KR20140092390A - 금속/실리카 코어/쉘 나노입자들, 제조방법 및 이러한 나노입자들을 포함하는 면역크로마토그래피 테스트 장치 - Google Patents

금속/실리카 코어/쉘 나노입자들, 제조방법 및 이러한 나노입자들을 포함하는 면역크로마토그래피 테스트 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 적어도 하나의 코어, 및 작용기들을 포함하는 실리카 쉘로 구성되는 코어/쉘 나노입자에 있어서, 실리카는 표면에, 상기 나노입자를 안정화시키기 위하여 공유 결합되는 안정화제를 포함하는 것을 특징으로 하는 코어/쉘 나노입자에 관한 것이다. 본 발명은 상기 제1 금속 소재로 이루어진 코어, 및 제1 소재와는 다르고, 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제2 소재로 이루어진 금속 쉘로 구성되는 코어/쉘 나노입자에 있어서, 금속 쉘은 임의의 할라이드가 없는 계면활성제로 안정화되는 것을 특징으로 하는, 나노입자에 관한 것이다. 또한 본 발명은 분석물에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함하고, 상기 결합제는 나노입자들에 표지되는 적어도 하나의 분석물을 검출하는 면역크로마토그래피 테스트 장치에 있어서, 나노입자들은 상기 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 적어도 하나의 코어, 및 작용기들을 포함하는 실리카 쉘로 구성되는 것을 것을 특징으로 하는, 면역크로마토그래피 테스트 장치에 관한 것이다

Description

금속/실리카 코어/쉘 나노입자들, 제조방법 및 이러한 나노입자들을 포함하는 면역크로마토그래피 테스트 장치{Metal/silica core/shell nanoparticles, manufacturing process and immunochromatographic test device comprising such nanoparticles}
본 발명은 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 적어도 하나의 코어, 및 작용기들을 포함하는 실리카 쉘로 구성되는 코어/쉘 나노입자들에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 나노입자들을 이용하는 면역크로마토그래피 테스트 장치에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 특히 중간 생성물로서, 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 코어, 및 제1 소재와는 다르고, 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제2 소재로 이루어진 금속 쉘로 구성되는 코어/쉘 나노입자들에 관한 것이다. 또한 상기 발명은 이러한 나노입자들 제조방법에 관한 것이다.
금속 나노입자들에 관한 연구들을 통하여 이러한 입자들의 크기, 형태 및 주변에 따라 놀라운 물성, 화학적 특성 및 생물학적 특성이 밝혀졌다.
더욱 상세하게는, 금속 나노입자들은 면역크로파토그래피 진단 분야에서 특히 흥미로운 광학 특성을 가진다. 예를들면, 현재 금 콜로이드는 속성 면역크로마토그래피 테스트 예컨대 임신 테스트, 암, 바이러스 감염, 내분비 이상 진단 또는 금지약물복용 진단에서 마커 또는 표지로 사용된다.
면역크로마토그래피 테스트는 피검 샘플 (소변, 혈액, 혈장, 타액, 혈청, 공업적 유출액 등)에서 막을 따라 나노- 또는 마이크로-입자들이 모세관 이동하는 현상에 기반한다. <샌드위치> 유형의 테스트에서, 입자들은 먼저 검출 대상 항원에 특이적인 항체와 조합된다. 피검 샘플에서 이러한 항원이 존재하면, 복합체 (입자-항체)는 항원과 착체 (입자-항체-항원)를 형성한다. 착체는 막에서 테스트 라인까지 이동한다. 이후 착체는 테스트 라인에 포획되고, 여기에 항원 및 착체에 특이적인 제2 항체가 고정된다. 양성 반응은 착체 고정화로 형성되는 색상 라인을 관찰함으로써 표현된다. 내적 대조 (internal control)로 테스트 유효성 평가가 가능하다. 또한 예를들면 햅텐 /항원, 렉틴/탄수화물, 아포단백질/보조인자 또는 스트렙타비딘/비오틴 착체들과 같은 다른 유형의 특이적 인식 (recognition)을 이용하는 것이 가능하다. 또한 예를들면 단일 에피토프만을 가지는 분자들 분석에 사용되는 경쟁적 유형의 테스트와 같은 다른 유형의 면역크로마토그래피 테스트가 존재한다. 관련 면역크로마토그래피 테스트들은 양호하게 확립된 방법들 (예를들면 특허출원들 WO 01/57522 또는 WO 2008/030546 참조)로 제작된다. 상이한 항원들에 특이적인 여러 복합체들이 동일한 테스트에 사용되어 이러한 항원들을 동시에 분석할 수 있다.
현재 사용되는 표지들은 착색 (또는 형광) 실리카 또는 라텍스 나노입자들, 반도체 재료 나노입자들 (양자점들) 또는 귀금속 (금 및 은) 구형 나노입자들이다. 이러한 표지들은 여러 기준을 충족하여야 한다:
- 낮은 농도의 바이러스를 검출하기 위하여 상당한 착색력을 가져야 한다;
- 동일 스트립에서 동시에 여러 분자들을 분석하기 위하여 다양한 색상을 가져야 한다;
- 복합체 (나노입자항체)형성 및 정제 단계 전, 과정 및 후에 안정되어야 한다;
- 검출 대상 바이러스 및 결합체를 특이적으로 인식하기 위하여 항체 또는 다른 종들과 용이하고도 강력하게 결합되어야 한다;
- 테스트의 신호 대 잡음비를 줄이기 위하여 양호한 콜로이드 안정성을 가지고 막을 따라 쉽게 이동되어야 한다.
착색 (또는 형광) 글라스 또는 라텍스 나노입자들은 이들 입자 표면 내부에 삽입되거나 및/또는 표면에 있는 유기 형광체 또는 안료로 인하여 착색화 또는 형광이 가능하다. 이들 표지는 두 가지 주요 단점들이 있다. 안료 또는 형광체 분자들은 입자에 언제나 공유 결합되지 않고 입자에서 점차 방출된다. 이로 인하여 입자들의 착색력이 감소되고 테스트의 신호 대 잡음비가 감소된다. 또한, 유기 형광체 및 안료 대부분은 강력한 무극성이다. 따라서, 입자들의 용해도를 저하시키고 입자항체 복합화 반응을 까다롭게 한다.
금속 나노입자들의 광학 특성은 주로 표면 플라즈몬 공명에 기초한다. 이러한 현상은 나노입자들 크기, 형상 및 주변에 따라 달라진다. 플라즈몬 공명 현상은 Mie의 이론에 기재된다 (Jain, P. K.; Lee, K. S.; El- Sayed, I. H.; El-Sayed, J. Phys. Chem. B 2006, 110, 7238-7248). 현재 직경 40 nm 구형 금 나노입자들이 면역크로마토그래피 테스트에 사용된다. 이들 입자는 파장 약 520 nm의 전자기파와의 표면 플라즈몬 공명으로 강력한 적색화를 보인다. 직경 40 nm의 구형 금 나노입자들의 흡수단면적은 유기 안료보다 수십만 배 이상이다. 따라서 이러한 입자들은 강력한 착색력을 가진다.
