克隆抗体mAb A2。
3.根据权利要求2所述的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测体系的构建方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，以绿色量子点与mAb A1偶联制备出anti-ZEN-mAb-QDs，以橙红色量子点与mAb A2结合制备出anti-OTA-mAb-QDs。
4.根据权利要求1所述的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测体系的构建方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，首免时免疫原与弗氏完全佐剂混合乳化；加强免疫与弗氏不完全佐剂混合乳化。
5.一种用于同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测试剂盒，含有
包被微量滴定板：以权利要求1中所述玉米赤霉烯酮完全抗原ZEN-OVA和赭曲霉毒素A完全抗原OTA-OVA作为包被原包被的黑色96 孔酶标反应板；
免疫荧光探针：以绿色量子点标记的权利要求1所述抗ZEN 单克隆抗体，和以橙红色量子点标记的权利要求1所述抗OTA单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的用于同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双重荧光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述ZEN-OVA、OTA-OVA 的最佳包被浓度为2μg/mL。
7.一种同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的方法，包括如下步骤：
（1）标准液配置
取ZEN标准母液依次稀释为10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL、0.3125 ng/mL、0.15625 ng/mL；取OTA 标准母液依次稀释为50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.125 ng/mL、1.5625 ng/mL、0.78125 ng/mL；
（2）样品预处理
待检样品粉碎后，加提取缓冲液振荡浸提，离心分离后取上清液，以PBS 缓冲液稀释后调节pH 值至7.0，为待测液；
（3）检测
向权利要求5所述包被微量滴定板的各微孔内同时加入对应稀释倍比的ZEN标准溶液和OTA 标准溶液，并加入权利要求5中所述免疫荧光探针，经孵育并清洗后测定各孔的荧光强度值，计算F/F0，拟合或绘制ZEN和OTA标准曲线；
按同样的步骤测定所述待测液的荧光强度值，根据所述ZEN和OTA标准曲线查找或计算待测液中ZEN和OTA的含量。
8.根据权利要求7所述的同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，先将待检样品粉碎，过2 mm 筛网，称取5.0g粉碎样品，向其加入25 ml提取缓冲液，室温下振荡45 分钟；以4000 r/min 的速度室温下离心15 min，取上清液用中速定性滤纸过滤3 次后再以PBS 缓冲液稀释；所述提取缓冲液由甲醇：水按40:60 的体积比混合成。
9.根据权利要求7所述的同时检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，在加入50μL的 ZEN标准溶液和OTA 标准溶液或待测液后，同时每孔加入50μL anti-ZEN-mAb-QDs（1:50 稀释）和50 μL anti-OTA-mAb-QDs（1:100 稀释），于37℃孵育1 h；孵育结束后PBST 清洗3 次甩干，每孔加入100 μL 1×PBS 缓冲液，并设置PBS 空白对照；用荧光分光光度计扫描反应后的溶液分别在520nm和610nm激发波长下的荧光发射光谱，测定荧光强度。
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