이방성 금 나노입자들 예컨대 나노로드들은 종횡비 (AR 길이/폭)에 따른 착색화를 보인다. 상이한 색상들 (갈색, 청색 및 녹색)의 금 로드들은 Nikoobakht (Nikoobakht, B.; ElSayed, Chem. Mater. 2003, 15, 1957-1962) 및 Park (Park, K.; Vaia, R. A. Advanced Materials 2008, 20, 3882-3886) 에 기재된 방법들로 합성된다. 동일 용적의 입자들에 있어서, 금 로드들의 흡광 및 산란계수는 구형 금 입자들보다 크다 (Jain, P. K.; Lee, K. S.; El-Sayed, I. H.; El-Sayed, J. Phys. Chem. B 2006, 110, 7238-7248). 로드들은 구형들과 비교하여 2가지 이점들이 있다. AR을 미세하게 조절함으로써 다중화 테스트가 가능한 상이한 색상의 나노로드들 제조가 가능하다. 또한, 로드들 착색력은 동일 용적의 구들보다 더욱 크므로 다른 조건들이 만족되면 더욱 민감한 면역크로마토그래피 테스트가 가능하다. 이러한 다른 조건들은 예를들면 고순도, 양호한 안정성, 항체와의 반응성 및 용출 과정에서 양호한 이동성이다. 단백질 HER2에 대한 면역크로파토그래피 분석을 위하여 금-anti-HER2 로드 복합체를 평가하였다 (Venkataramasubramani, M.; Tang, L.; McGoron, A. J.; Li, C.-Z.; Lin, W.-C.; Magjarevic, R. IFMBE Proceeding 2009, 24, 199- 202). 그러나, 상기 테스트는 항체 및 NaCl 존재에서 금 나노로드들이 응집된다는 것을 보였다. 이러한 유형의 응집 위험성은 로드들의 착색 및 콜로이드 안정성은 응집에 매우 민감하기 때문에 이러한 유형의 면역크로마토그래피 표지 적용을 매우 까다롭게 한다 (Gluodenis, M.; Foss, C. A. J. Phys. Chem. B 2002, 106, 9484-9489). 로드가 응집되는 과정에서, 표면 플라즈몬들이 조합된다. 플라즈몬 스트립들의 공명 주파수는 변경되고 이들의 강도는 크게 줄어든다.
은 나노입자들은 금 나노입자들보다 더욱 높은 소광계수를 가진다 (Thompson, D. G.; Enright, A.; Faulds, K.; Smith, W. E.; Graham, D. Analytical Chemistry 2008, 80, 2805-2810). 가시적 또는 분광학적 분석은 더욱 낮은 농도에서 수행될 수 있고 이들 입자가 이방성인 경우 더욱 그러하므로 결과적으로 은 나노입자들은 면역크로파토그래피 진단용으로 표지로서 양호한 후보이다. 그러나, 은 나노입자들은 불안정하고 이방성 은 나노입자들 합성으로 충분한 단분산 입자들을 얻을 가능성이 없으므로 은은 덜 사용된다.
이방성 및 단분산 나노입자들로 은 나노입자들의 이점들을 가지는 나노입자들을 획득하는 방법은 금 로드들을 은층으로 도포하는 것이다. 이러한 은층은 나노로드들 소광계수를 높이고 층의 두께에 따라 상이한 표지 착색을 얻을 가능성을 부여한다. 다양한 문헌들이 금 로드들에 은층을 형성하는 것에 대하여 기술하고 있다. 알칼리 조건들 (pH>8) 및 음이온모늄 브로마이드 (CTAB) 또는 CTAB - 질산은 및 아스코르브산의 헥사데실디메틸벤질암모늄 클로라이드 혼합물 (BDAC) 존재에서 금 로드들은 시드로 사용된다 (Park, K; Vaia, R.A. Advanced Materials 2008, 20. 3882-3886). Yang은 Ag+ 이온들을 안정화 시키기 위하여 글리세린 완충액을 첨가하고 AgBr 침전을 방지하였다 (Huang, C.-C.; Yang, Z.; Chang, H.-T. Langmuir 2004, 20, 6089-6092; Yang, Z.; Lin, Y.-W.; Tseng, W.-L.; Chang, H.-T. Journal of Materials Chemistry 2005, 15, 2450-2454). 또한 폴리(비닐피롤리돈) (PVP) 및 시트르산나트륨이 각각 CTAB와 함께 계면활성제 및 환원제로 사용되었다 (Liu; GuyotSionnest, P. The Journal of Physical Chemistry B 2004, 108, 5882-5888). 그러나 할로겐화 계면활성제 존재에서 얻어진 은층은 불안정하다. 은층은 약간 백색의 AgBr 침전물을 형성하면서 점차 산화된다. 수일 내지 수주 후, 은층은 완전히 산화된다.
또한, Gorelikov 및 Matsuura는 알칼리 조건들 및 CTAB 및 테트라에톡시실란 (TEOS) 존재에서 금 로드들을 선택적으로 균질 실리카 층으로 도포하는 방법을 발표하였다 (Gorelikov, I.: Matsurra, N. Nano-Lett. 2008, 8, 369-373). 그러나, 상기 방법은 은층은 CTAB 존재에서 산화하므로 금/은 코어/쉘 나노로드들에 직접 적용할 수 없다. 방출된 Ag+ 이온들은 TEOS가수분해 과정에서 산화은 또는 은 입자들을 형성한다. 따라서 상기 방법은 실리카 및 산화은 나노입자들로 부분 도포된 금 로드들 혼합물을 형성한다.
금/메조포러스 실리카/은 코어/쉘/쉘 입자들 또한 공지되었고, Wang (Wang, G.P.; Chen, Z.; Chel, L. Nanoswcale, 3 1756-1759)에서 개시된다. 그러나, 입자들의 은층은 실리카층에 의해 보호되지 않고, 이는 유기실란 부착을 매우 까다롭게 한다.
메조포러스 실리카층으로 도포되는 금 나노로드들 역시 공지되었고, 국소 표면 플라즈몬 공명에 기반하여 (LSPR)O 생체분자 나노센서로서 사용된다 (Wu, C.; Xu, Q.-H. Langmuir, 2009, 25, 9441-9446). 그러나, 이러한 나노센서는 특이적 인식이 가능하지 않다. 실제로, 분자, 글루타티온이 실리카 쉘의 공극 내부로 들어간다. 입자 근처에서 굴절률이 변경되고 입자의 색상 (또는 UV-가시광선 스펙트럼) 또한 변경된다. 공극을 통과하는 분자들은 유사한 효과를 가진다. 따라서 Wu에 기술된 입자들 및 현상은 면역크로파토그래피 진단에 사용될 수 없다.
또한 금/은/실리카 코어/쉘 나노입자들이 알려져 있고, Chen (Chen, X.l Liu, H.; Zhou, X.; Hu, J.; Nanoscale Royal Society of Chemistry UK, Vol. 2, No. 12, November 2010-2010-11), p. 2841-2846에 기재된다. 상기 문헌에는 3아미노프로필트리메톡시실란 (APTMS)으로 실리카 관능화에 대하여 기재된다. 그러나, 실리카 (실라놀)음전하는 APTMS 아민의 양전하로 중화되므로 상기 화합물은 실리카 입자들을 응집하는 것으로 알려져 있다. 이러한 현상은 문헌 (Bagwe, R.P., Hilliard, L.R.; Tan, W.; Langmuir 2006, 22, 4357)에 기재되어 있다. 얻어진 금/은/실리카 코어/쉘 나노입자들은 따라서 안정되지 않고 응집된다.
US 2010/150828 출원은 금/실리카 코어/쉘 나노입자들을 기재한다. 상기 문헌은 특이적 작용기들을 가지는 실리카로 도포되는 금 나노입자들의 조합이 가능하다고 언급한다. 그러나, 그룹의 유형 또는 실리카층 표면의 관능화를 가능하게 하는 방법에 대하여는 지적하지 않는다. 금속 입자를 안정화시키기 위하여 기술되는 계면활성제 예시들 거의가 실리카에 공유 결합할 수 없다.
따라서 본 발명의 목적은 상기 문제점들을 해결하기 위하여 금속/실리카 코어/쉘 나노입자들 더욱 상세하게는 기존 장치 대비하와 감도가 개선된 면역크로마토그래피 테스트 장치 제작이 가능한 금/실리카 나노입자들을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 금속/금속/실리카 코어/쉘/쉘 나노입자들 더욱 상세하게는 기존 장치 대비하와 감도가 개선된 면역크로마토그래피 테스트 장치 제작이 가능한 금/은/실리카 나노입자들을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 응집되지 않고 광범위한 pH 범위에서 양호한 분산성을 제공하는 안정한 금속/실리카 코어/쉘 나노입자들을 제안하는 것이다.
이러한 목적을 위하여, 코어/쉘 나노입자가 제안되고, 이는 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 적어도 하나의 코어, 및 작용기들을 포함하는 실리카 쉘로 구성된다.
본 발명에 의하면, 실리카는 상기 나노입자를 안정화시키기 위하여 표면에서 공유 결합되는 안정화제를 포함한다.
또한 본 발명은 이러한 코어/쉘 나노입자들 제조방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
- 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제1 금속 소재로 이루어진 나노입자들 제조단계,
- 상기 나노입자들에 실리카 쉘 형성단계,
- 실리카에 작용기들의 그라프트 (graft)단계, 및
- 실리카 표면에, 상기 나노입자들을 안정화시키는 조제 (agent) 그라프트 단계로 구성된다.
또한 본 발명은 면역크로마토그래피 테스트 장치에서 이러한 코어/쉘 나노입자들을 생체분자의 마커로 이용하는 것에 관한 것이다.
또한 본 발명은 코어/쉘 나노입자에 관한 것이고, 이는 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 코어, 및 제1 소재와는 다르고, 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제2 소재로 이루어지고 임의의 무-할라이드 계면활성제에 의해 안정화되는 금속 쉘로 구성된다.
또한 본 발명은 이러한 코어/쉘 나노입자들의 안정한 현탁물 제조방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
- 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 코어, 및 제1 소재와는 다르고, 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제2 소재로 이루어 금속 쉘로 구성되고, 할라이드 상대 이온을 가지는 계면활성제 존재에서 제1 소재의 나노입자들 주위에 제2 소재의 층을 형성하여 코어/쉘 나노입자들을 제조하는 단계,
- 할라이드 상대이온을 가지는 계면활성제를 대체하기 위하여 무-할라이드 계면활성제를 첨가하는 단계, 및
- 할라이드 상대 이온을 가지는 상기 계면활성제를 제거하는 단계로 구성된다.
또한 본 발명은 적어도 하나의 분석물을 검출하기 위한 면역크로마토그래피 테스트 장치에 관한 것이고, 이는 분석물에 결합하는 특이적 조제를 포함하고, 상기 결합제는 나노입자들에 의해 표지되고 (marked), 상기 나노입자들은 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 적어도 하나의 코어, 및 작용기들을 포함하는 실리카 쉘로 구성된다.
상기 발명은 도면들을 참조하여 제시되는 실시예들 및 상세한 설명을 독해하면 더욱 잘 이해될 것이다:
- 도 1은 본 발명에 따라 무-할라이드 계면활성제로 안정화되는 금/은 코어/쉘 나노입자들의 UV-가시광선 스펙트럼과 할라이드 상대 이온을 가지는 계면활성제로 안정화되는 나노입자들을 비교한 것이다;
- 도 2a 및 2b는 실시예 3에 해당되는 본 발명에 따라 제조되는 금/은/실리카 코어/쉘/쉘 나노입자들의 TEM 사진들이고 도 2c는 비교예 4에 따라 제조되는 금/은/실리카 코어/쉘/쉘 나노입자들의 TEM 사진이고;
- 도 3은 실시예들 6 및 7에 따른 입자들의 pH에 대한 제타전위를 도시한 것이다.
본 발명은 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 적어도 하나의 코어, 및 실리카 쉘로 구성되는 코어/쉘 나노입자들에 관한 것이다.
상기 제1 금속 소재는 바람직하게는 금, 은, 구리, 팔라듐, 백금, 로듐 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명에 의한 코어/쉘 나노입자들의 코어를 형성하는 나노입자들은 구형 또는 원통형에서 선택되는 형상을 가진다. 구형의 경우, 코어 형성 나노입자 직경은 바람직하게는 1 내지 100 nm이다. 원통 또는 로드 형상의 경우, 치수 및 분포는 다양하다. 로드 폭은 1 nm 내지 200 nm이고, 바람직하게는 1 nm 내지 30 nm이고 로드 길이는 2 nm 내지 400 nm이고, 바람직하게는 10 nm 내지 100 nm이며, 종횡비 (AR, 길이/폭)는 1 내지 7이다. 이러한 구들 및 로드들은 당업자에게 공지된 방법들로 제조된다.
바람직하게는, 본 발명에 의한 코어/쉘 나노입자들의 코어는 금 나노입자, 더욱 상세하게는 로드 형상의 금 나노입자이다.
본 발명의 대안적 실시태양에 의하면, 상기 코어/쉘 나노입자는 코어로 사용되는 제1 소재와는 상이하고 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제2 소재, 상기 제2 소재로 제조되는 금속 중간 쉘을 더욱 포함한다.
바람직한 실시태양에 의하면, 중간 쉘은 은으로 이루어진다. 바람직한 실시태양에 의하면, 나노입자의 코어는 금으로 이루어지고 중간 쉘은 은으로 이루어진다.
중간 금속 쉘은 균질하거나 그렇지 않은 1 nm 내지 200 nm, 바람직하게는 100 nm 미만의 두께를 가진다.
또한, 실리카 쉘은 균질하거나 그렇지 않은 1 nm 내지 300 nm, 바람직하게는 10 nm 내지 200 nm의 두께를 가진다.
바람직하게는, 실리카 쉘 두께는 금속 입자 인근 주변 굴절률 변화로 인한 또는 표면 플라즈몬의 입자간 커플링으로 인한 표지 착색화 변화를 방지하기 위하여 10 nm 보다 크다.
바람직하게는, 실리카 쉘 두께는 너무 급격한 입자들의 경사 분리 및 테스트 막에서의 불량 이동을 방지하기 위하여 200 nm 미만이다.
실리카는 다공성이거나 치밀하다.
쉘 형성 실리카는 작용기들을 포함한다.
바람직하게는, 실리카 개질 작용기는 생체분자와 상호 작용할 수 있다. 더욱 상세하게는, 실리카를 개질하는 상기 작용기들은 분석물에 특이적인 결합 또는 인식 조제인 생체분자와 복합체를 형성할 수 있다. 바람직하게는, 작용기들로 인하여 검출 대상 항원에 특이적인 항체의 복합화가 가능하다.
이러한 작용기들 예를들면 아민, 이민, 우레아, 히드라진, 말레이미드, 이소시아네이트, 티올, 이황화물, 카르복실산, 산무수물, 니트릴, N-히드록시숙신이미드 에스테르, N히드록시숙신이미드 에스테르, 에폭시드, 이미도에스테르, 포스폰산, 히드록실, 알데히드, 케톤, 활성화 수소, 아지드 또는 알킨 작용기이다.
또한, 본 발명에 의하면, 실리카는 표면에, 상기 나노입자를 안정화시키기 위하여 공유 결합되는 안정화제들을 포함한다.
바람직하게는, 안정화제는 나노입자들이 생체분자와 커플링 또는 복합화 반응 과정에서 화학적으로 불활성인 것이 선택된다.
바람직하게는, 상기 안정화제는 하전된 및/또는 극성 사슬이고 이로써 강력한 음의 제타전위를 보유하거나 또는 입체장애로 인하여 나노입자들 또는 복합체들의 응집이 방지된다. 화학적 불활성 극성 사슬들은 넓은 범위의 pH에 걸쳐 음 및 양전하들을 각각 보유하는 낮은 또는 높은 pKa의 이온성 그룹을 가지는 유기 사슬들일 수 있다. 실리카의 실라놀 그룹은 넓은 범위의 pH에 걸쳐 음전하를 가지므로 낮은 pKa의 그룹이 바람직하다. 양의 그룹을 그라프트 하면 실리카 표면의 음전하를 중화하고 입자들이 응집된다. 낮은 pKa를 가지는 그룹의 예시로는 메틸 포스포네이트 및 술포네이트이다. 4차 아민들은 높은 pKa를 가지는 그룹의 예시들이다. 비-이온성 극성 사슬들 또한 사용될 수 있다. 예를들면, 폴리에테르 사슬들 예컨대 폴리에틸렌 글리콜들은 본 발명에 의한 나노입자들 응집에 대항하데 유효하다.
바람직하게는, 상기 작용기들 및 상기 안정화제은 각각 실리카에 그라프트 가능한 유기실란에서 유도된다. 더욱 상세하게는, 본 발명에 의하면, 상기 작용기들 또는 상기 안정화제 외에도, 실리카 쉘에 유기실란을 축합 시킬 수 있는 하나 이상의 가수분해성 작용기들을 포함하는 유기실란 혼합물이 사용된다.
가수분해성 작용기들은 예를들면 모노-, 디- 또는 트리- 알콕시실란, 모노-, 디- 또는 트리-아세톡시실란 모노-, 디- 또는 트리-클로로실란 또는 이미 가수분해된 유기실란 예컨대 모노-, 디- 또는 트리-실라놀이다.
가수분해성 작용기들 외에도 유기실란은 하나 이상의 작용기들 또는 하나 이상의 안정화제를 가진다.
또한 본 발명은 코어/쉘 나노입자들 제조방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
- 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제1 금속 소재로 이루어진 나노입자들 제조단계,
- 상기 나노입자들에 실리카 쉘 형성단계,
- 실리카에 작용기들 그라프트 단계, 및
- 실리카 표면에, 상기 나노입자들 안정화 조제 그라프트 단계로 구성된다.
바람직하게는, 작용기들 및 안정화제를 실리카에 그라프트 하는 것은 상기 작용기들 함유 유기실란 및 상기 안정화제 함유 유기실란의 축합 반응에 의해 달성된다.
이러한 유기실란은 상기되었다.
유기실란의 가수분해 및 축합은 극성 또는 무극성 용매의 용액에서 산 또는 염기 촉매로 달성된다. 또한 반응 온도도 반응에 영향을 미친다. 용매 또는 용매 혼합물뿐 아니라 용액 pH 선택은 실리카 표면에 선택적으로 유기실란 응축을 유발하도록 및 기능화 입자들에서 분리하기 어려운 실리카 겔 형성을 피하도록 최적화된다. 로드/유기실란 및 화학적 활성 유기실란/불활성 유기실란 비율의 선택은 실리카 쉘 작용화를 극대화하고 복합화 반응에서 콜로이드 안정성 및 반응성 간의 양호한 균형을 획득하기 위하여 선택된다. 마지막으로, 용액 온도를 비점까지 증가시켜 유기실란 그라프트를 가속 및 최적화 시킨다. 마지막으로, 하나 만의 가수분해성 작용기를 가지는 유기실란 예컨대 트리메틸메톡시실란 또는 트리메틸클로로실란은 표면을 부동태화 하기 위하여 사용될 수 있다.
과량의 비-그라프트화 유기실란은 예를들면 원심분리, 초미세여과, 투석, 증류, 추출 또는 크로마토그래피 (교환 또는 배제 크로마토그래피)로 제거된다.
본 발명에 의한 나노입자들이 상기된 중간 금속 쉘을 포함하면, 본 발명에 의한 나노입자들 제조방법은, 실리카 쉘 형성 전에, 할라이드 상대이온을 가지는 계면활성제 존재에서 제1 소재와는 다르고, 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제2 소재로 이루어진 중간 금속 쉘 형성단계를 포함한다. 이러한 계면활성제는 예를들면 음이온모늄 브로마이드 (CTAB)이다.
은층은 문헌에 기재된 방법들에 따라 적층된다. 코어 형성 나노입자들 표면에서 질산은이 선택적으로 환원된다. 예를들면 황산은 또는 시트르산은과 같은 기타 은 염들이 사용될 수 있다. 아스코르브산이 환원제로 사용된다. 환원 속도는 용액 pH로 조절된다. 염기성 용액 예컨대 예를들면 소다 또는 암모니아 용액을 첨가하여 pH를 높인다. 예를들면 히드로퀴논, 글루코스 및 시트르산과 같은 낮은 환원력을 가지는 기타 분자들이 또한 환원제로 사용된다. 은 환원 과정에서, 나노입자들은 CTAB 또는 CTAB/BDAC 혼합물 (헥사데실디메틸벤질암모늄 클로라이드)로 안정화된다.
구형 금 (은) 나노입자들은 약 500 (400) 내지 560 (500) nm의 플라즈몬 밴드를 보인다. 플라즈몬 밴드 파장은 입자 크기에 따라 다르다. 이러한 파장은 입자 직경과 함께 증가한다. 금 나노로드들은 2개의 플라즈몬 밴드들, 길이방향 플라즈몬 밴드, 측방 플라즈몬 밴드를 보이고, 이들 모두는 각각 로드들 주축을 따르는 및 직교하는 전자들의 집합적 진동에 해당된다. 길이방향 밴드 파장은 AR (종횡비)에 대하여 약 500 (AR=1) 내지 1500 nm (AR=7)이고 측방 밴드 파장은 약 510 nm에서의 금 구형 입자들의 플라즈몬 밴드와 유사하다.
금 나노로드들에 은층이 형성되는 과정에서, 제3의 소위 하이브리드 플라즈몬 밴드가 약 380 nm에서 나타난다. 또한, 길이방향 및 측방 플라즈몬 밴드의 파장은 은층 두께 증가에 따라 점차 감소된다. 또한, 3종의 플라즈몬 밴드 강도는 은층 두께에 따라 증가한다. 코어 치수뿐 아니라 은층 두께를 조작하여 다수의 금/은 코어/쉘 입자들을 생성시킬 수 있다. 따라서 예를들면 상이한 색조의 갈색, 적색, 오렌지, 청색 및 녹색을 가지는 광범위한 범위의 면역크로파토그래피 진단용 표지를 획득할 수 있다. 또한, 길이방향 플라즈몬 밴드에 대하여 2.4 x 1010 M-1.cm-1까지의 몰 소광계수를 가지는 극단적으로 강력한 착색력을 가지고 2종의 다른 밴드들의 착색력이 누적되는 표지들을 획득할 수 있다. 면역크로마토그래피 테스트 감도를 높이기 위하여, 바람직하게는 약 30 - 40 nm 이상의 용적을 가지는 이방성 코어및 10 nm의 은쉘이 선택된다. 마지막으로 실리카 쉘 형성으로 인하여 입자들 표면에서의 굴절률 변화로 인한 플라즈몬 밴드 파장이 증가한다. 그러나, 플라즈몬 밴드 강도는 변하지 않는다.
특히 바람직한 방법에서, 본 발명에 의한 나노입자들 제조방법은 할라이드 상대이온을 가지는 계면활성제를 대체하기 위하여 무-할라이드 계면활성제 첨가, 및 할라이드 상대 이온을 가지는 계면활성제 제거 단계를 더욱 포함한다.
무-할라이드 계면활성제는 양이온, 음이온 또는 비-이온성 계면활성제일 수 있다.
무-할라이드 양이온 계면활성제는 예를들면 세트리모늄 질산염, 수산화세트리모늄, 헥사데실디메틸벤질암모늄 질산염, 세트리모늄 황산염, 헥사데실디메틸벤질벤질암모늄 황산염, 세트리모늄 인산염, 헥사데실디메틸벤질암모늄 인산염으로 이루어진 군에서 선택된다.
무-할라이드 비-이온성 계면활성제는 예를들면 Triton® X100, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, N노나노일N메틸글루카민, Nonidet® P40, 노닐 β-D-글루코피라노시드, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르로 이루어진 군에서 선택된다.
무-할라이드 음이온 계면활성제는 예를들면 도데실 황산나트륨이다.
기타 적합한 무-할라이드 계면활성제가 적용된다는 것은 명백하다.
바람직하게는, 양이온 계면활성제가 사용된다.
무-할라이드 계면활성제 농도는 바람직하게는 1 mM 내지 0.1 M이다.
본 방법은 특히 일반적으로 사용되는 전구체들을 첨가하지 않고 (실란, 스트르산염, PVP, 고분자전해질, 효소 또는 젤라틴) 중간 은쉘을 가지는 나노입자들을 균질 실리카층으로 선택적으로 도포할 수 있는 가능성을 부여한다. 실제로, 이러한 비-할로겐화, 바람직하게는 양이온, 계면활성제는, 양호한 콜로이드 안정성, 은층 산화에 대한 양호한 안정성을 제공하고 균질 및 선택적 실리카 층 형성을 충분히 가능하게 한다 (vitrophilic).
본 발명에서, 중간 금속 쉘 형성에 사용되는 할라이드 상대 이온을 가지는 계면활성제은 원심분리, 초미세여과, 추출, 투석 또는 냉각 침전에 의해 무-할라이드 계면활성제로 치환된다. 할라이드 상대 이온을 가지는 계면활성제를 무-할라이드 계면활성제로 대체함으로써, 중간층 더욱 상세하게는 은층의 산화를 방지할 수 있다. 또한, 본 단계는 과잉 시약 예컨대 은층 형성 과정에서 도입되는 아스코르브산, 은 염을 제거할 수 있는 가능성을 부여한다. 이에 따라 정제되는 코어/쉘 나노로드들은 임의의 경시적 광학 특성 변화없이 여러 개월 동안 유지될 수 있다. 무-할라이드 계면활성제로 안정화되는 코어/쉘 나노로드들은 단일 단계에서 선택적으로 균질 실리카층으로 도포된다.
따라서, 본 발명에 의하면 바람직한 나노입자 제조방법은 다음 단계들로 구성된다:
- 할라이드 상대이온을 가지는 계면활성제 존재에서 바람직하게는 금/은, 중간 코어/쉘 나노입자들 제조단계;
- 상기 방법에 따라 얻어진 나노입자들을 무-할라이드 계면활성제로 정제 및 안정화 단계,
- 예를들면 소다 또는 암모니아 용액을 이용하여 용액 pH를 9 내지 12로 조정하는 단계. 기타 염기들이 사용될 수 있다.
- 용액을 알코올성 테트라에틸 오르토실리케이트 용액 또는 직접 테트라에틸 오르토실리케이트와 혼합하여 실리카로 도포된 입자를 획득하는 단계. 기타 알콕시실란이 사용될 수 있다.
실리카층은 3가지 이점들을 제공한다. (i) 예를들면 복합체들 제조 및 면역크로마토그래피 테스트 제조 과정에서 사용되는 다양한 완충용액에 함유되는 할라이드로부터 중간 은층을 보호하여 안정화시킬 수 있다. (ii) 실리카층은 상기 나노입자들 표면에서 유전상수를 일정하게 유지하고 상기 나노입자들이 너무 근접할 때 표면 플라즈몬 커플링을 방지함으로써 얻어진 나노입자들의 착색화를 안정화시킨다. 플라즈몬 밴드들의 커플링은 2종의 나노입자들 간의 거리가 약 20 nm보다 크면 0이다. 따라서, 10 nm의 실리카층은 충분하다. (iii) 마지막으로, 실리카층의 실라놀 그룹은, 상기된 바와 같이, 많은 유기실란의 그라프트를 가능하게 하여 특히 생체 분자들, 더욱 상세하게는 항체들의 복합화에 적합한 광범위한 표면 화학을 제공한다. 이러한 유기실란은 강력하게 실리카층에 결합되지만 본 분야에 사용되는 금 콜로이드 표면에 흡착된 계면활성제는 매우 쉽게 다양한 입자들 간에 교환된다. 이러한 이유로, 본 발명에 따라 유기실란 혼합물로 기능화 및 안정화되는 코어/쉘 및 코어/쉘/쉘 나노입자들은, 다중화 면역크로마토그래피 테스트에 특히 적합하다. 실제로, 상이한 나노입자들-항체 복합체들 간의 항체들 교환 위험성은 본 발명에 의해 유기실란 혼합물로 관능화 및 안정화 되는 코어/쉘 및 코어/쉘/쉘 나노입자들에서 더욱 낮아진다.
코어/쉘 또는 코어/쉘/쉘 나노입자들의 외부 실리카층은 다양한 유기실란 예컨대 예를들면 3아미노프로필 트리에톡시실란 (APTES) 또는 카르복시에틸실란트리올 (CEST)의 그라프트 가능성을 제공한다. 이들 작용기로 인하여 이러한 나노 소재가 항체들과의 복합화가 가능하고 따라서 면역크로파토그래피 진단에서 표지로 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 관능성으로 안정성 문제들이 제기된다. 예를들면, 너무 높은 카르복실산기들 밀도로 인하여 산성 pH에서 입자들의 응집이 초래된다. 이러한 현상은 카르복실산의 프로톤 부가 과정에서 표면에서의 음전하들 상실 및 입자들이 가지는 산들 간에 형성되는 수소 결합으로 인한 것이다. 또한, 너무 강한 카르복실산 밀도는 항체 복합화 반응 과정에서 문제를 일으킨다. 예를들면, 1에틸3[3디메틸아미노프로필]카르보디미드 (EDC) 및 N히드록시숙신이미드 (NHS)를 이용하여 펩티드 유형 (아미드)의 결합을 형성할 때, 중간 활성화 산들이 형성되면 표면 전하들을 상당히 중화시키고 입자들 응집을 초래한다. 또한 응집 문제는 APTMS을 이용한 관능화 과정에서도 관찰된다. 실리카 표면 및 APTMS의 아민기들은 각각 음전하 및 양전하를 가진다. APTMS의 그라프트 과정에서, 전하들이 중화되고 입자들 안정화를 위한 제타전위는 너무 낮아져 결과적으로 응집된다.
본 발명에 의해 제공되는 해결책은, 상기된 바와 같이 유기실란 및 화학적 불활성 유기실란의 관능성 혼합물을 사용하는 것이고, 이에 따라 그라프트, 보관 또는 나노입자들의 항체와의 복합화 과정에서 응집 문제를 피할 수 있다.
관능성 유기실란 예컨대 예를들면 APTMS 또는 CEST는 항체들 부착을 가능하게 하면서도 화학적 불활성 유기실란은 강한 음의 제타전위를 보유하거나 입체장애에 의해 나노입자들 또는 복합체들의 응집을 방지한다.
상기 본 발명에 의한 코어/쉘 나노입자들은 면역크로마토그래피 테스트 장치에서 생체분자 마커로 사용된다.
또한 본 발명은, 특히 중간 생성물로서, 코어/쉘 나노입자에 관한 것이고, 이는 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 코어, 및 제1 소재와는 다르고, 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제2 소재로 이루어진 금속 쉘로 구성되며, 상기 금속 쉘은 무-할라이드 계면활성제에 의해 안정화된다.
이러한 나노입자는 중간 쉘을 가지는 상기 나노입자 제조에 사용된다. 계면활성제는 양이온, 음이온 또는 비-이온성이고 상기된 무-할라이드 계면활성제에 해당된다. 바람직하게는, 이러한 무-할라이드 계면활성제는 세트리모늄 질산염, 수산화세트리모늄, 헥사데실디메틸벤질암모늄 질산염, 세트리모늄 황산염, 헥사데실디메틸벤질암모늄 황산염, 세트리모늄 인산염, 헥사데실디메틸벤질암모늄 인산염, Triton® X-100, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, N-노나노일-N-메틸글루카민, Nonidet® P40, 노닐 β-D-글루코피라노시드, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 및 도데실황산나트륨으로 이루어진 군에서 선택된다.
상기 코어 형성 나노입자는 상기된 것과 동일한 특성에 따라 구형 또는 원통형에서 선택되는 형상을 가진다.
바람직하게는, 코어는 금 나노입자이고, 바람직하게는 이방성이다. 바람직하게는, 금속 쉘은 은으로 이루어진다. 바람직하게는, 중간 생성물로서, 나노입자는 금/은 코어/쉘 나노입자이다.
또한 본 발명은 중간 생성물로서 나노입자들, 예컨대 상기된 나노입자들의 안정한 현탁물 제조방법에 관한 것이고, 상기 방법은:
- 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 코어, 및 제1 소재와는 다르고, 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제2 소재로 이루어진 금속 쉘로 구성되고, 할라이드 상대 이온을 가지는 계면활성제 존재에서 제2 소재의 층을 제1 소재의 나노입자들 주위로 형성시키는 코어/쉘 나노입자들 제조단계,
- 할라이드 상대이온을 가지는 계면활성제를 교체하기 위하여 무-할라이드 계면활성제를 첨가하는 단계, 및
- 할라이드 상대이온을 가지는 상기 계면활성제를 제거하는 단계로 구성된다.
무-할라이드 계면활성제는 바람직하게는 세트리모늄 질산염, 수산화세트리모늄, 헥사데실디메틸벤질암모늄 질산염, 세트리모늄 황산염, 헥사데실디메틸벤질암모늄 황산염, 세트리모늄 인산염, 헥사데실디메틸벤질암모늄 인산염, Triton® X-100, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, N-노나노일-N-메틸글루카민, Nonidet® P40, 노닐 β-D-글루코피라노시드, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 및 도데실황산나트륨, 또는 임의의 기타 적합한 무-할라이드 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된다.
상이한 시약들의 특징은 상기되었다.
상기된 바와 같이, 이에 따라 획득되는 코어/쉘 나노입자들은 정제되고 수개월 동안 임의의 경시적 광학 특성 변화없이 유지된다.
또한 본 발명은 적어도 하나의 분석물 검출을 위한 면역크로마토그래피 테스트 장치에 관한 것이고, 이는 분석물에 특이적인 인식 또는 결합제를 포함하고, 상기 인식 또는 결합제는 나노입자들 복합체에 표지되고, 상기 나노입자들은 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 적어도 하나의 코어, 및 작용기들을 포함하는 실리카 쉘로 구성된다.
이러한 나노입자들은 면역크로파토그래피 진단 표지로 사용된다.
본원에서 사용되는, <표지>란 착색 소재에 관한 것으로 면역크로파토그래피 스트립 테스트 라인(들)에서 착체(들) 고정화에 이어 검출 대상 분자(들) 검출을 가능하게 한다. 검출은 가시적이거나 특정 검출 장치를 이용할 수 있다.
특히 바람직한 방식에서, 실리카는, 표면에, 상기 나노입자를 안정화시키기 위하여 공유 결합되는 안정화제를 더욱 포함한다.
안정화제는 나노입자들이 결합제와 커플링 또는 복합화 반응 과정에서 화학적으로 불활성인 것이 선택된다.
실리카 개질 작용기들은 분석물에 특이적인 결합제와 상호 작용할 수 있다.
바람직하게는, 작용기들 및 안정화제들은 실리카에 그라프트 될 수 있는 유기실란에서 유도된다.
나노입자들의 코어 일부를 형성하는 나노입자는 구형 또는 원통형에서 선택되는 형상을 가진다.
바람직하게는, 나노입자들의 코어는 금 나노입자이다.
바람직한 실시태양에 의하면, 나노입자들은 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제2 소재로 이루어진 중간 금속 쉘을 더욱 포함하고, 상기 제2 소재는 나노입자들 코어를 이루는 제1 소재와는 상이하다.
바람직하게는, 중간 쉘은 은으로 이루어진다.
바람직하게는, 금/은/실리카 코어/쉘/쉘 나노입자들이 사용된다.
상이한 성분들 및 나노입자들 제조 방법들의 상세한 특성들은 상기되었다.
바람직하게는, 분석물 검출 대상은 항원이고 결합제는 항원 특이적 항체이다.
본 발명에 의한 기능성 코어/쉘 또는 코어/쉘/쉘 나노입자들 뿐 아니라 관능화 및 안정화 코어/쉘 또는 코어/쉘/쉘 나노입자들은 화학적 또는 물리적 방식으로 분석물 특이적 인식제와 조합된다. 이에 따라 제조되는 복합체는 면역크로마토그래피 테스트에서 표적 분석물의 정성적 또는 정량적 검출에 사용된다.
특이적 결합제는 예를들면 검출 대상 상보적 항원에 특이적인 분자 인식 부위(들) (파라토프들)을 가지는 단일클론 또는 다중클론 항체들이다. 면역크로마토그래피 테스트에 사용될 수 있는 특이적 인식을 보이는 분자 쌍들의 기타 예시들은 햅텐/항원, 리간드/수용체, 기질/효소, 효소 억제제, 탄수화물/렉틴, 비오틴/아비딘 (비오틴/스트렙타비딘), 바이러스/세포 수용체 쌍들이다.
복합화는 표지 (나노입자) 및 특이적 결합제 간의 커플링 반응에 상당한다. 복합화 방법들은 다양하다. 수 많은 서적 및 문헌들이 당업자들에게 알려진 이러한 복합화 반응들을 기술하고 있다. 가장 널리 알려진 방법은 표지 및 특이적 결합제 표면에서 가능한 카르복실산 및 아민 작용기들 간의 아미드 형성이다.
본 발명에서 기술되는 복합체는 면역크로마토그래피 테스트 제조에 통합된다. 이러한 테스트 제조 방법들은 예를들면 특허출원 WO 2008/030546에 상세하게 기재된다.
실시예들
실시예 1 (본 발명)
CTAN에 현탁되는 금/은 코어/쉘 나노입자들
AR 4.2의 금 나노로드들을 Nikoobakht (상기 인용)에 공개된 방법으로 제조하였다. 500 mL CTAB 수용액(0.2M), 30 mL 질산은 수용액 (), 500 ml 사클로로금(III)산 수용액 () 및 5.39 mL 아스코르브산 수용액 ()을 27°C에서 혼합하여(자석 교반) 성장 용액을 제조하였다. 5 mL 물, 5 mL 사클로로금(III)산 수용액 (), 10 mL CTAB 수용액 (0.2M) 및 0.6 mL 수소화붕소나트륨 냉 수용액 ()을27°C에서 혼합하여 구형 금 나노입자들 (시드)을 제조하였다. 수소화붕소를 첨가하고 수 분 후, 1.6 mL 갈색 시드 용액을 성장 용액에 첨가하였다. 3시간 동안 용액을 자석으로 교반하였다. 용액은 서서히 갈색으로 변색되었다. 과잉 시약을 원심분리하여 제거하고 금 로드들을 1L 초-순수에 재분산하였다.
1 L 금 로드들 용액, 2 mL 질산은 수용액 (), 8 mL 아스코르브산 수용액 () 및 175 mL 소다 용액 ()을 혼합하여 Au/Ag 코어/쉘 나노로드들을 제조하였다. 용액은 점차 녹색으로 변색되고 이는 금 로드들 주위에 은쉘 형성을 의미한다. CTAN을 용액에 녹였다. 과잉 시약을 원심분리하여 제거하고 Au/Ag 코어/쉘 로드들을 1 L 초-순수에 재분산하였다. 원심분리 전에 CTAN이 첨가되지 않으면 Au/Ag 코어/쉘 나노로드들은 비가역적으로 응집된다.
실시예 2 (비교)
CTAB에 현탁되는 금/은 코어/쉘 나노로드들.
AR 4.2의 금 나노로드들을 실시예 1에 기재된 방법으로 제조하였다. 또한, Au/Ag 코어/쉘 나노로드들을 실시예 1에 기재된 방법으로 제조하였다. 그러나, 과잉 시약을 원심분리하여 제거하기 전에 CTAN 대신 CTAB를 용액에 용해시키고 Au/Ag 코어/쉘 로드들을 1 L 초-순수에 재분산하였다.
실시예들 1 (본 발명) 및 2 (비교)의 대비
할라이드 유무의 계면활성제에 현탁되는 입자들에서 은 쉘들의 안정성을 비교하였다.
CTAN 함유 및 할라이드 유무의 용액에 현탁되는 금/은 코어/쉘 나노로드들의 안정성을 비교할 목적으로, CTAN 함유 용액에 2주 동안 현탁된 금/은 코어/쉘 나노로드들 (곡선 A), CTAN 및 0.1 M NaBr 함유 용액에서 12시간 현탁된 금/은 코어/쉘 나노로드들 (곡선 B) 및 금/은 코어/쉘 나노로드들 제조용 시드로서 사용되고 CTAB에 현탁되는 금 나노로드들 (곡선 C)에 대한 UV-가시광선 스펙트럼을 측정하였다. 도 1의 UV-가시광선 스펙트럼은 브롬 이온들 함유 용액에 분산된 코어/쉘 나노로드들의 UV-가시광선 스펙트럼 (곡선 B)은 시드 스펙트럼 (금 나노로드들) (곡선 C)과 거의 동일하다는 것을 보인다. 또한 시드 및 코어/쉘 로드들 용액은 동일한 갈색을 가진다. 이러한 관찰을 통해 은층은 할라이드 존재에서 신속하게 산화된다는 것이 입증된다. 한편, 브롬 이온들 부재의 금/은 코어/쉘 나노로드들은 녹색 및 실시예 1에서 제조되는 코어/쉘 나노로드들의 특성 스펙트럼을 유지한다. 스펙트럼은 CTAN이 은 입자들 또는 은 쉘을 가지는 입자들 보존에 적합하다는 것을 보인다.
실시예 3
CTAN 용액 (임의의 할라이드 부재)에 보관된 금/은 코어/쉘 나노로드들에 실리카 쉘 형성.
실시예 1에 따라 제조된 Au/Ag 코어/쉘 나노로드들 용액의 pH를 소다 용액 ()으로 10.5으로 조정하였다. 메탄올 중 20부피%의 TEOS 용액 40 mL의 3분획들을 30분 간격으로 적가하였다. 용액은 서서히 약간 변색되었다. 과잉 시약을 원심분리하여 제거하고 Au/Ag/실리카 코어/쉘/쉘 나노로드들을 에탄올에 재분산하였다.
실시예 4 (비교)
CTAB 용액 (할라이드 존재)에 보관된 금/은 코어/쉘 나노로드들에 실리카 쉘 형성.
실시예 3에 기재된 방법으로 Au/Ag/실리카 코어/쉘/쉘 나노로드들을 제조하되, 사용되는 시드는 실시예 1에 따라 제조된 것이 아니라 (CTAN 중 현탁물) 비교예 2에 따라 제조된 Au/Ag 코어/쉘 나노로드들 (CTAB 중 현탁물)이다. 본 비교예에서, pH 10.5로 조정된 후 은 또는 산화은 입자들이 형성되므로 pH는 매우 빨리 감소된다는 것에 주목하여야 한다.
실시예 5
금 나노로드들에 실리카 쉘 형성.
Au/실리카 코어/쉘 나노로드들을 실시예 3에 기재된 방법으로 제조하되, 사용되는 시드는 실시예 1에 따라 제조되는 Au 나노로드들이다. 본 실시예에서 pH는 조정 과정에서 안정하게 유지된다.
실시예들 3, 4 및 5의 대비
할라이드 유무의 계면활성제에서 실리카 쉘 형성 과정에서 은쉘의 안정성.
CTAN 또는 CTAB에 현탁된 Au/Ag 코어/쉘 나노로드들에 실리카 쉘을 형성하는 과정에서 획득되는 생성물들, 실시예 3 및 비교예 4의 샘플들을 비교할 목적으로, 투과전자현미경으로 샘플들을 관찰하였다.
관찰 그리드 (grid)를 제작하기 위하여, 용액 한 방울을 그리드에 떨어뜨리고 건조시켰다. 도 2의 사진은 CTAB 중 브롬 존재에서 염기성 pH에서 은 또는 산화은 나노입자들이 형성되지만 (도 2c) 금/은 코어/쉘 나노로드들이 어떠한 할라이드를 가지지 않는 CTAN 계면활성제에 현탁될 때에는 이러한 유형의 입자가 보이지 않는다 (도 2a 및 2b)는 것을 명백히 나타낸다. 실시예 5에서 pH 10.5로 조정하는 과정에서 pH 안정성은 실제로 할라이드를 가지는 계면활성제는 은층에 실리카 쉘을 형성하는 것에는 부적합하다는 것을 확인한다.
실시예 6 (발명)
카르복실산을 가지고 메틸포스포네이트로 안정화된 기능성 금/실리카 코어/쉘 나노로드들 제조.
실시예 5에 기재된 방법으로 제조되는 금/실리카 코어/쉘 나노로드들을 본 발명 방법에 따라 3(트리히드록시실릴)프로필 메틸포스포네이트 (수중 42% THPMP 염, Gelest) 및 카르복시에틸실란트리올 (CEST)의 혼합물로 관능화 및 안정화시켰다. 54.2 mL 금/실리카 코어/쉘 나노로드들을 자석 막대 및 응축기가 구비된 500 mL 플라스크에서248 mL 스트르산염 완충용액 (, pH 3)에 첨가하였다. 교반하면서, 17.72 mL THPMP 및 0.246 mL CEST를 첨가한 후 용액을 12시간 동안 환류시켰다. 과잉 시약을 원심분리하여 제거하였다.
실시예 7
카르복실산으로 관능화 되는 금/실리카 코어/쉘 나노로드들 제조.
실시예 5에 의해 제조되는 금/실리카 코어/쉘 나노로드들을 카르복시에틸실란트리올 (CEST, 25% 염 수용액, Gelest)으로 관능화시켰다. 52.2 mL 금/실리카 코어/쉘 나노로드들을 자석 막대가 구비된 300 mL 비이커에서 141.8 mL 초-순수에 첨가하였다. 교반하면서, 11.85 mL CEST를 다시 첨가하고 용액을 12시간 교반하였다. 과잉 시약을 원심분리하여 제거하였다.
실시예들 6 및 7의 대비
카르복실산 또는 카르복실산 및 메틸포스포네이트의 혼합물로 관능화 되는 금/실리카 코어/쉘 나노입자들 간의 콜로이드 안정성 차이.
카르복실산으로 기능화되고 다른 한편으로 카르복실산 및 메틸포스포네이트의 혼합물로 관능화 및 안정화 되는 입자들의 콜로이드 안정성을 비교할 목적으로 카르복실산으로 (실시예 7) 또는 카르복실산 및 메틸포스포네이트의 혼합물로 (실시예 6) 기능화된 금/실리카 코어/쉘 나노로드들의 제타전위를 측정하였다 (도 3). 삼각형 점들은 카르복실산 및 메틸포스포네이트의 혼합물로 기능화된 나노입자들의 제타전위이고 사각형 점들은 카르복실산로 기능화되고 안정화되지 않은 나노입자들의 제타전위를 나타낸다.
카르복실산 및 금속 포스포네이트의 혼합물로 기능화되는 나노입자들의 제타전위가 측정된 pH 범위에서 더욱 음의 값을 가진다. 이러한 측정 결과는 본 발명에 따라 금속 포스포네이트를 첨가하면 금/실리카 코어/쉘 나노로드들의 콜로이드 안정성이 개선된다는 것을 보인다.
실시예 8
염소 항-토끼 IgG/Au-실리카 코어/쉘 복합체 제조
초-순수 중 1% 용액으로서 1 mL 카르복실화 금/실리카 코어/쉘 나노로드들 (실시예 7)을 MES 완충액 (pH 6.1, , Sigma)에서 1 mL EDC (Sigma) 에서 혼합하였다. 4 mg 염소 항-토끼 IgG를 첨가하였다. 용액을 1시간 동안 교반하였다. 현탁물을 원심분리하여 반응을 중지시켰다. 복합체를 초-순수에서 재현탁하였다.
실시예 9
양성 신호를 관찰하기 위하여 테스트 라인에 고정된 최소량의 나노입자들.
본 발명에서 사용되는 표지들의 강력한 착색력을 입증할 목적으로, 실시예 8에 의한 금/실리카 염소 항-토끼 IgG 코어/쉘 나노로드 복합체들 및 금/염소 항- 토끼 IgG (British Biocell International) 콜로이드를 비교하였다. 면역크로마토그래피 테스트의 테스트 라인에 고정되고 시각적 검출이 가능한 최소량의 복합체들을 결정하였다. 감소된 복합체들을 적층시키고 포획 라인 (capture line) (토끼 IgG)을 가지는 테스트 스트립에 용출시켰다.
8 μm 공극들을 가지고 강성 플라스틱에 의해 지지되는 니트로셀룰로오스 막을 폭 10 mm, 길이 80 mm의 스트립 내로 잘라 넣었다. 초-순수 중5 μL의 1mg/mL IgG 토끼 용액을 마이크로피펫으로 각각의 테스트 스트립 상부 모서리로부터 3cm 이격되게 떨어뜨렸다. 2시간 동안 포획 라인들을 건조시키고 0.1% Tween® 20 용액 및 1% 폴리비닐피롤리돈 (PVP)에 담지하여 고정시킨 후 다시 2시간 동안 건조시켰다. 0.1% Tween® 20 및 1% PVP 용액에서 감소 농도로 희석되는5 μL의 염소 항-토끼 IgG 나노입자들 복합체들을 각각의 테스트 스트립의 하부 모서리로부터 3cm 이격된 것에 떨어뜨리고 2시간 동안 건소시켰다. 테스트 스트립들을 대략 0.5 cm의 인산염 완충액을 함유하는 관에 넣었다. 복합체들은 고정화 라인 (토끼 IgG)으로 이동하였고 약 1 분 후에 포획되었다.
이러한 테스트는 약 2천만 금/실리카 코어/쉘 입자들 및 항체 복합체 고정화는 시각적으로 검출될 수 있지만 (실시예 8) 40 nm 콜로이드는 3천만 이하의 구형 금 나노입자들이 고정화되면 시각적이지 않다는 것을 보였다. 이러한 테스트는 금속-코어/실리카-쉘 나노입자들 착색력이 면역크로마토그래피 테스트에 일반적으로 사용되는 금 콜로이드 착색력보다 약 1.5 이상이라는 것을 입증하는 것이다.
더욱이, 본 실시예에서 사용되는 금/실리카 코어/쉘 나노로드들의 길이방향 플라즈몬 밴드는 대부분 근적외선에서 국한되고 따라서 사람 눈에 보이지 않는다는 것에 주목하여야 한다. 따라서, 가시광선 스펙트럼에 전적으로 국한되고 또한 더 높은 몰 소광계수를 보이는 측방 플라즈몬 밴드를 가지는 금/은/실리카 코어/쉘/쉘 로드들 (실시예 3)은 예를들면 본 실시예에 사용되는 코어/쉘 나노로드들로 비교하여 가시적 검출에 더욱 적합하다.
본 테스트는 금속-코어/실리카-쉘 나노입자들를 사용하면 면역크로마토그래피 테스트 감도를 증가시킬 수 있고 더욱이, 다른 인자들 예컨대 예를들면 복합화 수준, 복합체-항원 착체화 운동학, 복합체들 및 복합체-항원 착체의 이동 및 복합체-항원 착체의 고정화 또한 최적화된다는 것을 보인다.

Claims (31)

  1. 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 적어도 하나의 코어, 및 작용기들을 포함하는 실리카 쉘로 구성되는 코어/쉘 나노입자에 있어서, 실리카는 표면에, 상기 나노입자를 안정화시키기 위하여 공유 결합되는 안정화제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 코어/쉘 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 안정화제는 나노입자와 생체분자의 커플링 반응에 화학적 불활성인 것에서 선택되는, 나노입자.
  3. 선행 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 실리카를 개질하는 작용기들은 생체분자와 상호 작용할 수 있는, 나노입자.
  4. 선행 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 작용기들 및 안정화제는 실리카에 그라프트 (grafted) 가능한 유기실란에서 유도되는, 나노입자.
  5. 선행 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 코어는 금 나노입자인, 나노입자.
  6. 선행 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 코어 형성 나노입자의 형상은 구형 또는 원통형에서 선택되는, 나노입자.
  7. 선행 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 소재와는 다르고, 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제2 소재로 이루어진 중간 금속 쉘을 포함하는, 나노입자.
  8. 제7항에 있어서, 중간 쉘은 은으로 이루어지는, 나노입자.
  9. 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 코어, 및 제1 소재와는 다르고, 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제2 소재로 이루어진 금속 쉘로 구성되는 코어/쉘 나노입자에 있어서, 금속 쉘은 임의의 할라이드가 없는 계면활성제로 안정화되는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  10. 제9항에 있어서, 무-할라이드 계면활성제는 세트리모늄 질산염, 수산화세트리모늄, 헥사데실디메틸벤질암모늄 질산염, 세트리모늄 황산염, 헥사데실디메틸벤질벤질암모늄 황산염, 세트리모늄 인산염, 헥사데실디메틸벤질암모늄 인산염, Triton® X100, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, N-노나노일-N-메틸글루카민, Nonidet® P40, 노닐 β-D-글루코피라노시드, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 및 도데실황산나트륨으로 이루어진 군에서 선택되는, 나노입자.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 코어는 금 나노입자인, 나노입자.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 코어 형성 나노입자의 형상은 구형 또는 원통형에서 선택되는, 나노입자.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 금속 쉘은 은으로 이루어지는, 나노입자.
  14. 분석물에 특이적으로 결합하는 결합제를 포함하고, 상기 결합제는 나노입자들에 표지되는 적어도 하나의 분석물을 검출하는 면역크로마토그래피 테스트 장치에 있어서, 나노입자들은 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 적어도 하나의 코어, 및 작용기들을 포함하는 실리카 쉘로 구성되는 것을 것을 특징으로 하는, 면역크로마토그래피 테스트 장치.
  15. 제14항에 있어서, 실리카는 표면에, 상기 나노입자를 안정화시키기 위하여 공유 결합되는 안정화제을 포함하는 것을 특징으로 하는, 장치.
  16. 제15항에 있어서, 안정화제는 나노입자와 결합제의 커플링 반응에 화학적 불활성인 것에서 선택되는, 장치.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 실리카를 개질하는 작용기들은 결합제와 상호 작용할 수 있는, 장치.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 작용기들 및 안정화제는 실리카에 그라프트 (grafted) 가능한 유기실란에서 유도되는, 장치.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 코어는 금 나노입자인, 장치.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 코어 형성 나노입자의 형상은 구형 또는 원통형에서 선택되는, 장치.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 소재와는 다르고, 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제2 소재로 이루어진 중간 금속 쉘을 포함하는, 장치.
  22. 선행 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 중간 쉘은 은으로 이루어지는, 장치.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 검출 대상 분석물은 항원이고 결합제는 항원에 대한 특이적 항체인, 장치.
  24. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 의한 코어/쉘 나노입자들 제조방법에 있어서,
    - 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제1 소재로 이루어지는 나노입자들 제조단계,
    - 상기 나노입자들에 실리카 쉘 형성단계,
    - 실리카에 작용기들 그라프트 (graft) 단계, 및
    - 실리카 표면에 상기 나노입자들를 안정화시키는 안정화제 그라프트 단계로 구성되는, 코어/쉘 나노입자들 제조방법.
  25. 제24항에 있어서, 실리카에 작용기들 및 안정화제 그라프트 단계는 상기 작용기들을 가지는 유기실란 및 상기 안정화제를 가지는 유기실란의 축합 반응으로 수행되는, 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 실리카 쉘 형성 단계 전에, 할라이드 상대이온을 가지는 계면활성제 존재에서 제1 소재와는 다르고, 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제2 소재로 이루어진 중간 금속 쉘 형성단계를 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 할라이드 상대이온을 가지는 계면활성제를 대체하기 위하여 무-할라이드 계면활성제를 첨가하는 단계, 및 할라이드 상대이온을 가지는 계면활성제를 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 무-할라이드 계면활성제는 세트리모늄 질산염, 수산화세트리모늄, 헥사데실디메틸벤질암모늄 질산염, 세트리모늄 황산염, 헥사데실디메틸벤질벤질암모늄 황산염, 세트리모늄 인산염, 헥사데실디메틸벤질암모늄 인산염, Triton® X100, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, N-노나노일-N-메틸글루카민, Nonidet® P40, 노닐 β-D-글루코피라노시드, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 및 도데실황산나트륨으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
  29. 제9항 내지 제13항 중 어느 하나에 의한 나노입자들의 안정한 현탁물 제조방법에 있어서,
    - 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 적어도 하나의 제1 금속 소재로 이루어진 코어, 및 제1 소재와는 다르고, 자외선, 가시광선 및 근적외선에서 선택되는 영역에서 플라즈몬 공명을 보이는 적어도 하나의 금속 기재의 제2 소재로 이루어진 금속 쉘로 구성되고, 할라이드 상대이온을 가지는 계면활성제 존재에서 제1 소재의 나노입자들 주위로 제2 소재의 층을 형성시켜 코어/쉘 나노입자들을 제조하는 단계,
    - 할라이드 상대이온을 가지는 계면활성제를 교체하기 위하여 무-할라이드 계면활성제를 첨가하는 단계, 및
    - 할라이드 상대이온을 가지는 상기 계면활성제를 제거하는 단계로 구성되는, 나노입자들의 안정한 현탁물 제조방법.
  30. 제29항에 있어서, 무-할라이드 계면활성제는 세트리모늄 질산염, 수산화세트리모늄, 헥사데실디메틸벤질암모늄 질산염, 세트리모늄 황산염, 헥사데실디메틸벤질벤질암모늄 황산염, 세트리모늄 인산염, 헥사데실디메틸벤질암모늄 인산염, Triton® X100, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, N-노나노일-N-메틸글루카민, Nonidet® P40, 노닐 β-D-글루코피라노시드, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 및 도데실황산나트륨으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  31. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 의한 코어/쉘 나노입자들의 면역크로마토그래피 테스트 장치에서 생체분자 마커로서의 용도.
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